一种新琼二糖水解酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种新琼二糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ?IDNO:1；本发明的新琼二糖水解酶能够降解新琼二糖产生L-3，6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖，因此可以用于纯的L-3，6-内醚半乳糖的制备。新琼二糖水解酶作为一种的可以生产L-AHG的生物催化剂，因其反应环境友好，催化活性高，对比化学方法有着一定优势，其具有良好的应用潜力和前景。L-AHG作为内醚糖的一种，有很好的美白和抗炎活性，在医药和化妆品方面有很好的潜在应用价值。本发明的大肠杆菌重组株，pETNA/BL21所表达的重组琼胶酶占总蛋白的28%，表达水平高，易于纯化，且连续传代后表达量未有所降低。所以可以通过本发明大量制备重组新琼二糖水解酶和L-3，6-内醚半乳糖。
【专利说明】一种新琼二糖水解酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于功能基因筛选【技术领域】，具体涉及一种新琼二糖水解酶及应用。
技术背景
[0002]新琼二糖水解酶是一种降解新琼二糖的水解酶，水解断裂新琼二糖的α -1, 3键，生成L-3，6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖。新琼二糖是某些琼胶酶水解琼胶的水解产物。L-AHG自然存在是作为琼脂糖中L-AHG和半乳糖的更替单元的一个单体，而琼脂糖是红色巨藻的主要组成成分(Rhodophyta)。迄今为止，即使是以试剂的形式，L-AHG没有市售，亦没有化学合成的报道。L-AHG作为内醚糖的一种，有很好的美白和抗炎活性，在医药和化妆品方面有很好的潜在应用价值。新琼二糖水解酶作为一种的可以生产L-AHG的生物催化剂，因其反应环境友好，催化活性高，对比化学方法有着一定优势，其具有良好的应用潜力和iu景。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种新琼二糖水解酶及其应用，从而弥补现有技术的不足。
[0004]本发明的新琼二糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1 ；
[0005]编码上述新琼二糖水解酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2 ；
[0006]本发明还提供一种重组表达载体，用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的新琼二糖水解酶；
[0007]本发明的新琼二糖水解酶用于降解新琼2糖来制备L-3，6_内醚半乳糖。
[0008]本发明的新琼二糖水解酶能够降解新琼二糖产生L-3，6_内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖，因此可以用于纯的L-3，6-内醚半乳糖的制备。新琼二糖水解酶作为一种可以生产L-AHG的生物催化剂，因其反应环境友好，催化活性高，对比化学方法有着较大优势，其具有良好的应用潜力和前景；该方法不仅避免了传统制备方法中强酸的使用带来的环境污染，而且避免了强酸过度降解L-AHG产生5-羟基-甲基糠醛(HMF)等毒副产物，因此，具有重要的开发价值。L-AHG作为内醚糖的一种，有很好的美白和抗炎活性，在医药和化妆品方面有很好的潜在应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1:本发明的新琼二糖水解酶亲和层系后的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为Marker。
[0010]图2:本发明的新琼二糖水解酶水解产物TLC结果，表明新琼二糖被水解为L-3，6-内醚半乳糖和D-半乳糖新琼四糖被水解为L-3，6-内醚半乳糖和琼三糖；其中I为新琼二糖水解产物，2为新琼四糖水解产物。
[0011]图3:本发明的新琼二糖水解酶，pH变化对相对酶活的影响(数据均为最少三次重复取平均值)[0012]图4:本发明的新琼二糖水解酶，温度变化对相对酶活的影响(数据均为最少三次重复取平均值)，代表热稳定性，代表最适温度。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0014]对于本发明中的术语解释如下:
[0015]1、新琼二糖水解酶:糖苷水解酶，以新琼二糖为底物水解，产物为L-3，6_内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖两种单糖。
[0016]2、新琼2糖:两种单糖L-3，6_内醚半乳糖(AHG)和D-半乳糖(D-Gal) α-1，3键连接形成的二糖 。
[0017]3、L-3，6_内醚半乳糖:3，6位羟基脱水形成内醚键的L型半乳糖。
[0018]实施例1新琼二糖水解酶基因的克隆
[0019]用简并引物PCR以及巢式PCR克隆淡黄色噬琼胶菌WH0801(=NRRLB-59247(T)=CGMCC1.10131 (T))中的新琼二糖水解酶基因。具体操作:在2216E海水培养基中培养淡黄色噬琼胶菌WH0801直到对数末期，提取DNA基因组。利用特定简并引物来进行扩增，简并引物的序列如下:5’ -GGYDCSTAYGATGATCGYAGCGTKTTYACC-3’ ； 5’ -GGTRTITTKTTCCGGRCCATCGGTG-3’，以基因组为模板，条件为:94°C 5分钟，然后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分钟3个步骤进行30个循环，进行PCR，得到了产物为新琼二糖水解酶基因的片段，再以片段末端序列设计引物，进行一次三轮的巢式PCR回收其中大小在500Kb-2000Kb的PCR产物片段(利用takara公司染色体步移试剂盒)。其中各步骤中的PCR产物均连接T-A克隆载体后转化DH5a挑去单克隆测序。最后拼接最初的片段和巢式PCR所得基因片段，得到新琼二糖水解酶基因的全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码的新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。用全长序列以全长序列上游引物和下游引物(5’-CCGGAATTCATGACATTTACTAAAAGC-3’ ； 5’ -CGAGCTCTITTTGTAACGCAGATTATATAGATC-3’)从 DNA 中进行扩增，多次测序结果表明全长片段测序确定序列无误。新琼二糖水解酶基因和NCBI中已知表征的基因相比对，和已结晶来源于Saccharophagus Degradans2_40的新琼二糖水解酶基因相似性为74%。说明在序列上此新琼二糖水解酶基因为一个全新的基因。
[0020]实施例2含新琼二糖水解酶基因表达质粒pETNA的构建
[0021]根据新琼二糖水解酶基因的全长序列设计基因的上游引物和下游引物(见实施例
1)，以淡黄色噬琼胶菌WH0801的基因组为模板，利用PCR扩增得到新琼二糖水解酶基因的全长序列。条件为94°C 2分钟，然后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1.5分钟，30个循环最后72°C延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳显示在1.0kb的位置有明显单一条带，将单一条带切胶回收，并用Xhol和BamHl双酶切，将表达载体pET21a也用Xhol和BamHl双酶切，然后PCR产物和酶切载体都利用试剂盒进行DNA纯化。然后按一定摩尔比例进行DNA连接反应。连接结束后，按照标准的氯化钙法热激转化将重组质粒转入DH5 α，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xhol和BamHl双酶切，凝胶电泳条带显示为1.0Kb和5.3Kb两条清晰条带和新琼二糖水解酶基因全长和质粒长度相对应。证明新琼二糖水解酶基因全长序列已经克隆到表达载体中，将此重组质粒命名为PETNA。 [0022]实施例3高效表达新琼二糖水解酶基因NABHwh的工程菌pETNA/BL21的构建
[0023]将表达载体质粒pETna按照标准氯化钙热激转化转入BL21 (DE3)中，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xhol和BamHl双酶切，凝胶电泳条带显示为1.0Kb和5.3Kb两条清晰条带和新琼二糖水解酶基因全长和质粒长度相对应。证明含有新琼二糖水解酶基因的表达载体质粒pETNA已经转入BL21 (DE3)。
[0024]实施例4利用大肠杆菌工程菌pETNA/BL21制备重组新琼二糖水解酶
[0025]挑取大肠杆菌重组株PETNA/BL21单克隆接种在5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，230RPM培养12小时。按1:100转接入IOOml含有氨苄青霉素的液体LB培养基。37°C培养OD值600到0.6，加入IPTG至终浓度为ImM，继续培养8小时。4°C，8000g离心10分钟，细胞重悬于20mM pH=8.0Tirs-盐酸缓冲液，将菌悬液置于冰上，超声破碎15分钟，12000gl5分钟除去不可溶成分,上清过0.22um滤膜,上亲和层析柱fastflow his*6(GE)，然后用冲洗缓冲液lml+lml和洗脱缓冲液0.5ml*4冲洗柱子6次，将得到的溶液分别SDS-PAGE检测，合并含有单一目的条带的洗脱液(图1)。用Lowry法测定蛋白浓度，终浓度约为 0.3mg/ml。
[0026]实施例5测定重组新琼二糖水解酶最适反应条件
[0027]利用高效液相色谱测定新琼二糖水解酶反应液中的新琼二糖含量，反应条件为:测定最适pH时，30度时，在4.0-10.0的pH范围内进行反应。测定最适温度时，pH=6.0时在20-80度反应。体系为0.1%新琼二糖99uL加入IuL酶液，反应10分钟，2分钟沸水浴灭活。以.1%新琼二糖为标样。测定条件为:WatersSugar-Pak I柱子，流动相为50mg/LEDTA钙水溶液，流速为0.5mL/min。结果如图3，图4所示，重组新琼二糖水解酶的相对活性在30度和pH=6时达到峰值，其在70度或在pH=9反应时仍保有大于40%的活性，所以最适反应温度为30度，最适pH值为6.0。以此结果确定重组新琼二糖水解酶的最适反应条件。
[0028]实施例6利用重组新琼二糖水解酶生产L-3，6-内醚半乳糖
[0029]利用重组新琼二糖水解酶生产L-3，6_内醚半乳糖时，将新琼二糖溶于pH=6.0的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(0.05M/ml)，配置成0.1-0.5%的溶液。按重量比0.1-1:100加入实施例4的重组新琼二糖水解酶溶液。混合均匀后在30度为温浴12-48小时。浓缩至小于Iml上硅胶色谱柱，以正丁醇，乙醇，水(3:1:1)为流动相过柱，以薄层层析为检测手段，第一个流出的糖峰为L-3，6-内醚半乳糖。收集，浓缩，得到L-3，6-内醚半乳糖(图2)。本新琼二糖水解酶具有良好的生物催化活性，催化活性和温度稳定性和已知的新琼二糖水解酶相比均有优势，在60°C反应时，还保有一定的生物学活性。此重组酶可将新琼二糖完全水解，经过硅胶层析的L-3，6-内醚半乳糖纯度约为80%，产率为45%。综上此新琼二糖水解酶具有生产L-3，6-内醚半乳糖的工业应用潜力。
【权利要求】
1.一种新琼二糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种编码权利要求1所述的新琼二糖水解酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
3.—种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的新琼二糖水解酶。
4.一种转化体，所述的转化体携带有权利要求3所述的重组表达载体。
5.权利要求1所述的新琼二糖水解酶在降解新琼2糖来制备L-3，6-内醚半乳糖中的应用。
6.权利要求4所述的.转化体在降解新琼2糖来制备L-3，6-内醚半乳糖中的应用。
【文档编号】C12N15/56GK103468661SQ201310464165
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】毛相朝, 刘楠, 杨孟, 魏东芝 申请人:中国海洋大学