一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法，该方法首先在改良查氏培养基中培养产β-胡萝卜素降解酶的葡萄球菌，培养24h，10000r?min-1离心20min取上清得到粗酶液，采用冷冻干燥将粗酶液浓缩，用于纯化。该方法采用蛋白纯化系统（AKTA?purifier100system）和高效制备液相（PHPLC）相结合的方式纯化β-胡萝卜素降解酶，并通过HPLC检测酶纯度，能快速的纯化得到纯度达95%的纯酶。该发明前处理较为简单易行，纯化过程稳定，重复性高，可得到大量纯酶，为其在工业上用于降解β-胡萝卜素产香奠定基础。
【专利说明】—种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品生物【技术领域】，涉及一种化合物的纯化方法，特别涉及一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法。
【背景技术】
[0002]香气是各类食品的重要特征之一，香气的种类、含量是衡量食品质量的重要依据，在很大程度上决定人们对食品的喜好。降异戊二烯化合物广泛存在于果酒、水果及烟草中，是对食品香气品质具有重要影响的化合物。降异戊二烯香气化合物一般含有13个碳原子，这一类香气化合物的典型代表是紫罗兰酮和大马酮，因其具有特殊的香气，在食品、发酵酒、香料、烟草等行业占有重要地位。类胡萝卜素是降异戊二烯香气化合物的前体物，由于其经济实用，已大量用于生产降异戊二烯化合物。类胡萝卜素经过分解(裂解)能够产生降异戊二烯化合物，极大地丰富产品的风味和香气，特别对酿造类食品如果酒的香味贡献极大，可以大大提升果酒的香味和品质，因此，研究类胡萝卜素的生物降解产香有重要的现实意义和巨大的应用前景。
[0003]微生物产香是目前国际上改进香料生产技术和改善发酵食品香气品质的新型研究领域，但目前的研究水平大多还停留在产香微生物筛选及产香特征的研究，关于类胡萝卜素降解酶的研究报道也大多来自植物源降解酶，而且集中在异源表达酶的纯化和粗酶的
简单纯化(通过等电点)，关于微生物酶的研究极少，而关于纯化类胡萝卜素降解酶的方法也很少。利用微生物酶进行生产可有效简化生产工艺，降低生产成本；类胡萝卜素降解酶更容易作为食品调香助剂在食品生产中得到广泛应用。但广泛应用微生物酶的前提是能得到廉价且具有一定数量的酶。现有研究表明，大多数具有类胡萝卜素降解能力的微生物产生降解酶的能力较差，酶的产量十分低，从微生物培养物中分离纯化一定数量且能用于生产的酶难度极大，成本极高。`
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，提供一种β_胡萝卜素降解酶的纯化方法，该方法对样品的前处理简单，操作方便，可重复性高，能得到纯度达95%的纯酶。
[0005]为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案:
[0006]一种β_胡萝卜素降解酶的纯化方法，其特征在于，该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β_胡萝卜素降解酶进行纯化，利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力，具体按下列步骤操作:
[0007]I)在改良查氏培养基(液体查氏培养基中添加0.3%的酵母浸粉)中培养葡萄球菌，培养条件为:37°C，恒温培养24h ；
[0008]2)培养结束后，将发酵液于1000Or mirT1冷冻离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22 μ m有机系滤膜，得上样:
[0009]3)纯化:[0010]纯化分三步:
[0011]第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件:强阴离子柱MONO Q10/100GL，选择合适的缓冲液进行线性洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β_胡萝卜素能力的活性成分；
[0012]第二步，将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离，纯化条件:半制备色谱柱C18，选择合适柱温，以及合适流动相进行梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解β -胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩；
[0013]第三步，上样于蛋白纯化系统，条件:多肽分子筛Superdex peptide10/300COlumn，选择合适的缓冲液洗脱，选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽 分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测；
[0014]采用分析液相检测纯度的条件:色谱柱C18，选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测；
[0015]将底物β_胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线，用以计算β_胡萝卜素降解酶的酶活和比活力。
[0016]上述改良查氏培养基是在查氏培养基加入质量浓度为0.3%酵母浸粉，以适应巴氏葡萄球菌的生长。
[0017]上述离子交换中的缓冲液为:
[0018]A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(ρΗ5.0), B液:20mM醋酸钠缓冲液中加Imol 1-1氯化钠；
[0019]所述线性洗脱为:上样量为2ml ;流速lml/min ;洗脱程序为:
[0020]0-30min, A 液洗脱；30_70min，0-50%B 液线性洗脱；70_80min，50%B 液洗脱；80-110min, 100%B 液洗脱；检测波长为 280nm，254nm 和 215nm。
[0021]上述制备液相的流动相为:A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0), B液:乙腈；所述梯度洗脱为:上样量5ml ;流速5ml mirT1 ;洗脱程序为:初始流动相A:B的比例为77.5:12.5,20min时，流动相A:B的比例为50:50,25min时，流动相A:B的比例为40:60，35min时，为100%B液，40min时，流动相A:B的比例为77.5:12.5，柱温30°C，检测波长为280nm,254nm 和 215nm。
[0022]上述多肽分子筛的缓冲液为蒸馏水；上样量500 μ I ;流速0.5ml mirT1 ;检测波长为 280nm，254nm 和 215nm ;检测时间为 70min。
[0023]上述分析液相的流动相为
[0024]A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0)，B液:乙腈；上样量20μ I ;流速lml/min ;检测波长为280nm，254nm和215nm ;柱温:30°C ;检测时间为lOmin。
[0025]上述标准曲线的建立为:首先准确称取5mgP -胡萝卜素标准品，溶解于IOml的二氯甲烧，并加入Ig的Tween-80,在通风橱中旋转使其二氯甲烧挥发至干,加入50ml蒸懼水即为胡萝卜素储备液于4°C保存；分别取20，40，60，80，10(^1储备液定容至3.251111，以蒸馏水为空白调零于460nm波长处测其吸光值，用所得数据作图可得β -胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线。
[0026]上述计算β -胡萝卜素降解酶的酶活，根据胡萝卜素初始浓度和加入胡萝卜素降解酶反应10min后胡萝卜素的终浓度得到的。酶活定义为:lmin降解IumoL底物所需要的酶液为一个酶活单位，即1U。
[0027]本发明的β -胡萝卜素降解酶的纯化方法，所带来的技术效果是:
[0028]1、在查氏培养基培养葡萄球菌过程中加入酵母浸粉，使其产生活性更高的粗酶，以便纯化过程的进行。
[0029]2、采用强离子交换柱MONO Q10/100GL( 10 X 100mm)纯化蛋白，缓冲液为A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(PH5.0), B液:20mM醋酸钠缓冲液中加Imol I-1氯化钠；所述线性洗脱为:上样量为2ml ;流速lml/min ;程序为:0_30min，A液洗脱；30_70min，0_50%B液线性洗脱；70-80min，50%B 液洗脱；80_110min，100%B 液洗脱；检测波长为 280nm，254nm 和 215nm。能较好的除去多种杂蛋白。
[0030]3、采用半制备色谱柱C18(250mmX 10mm, 10 μ m)。流动相为A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0)，B液:乙腈；所述梯度洗脱为:上样量5ml ;流速5ml mirT1 ;洗脱程序为:初始流动相A:B的比例为77.5:12.5，20min时流动相A:B的比例为50:50,25min时，流动相A:B的比例为40:60，35min时，为100%B液，40min时，流动相A:B的比例为77.5: 12.5，柱温30°C，检测波长为280nm，254nm和215nm。使得活性成分得到进一步纯化。
[0031]4、利用多妝分子筛 Superdex peptidel0/300column( IOX 300-330mm)o 缓冲液为蒸馏水；上样量500 μ I ;流速0.5ml mirT1 ;检测波长为280nm，254nm和215nm ;检测时间为70min。连续两次上样于多肽分子筛，除去了胡萝卜素降解酶中的盐和其他杂质。
[0032]5、利用分析液相鉴定酶纯度。色谱柱(:18(4.611111^250111111，511111)，流动相为六液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0), B液:乙腈；上样量20 μ I ;流速lml/min ;检测波长为280nm，254nm和215nm ;柱温:30°C ;检测时间为lOmin。经鉴定得到单一峰，说明其纯度达到 95%。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1a是离子交换层析分离纯化图；
[0034]图1b是离子交换层析分离得到的各个峰的酶活图；
[0035]图2a是高效制备液相分离纯化图；
[0036]图2b是高效制备液相分离纯化得到的峰的酶活图；
[0037]图3a是第一次多肽分子筛分离结果图；
[0038]图3b是第一次多肽分子筛各个峰的酶活图；
[0039]图4a是第二次多肽分子筛分离结果图；
[0040]图4b是第二次多肽分子筛各个峰的酶活图；
[0041]图5是分析液相检测结果。
[0042]以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
【具体实施方式】
[0043]沙棘汁及沙棘酒中β -胡萝卜素降解的动态规律研究表明:新鲜沙棘汁中β -胡萝卜素的降解速度明显高于其他体系中的降解速度，并伴有产气等微生物活动现象。 申请人:在沙棘汁存放过程中，发现胡萝卜素的浓度有较大变化，而按照沙棘汁的理化状态，β_胡萝卜素应该比较稳定，故研究其中的微生物是否具有降解β_胡萝卜素的能力，在研究过程中分离得到一株微生物，对其进行分离、鉴定，确认该微生物属于葡萄球菌属，并对其降解特性进行了研究。研究发现该微生物的发酵液(粗酶液)能够在较短时间(Ih)内降解β-胡萝卜素80%，而对照中的β-胡萝卜素几乎没有变化，而降解产物主要是发酵酒的香气成分，为此进行了深入细致的研究。对粗酶液采用蛋白纯化系统和高效制备液相色谱相结合的方法进行纯化，操作简便、准确性高、重复性好，并得到了酶活较高的纯酶。
[0044]在以下的实施例中， 申请人:给出一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法，该方法采用蛋白纯化系统和PHPLC对β-胡萝卜素降解酶进行纯化，利用HPLC对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力。
[0045]具体按下列步骤操作:
[0046]首先在改良查氏培养基中培养该葡萄球菌，培养条件为:37°C，恒温培养24h，10000r/min冷冻离心20min,取上清得粗酶液，冷冻干燥浓缩粗酶液到一定的浓度，过
0.22 μ m有机系滤膜进行纯化。纯化主要分为三大步，第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件:强阴离子柱MONO Q10/100GL (10 X 100mm)，选择合适的缓冲液线性梯度洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β_胡萝卜素能力的活性成分；第二步将上述得到的活性成分进PHPLC进行进一步分离，纯化条件:半制备色谱柱C18 (250mmX 10mm, 10 μ m)，选择一定柱温，选择合适流动相梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩；第三步上样于蛋白纯化系统，条件:多肽分子筛Superdexpeptidel0/300column (10X300-330mm),选择合适的缓冲液洗脱,选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测。采用分析液相检测纯度的条件:色谱柱C18 (4.6mmX250mm,5ym),选择一定柱温，选择合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测。将底物胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立β_胡萝卜 素溶液浓度与吸光值的标准曲线，用以计算β_胡萝卜素降解酶的酶活。
[0047]在本实施例中，离子交换层析分离纯化以及得到的各个峰的酶活如图1a和图1b所示，高效制备液相分离纯化以及得到的峰的酶活如图2a和图2b所示，第一次多肽分子筛分离结果以及各个峰的酶活如图3a和图3b所示，第二次多肽分子筛分离结果图分离结果以及各个峰的酶活如图4a和图4b所示,分析液相检测结果如图5所示。
[0048]具体的实验过程如下:
[0049]1、仪器与样品
[0050]1.1 蛋白纯化系统(AKTA purifierlOOsystem, Amashia, Sweden),高效制备液相系统(LC-8A, Shimadzu, Japan),高效液相色谱(LC-20A, Shimadzu, Japan),强阴离子柱 MONOQ10/100GL (10X 100mm),半制备色谱柱 C18 (250mmX 10mm, 10 μ m),多妝分子筛柱 Superdexpeptidel0/300column (10 X 300-330mm),色谱柱 C18 (4.6mmX 250mm, 5 μ m)。
[0051]1.2样品:从沙棘汁分离得到的葡萄球菌。
[0052]2、方法与结果
[0053]2.1粗酶液的提取
[0054]在1000ml的改良查氏培养基中培养该葡萄球菌，培养条件为:37°C，恒温培养24h ；
[0055]培养结束后，将上述1000ml发酵液在1000Or mirT1条件下冷冻离心20min，取上清得粗酶液，将其进行冷冻干燥，浓缩至粗酶液的1/6倍，取6ml浓缩液，过0.22 μ m有机系滤膜，上样量2ml。
[0056]2.2离子交换
[0057]强离子交换柱MONO Q10/100GL (IOXlOOmm);缓冲液为:
[0058]A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0), B液:20mM醋酸钠缓冲液中加Imol -1氯化钠；
[0059]所述线性洗脱为:上样量为2ml ;流速lml/min ;程序为:
[0060]0-30min:A 液洗脱； [0061]30min_70min, 0-50% 的 B 液线性梯度洗脱；
[0062]70min-80min, 50% 的 B 液洗脱；
[0063]80min-llOmin, 100%B 液洗脱；
[0064]检测波长为280nm，254nm和215nm。收集有酶活的活性成分。
[0065]2.3高效制备液相
[0066]米用半制备色谱柱C18 (250mmX 10mm，10 μ m),流动相为:
[0067]A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0 )，
[0068]B液:乙腈；
[0069]所述梯度洗脱为:上样量5ml ;流速5ml mirT1 ;洗脱程序为:初始流动相A液:B液的比例为77.5:12.5,20min时，流动相A液:B液的比例为50:50,25min时，流动相A液:B液的比例为40:60，35min时，为100%B液，40min时，流动相A液:B液的比例为77.5:12.5，柱温30°C，检测波长为280nm，254nm和215nm。收集活性成分，利用冷冻干燥进行浓缩。
[0070]2.4多妝分子筛
[0071]利用多妝分子筛Superdex peptidel0/300column (10X300-330mm)o 缓冲液为蒸馏水；上样量500 μ I ;流速0.5ml mirT1 ;检测波长为280nm，254nm和215nm ;检测时间为70min。连续两次上样于多肽分子筛，收集目标物质。
[0072]2.5高效液相色谱
[0073]色谱柱C18 (4.6mmX 250mm, 5 μ m),流动相为:
[0074]A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液(pH5.0 );
[0075]B液:乙腈；上样量20 μ I ;流速Iml mirT1 ;检测波长为280nm, 254nm和215nm ;柱温:30°C ;检测时间为IOmin0
[0076]2.6标准曲线的建立
[0077]首先准确称取5mgP-胡萝卜素标准品，溶解于IOml的二氯甲烷，并加入Ig的Tween-80，在通风橱中旋转使其二氯甲烷挥发至干，加入50ml蒸馏水即为β -胡萝卜素储备液于4°C保存；分别取20 μ 1，40 μ 1，60 μ 1，80 μ 1，100 μ I储备液定容至3.25ml，以蒸馏水为空白调零于460nm波长处测其吸光值，用所得数据作图可得β -胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线。
[0078]2.7 β -胡萝卜素降解酶活性测定
[0079]根据胡萝卜素初始浓度和加入胡萝卜素降解酶反应10min后胡萝卜素的终浓度得到。
[0080]β -胡萝卜素降解酶的纯化过程中的比活力和纯化倍数由下表1所示:[0081]表1: β -胡萝卜素降解酶的纯化过程中的比活力和纯化倍数
【权利要求】
1.一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法，其特征在于，该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β-胡萝卜素降解酶进行纯化，利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力，具体按下列步骤操作: 1)在改良查氏培养基中培养葡萄球菌，培养条件为:37°c，恒温培养24h； 2)培养结束后，将发酵液于1000OrmirTHt:离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22 μ m有机系滤膜，过滤液用于进一步纯化酶； 3)纯化:纯化分三步: 第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件:强阴离子柱MONO Q10/100GL，选择合适的缓冲液进行线性洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β_胡萝卜素能力的活性成分； 第二步，将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离，纯化条件:半制备色谱柱C18，选择合适柱温，以及合适流动相进行梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解β -胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩； 第三步，上样于蛋白纯化系统，条件:多肽分子筛Superdex peptidel0/300column,选择合适的缓冲液洗脱，选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测； 采用分析液相检测纯度的条件:色谱柱C18，选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测； 将底物胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线，用以计算β_胡萝卜素降解酶的酶活和比活力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良查氏培养基是在查氏培养基加入质量浓度为0.3%的酵母浸粉。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换中的缓冲液为: A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液，ρΗ5.0 ； B液:20mM醋酸钠缓冲液中加1mol 1-1氯化钠； 所述线性洗脱为:上样量为2mL ;流速lmL/min ;洗脱程序为: 0-30min, A 液洗脱； 30min-70min,0-50%的B液线性梯度洗脱； 70min-80min,50%B 液洗脱； 80min-lIOmin, 100%B 液洗脱； 上述的检测波长为280nm，254nm和215nm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相为: A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液，ρΗ5.0 ； B液:乙腈； 所述梯度洗脱为:上样量5mL ;流速5mL/min ;洗脱程序为: 初始流动相A:B的比例为77.5:12.5，20min时，流动相A:B的比例为50:50，25min时，流动相A:B的比例为40:60, 35min时，为100%B液，40min时，流动相A:B的比例为77.5:12.5，柱温 30 0C，检测波长为 280nm, 254nm 和 215nm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽分子筛Superdexpeptidel0/300column的缓冲液为蒸懼水；上样量500 μ L ;流速0.5mL/min ;检测波长为280nm, 254nm 和 215nm ;检测时间为 70min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析液相的流动相为: A液:20mM醋酸钠-醋酸溶液，pH5.0，B液:乙腈；上样量20 μ L ;流速lmL/min ;检测波长为280nm，254nm和215nm ;柱温:30°C ;检测时间为IOmin0
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的建立为:首先准确称取5mg^ -胡萝卜素标准品,溶解于IOmL的二氯甲烧,并加入Ig的Tween-80,在通风橱中旋转使其二氯甲烷挥发至干，加入50ml蒸馏水即为β -胡萝卜素储，备液于4°C保存； 分别取20 μ L，40 μ L，60 μ L，80 μ L，100 μ L储备液定容至3.25mL,以蒸馏水为空白，调零于460nm波长处测其吸光值，用所得数据作图可得β -胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线。`
【文档编号】C12N9/02GK103555684SQ201310500511
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】樊明涛, 朱明明, 王树林 申请人:西北农林科技大学