莱茵衣藻的油脂代谢途径相关基因和蛋白以及基因突变藻株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了莱茵衣藻的油脂代谢途径相关基因及其蛋白以及基因突变藻株及其应用。本发明通过设计AT、TAGLP两个基因相对应的microRNA（AT-mic、TAGLP-mic）对这两个基因分别进行沉默处理，获得了莱茵衣藻AT、TAGLP基因沉默的突变株（AT-CR、TAGLP-CR）。通过测定突变藻株的中性脂含量和总脂含量，发现AT-CR、TAGLP-CR突变株的中性脂含量分别比野生型增加了14.73％和13.18％，AT-CR、TAGLP-CR突变株的总脂含量分别比野生型增加了76.97％、102.03％。本发明将在从莱茵衣藻中提高提取油脂含量中发挥重要作用，应用前景广阔。
【专利说明】莱茵衣藻的油脂代谢途径相关基因和蛋白以及基因突变藻株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程及微生物【技术领域】，特别是涉及两个莱茵衣藻的油脂代谢途径相关基因(AT、TAGLP)及这两个基因的突变体藻株，及其在改变莱茵衣藻油脂含量中的应用。
【背景技术】
[0002]微藻能源作为生物能源的战略储备，目前已引起国内外的高度关注。微藻具有不与农作物竞争用地、无污染、易培养、繁殖迅速、油脂含量高等优点，因此被认为是当今生物能源可持续发展的重要原料。目前，对于高产油脂微藻的研究主要集中在从种质库中筛选、人工诱变和利用基因工程和代谢工程手段制造工程藻株，与前两种相比，第三种方法最简单直接，被认为是最有发展前景的技术之一。
[0003]莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻，是很多基本化合物代谢机理研究的模式藻株，目前它的全基因组测序已经完成，这使得它在遗传学和基因组学方面成为研究微藻油脂代谢途径的模式藻株。目前，微藻油脂合成和代谢分子机理研究还很薄弱，对微藻油脂合成和积累网络途径相关基因的功能了解甚微，在植物细胞中已知的脂肪酸合成相关功能基因有乙酸辅酶A竣化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase,ACCase)基因、三憐酸甘油脱氧酶基因(g3pdh)、甘油二酯脂肪酰转移酶(dagat)基因等，然而在微藻中曾试图将修饰的ACCase基因引入微操，以获得闻效表达ACCase基因的闻油操株，但未取得成功，目如国际上关于用基因工程方法提高藻类油脂含量的研究也进展缓慢。虽然植物中的一些油脂合成途径相关基因在微藻中有同源 基因，但其油脂合成途径跟植物中是否相同，在微藻中的合成和调控途径如何未见有新的报道。因此发掘更有效的与油脂代谢途径相关的功能片段，并且对莱茵衣藻油脂积累途径进行更进一步的研究将为其它微藻的工业化应用提供重要信息。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供两个莱茵衣藻中的油脂代谢途径相关基因(AT、TAGLP)及其编码蛋白与应用。
[0005]第一方面，本发明所提供的其中一个油脂代谢途径相关基因，命名为AT，来源于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii ),是下述核苷酸序列之一:
[0006]I)序列表中SEQ ID NO:1的DNA序列；
[0007]2)编码序列表中SEQ ID NO:2的DNA序列；
[0008]3)与序列表中SEQ ID NO:1限定的核苷酸序列具有90%以上同源性并具有转移乙酰辅酶A酰基功能的乙酰转移酶的核苷酸序列；
[0009]4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0010]所述高严谨条件为杂交后用含0.1 X SSPE (或0.1 X SSC),0.1 % SDS的溶液在65 °C下洗膜。
[0011]序列表中的SEQ ID NO:1由1218个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1218位喊基，编码具有序列表中SEQ ID NO:2所不氣基酸残基序列的蛋白质。
[0012]上述油脂代谢途径相关基因AT编码的蛋白，命名为AT，是下述氨基酸残基序列之
[0013]I)序列表中的 SEQ ID NO:2 ；
[0014]2)将序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有转移乙酰辅酶A酰基功能的乙酰转移酶的蛋白质。
[0015]序列表中的SEQ ID NO:2由405个氨基酸残基组成。
[0016]第二方面，本发明所提供的另外一个油脂代谢途径相关基因，命名为TAGLP，来源于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii ),是下述核苷酸序列之一:
[0017]I)序列表中SEQ ID NO:3的DNA序列；
[0018]2)编码序列表中SEQ ID NO:4的DNA序列；
[0019]3)与序列表中SEQ ID NO:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性并具有还原三酰甘油成二酰甘油功能的甘油三酯脂肪酶的核苷酸序列；
[0020]4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0021]所述高严谨条件为杂交后用含0.1XSSPE(或0.1 X SSC),0.1 % SDS的溶液在65 °C下洗膜。`
[0022]序列表中的SEQ ID NO:3由1674个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1674位喊基，编码具有序列表中SEQ ID NO:4所不氣基酸残基序列的蛋白质。
[0023]上述油脂代谢途径相关基因TAGLP编码的蛋白，命名为TAGLP，是下述氨基酸残基序列之一:
[0024]I)序列表中的 SEQ ID NO:4 ；
[0025]2)将序列表中SEQ ID NO:4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有还原三酰甘油成二酰甘油功能的甘油三酯脂肪酶的蛋白质。
[0026]序列表中的SEQ ID NO:4由557个氨基酸残基组成。
[0027]含有本发明基因AT、TAGLP的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
[0028]扩增AT、TAGLP基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0029]第三方面，本发明还提供了抑制AT、TAGLP基因表达的RNA (microRNA)，抑制AT基因表达的 RNA(microRNA)是序列表的序列 5 所示的 RNA(AT_miR:5’-GAGUCGCAUAUGCUGUUAUUA-3’)，抑制TAGLP基因表达的RNA(microRNA)是序列表的序列6所示的RNA(TAGLP-miR:5，-ACGCUAGCUGGGAUUGUAAAA-3，)。
[0030]所述RNA (microRNA)的编码序列也属于本
【发明内容】
。
[0031]所述AT-miR的编码序列可为序列表的序列7所示的DNA(5’-GAGTCGCATATGCTGTTATTA-3，)，所述TAGLPniR的编码序列可为序列表的序列8所示的DNA (5’ -ACGCTAGCTGGGATTGTAAAA-3’)。
[0032]含有所述编码序列的基因沉默载体也属于本发明的保护范围。[0033]所述基因沉默载体可为将能合成所述AT基因或TAGLP基因的RNA (microRNA)及其反向互补序列的编码基因插入pChlamiRNA2载体的多克隆位点得到的重组载体。
[0034]所述AT基因沉默载体中的RNA(microRNA)及其反向互补序列的编码基因，命名为AT-miDNA，可具有下述双链核苷酸序列:
[0035]有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列9的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列10的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列10限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0036]所述TAGLP基因沉默载体中的RNA(microRNA)及其反向互补序列的编码基因，命名为TAGLP-miDNA，可具有下述双链核苷酸序列:
[0037]有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列11的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列12的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0038]具体来讲，携带ATiiDNA 的 pChlamiRNA2 载体命名为 pChlamiRNA2/AT_miDNA(简称 AT-mic-RNA2)，携带 TAGLP-miDNA 的 pChlamiRNA2 载体命名为 pChlamiRNA2/TAGLP-miDNA (简称 TAGLP_mic-RNA2)。
[0039]第四方面，转化有所述抑制AT、TAGLP基因表达的microRNA、编码序列、基因沉默载体的转基因细胞系、重组菌和藻株也属于本发明的保护范围。
[0040]其中，转化有AT基因沉默载体pChlamiRNA2/AT-miDNA (简称AT_mic-RNA2)的莱茵衣藻突变藻株(Chlamydomonas reinhardtii )at突变株,名称为AT-CR,该菌株已于2012年12月06日保藏于位于中国北京大屯的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6946。
[0041]转化有TAGLP 基因沉默载体 pChlamiRNA2/TAGLP-miDNA (简称 TAGLP-miC-RNA2)的莱茵衣藻突变藻株(Chlamydomonas reinhardtii ) taglp突变株，名称为TAGLP-CR,该菌株已于2012年12月06日保藏于位于中国北京大屯的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6945。
[0042]第五方面，本发明还提供了一种提高莱茵衣藻中性脂含量、总脂含量的方法，是将上述抑制AT、TAGLP基因表达的microRNA、编码序列或基因沉默载体转化莱茵衣藻，莱茵衣藻中的AT、TAGLP基因沉默后，莱茵衣藻中的总脂含量得到提高。
[0043]第六方面，本发明还提供一种脂类提取方法，利用AT、TAGLP基因对莱茵衣藻油脂合成具有抑制作用，用AT或TAGLP基因沉默载体使莱茵衣藻中的AT或TAGLP基因沉默，得到AT或TAGLP基因突变藻株，再从莱茵衣藻AT或TAGLP基因突变藻株中提取总脂。
[0044]综上，本发明确定了两个莱茵衣藻的油脂代谢途径相关基因AT、TAGLP，通过设计这两个基因相对应的microRNA (AT_mic、TAGLP-mic)对这两个基因分别进行沉默处理，从而获得了莱茵衣藻AT、TAGLP基因沉默的突变株(AT-CR、TAGLP-CR)。通过测定突变藻株的中性脂含量和总脂含量，发现AT-CR、TAGLP-CR突变株的中性脂含量分别比野生型增加了 14.73%和13.18%，AT-CR、TAGLP-CR突变株的总脂含量分别比野生型增加了 76.97%,102.03%，该研究表明AT、TAGLP基因是油脂合成途径中的抑制基因，该基因的沉默能够增加脂肪酸合成的积累。本发明将在提高莱茵衣藻油脂含量中发挥重要作用，应用前景广阔。
[0045]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1为载体pChlamiRNA2的物理图谱
[0047]图2为抑制AT、TAGLP基因表达的microRNA编码基因的克隆与序列结构分析流程图
[0048]图3为抑制AT、TAGLP基因表达的microRNA编码基因转化莱茵衣藻CC425的流程图
[0049]图4为莱茵衣藻突变株AT-CR和TAGLP-CR的PCR鉴定结果[0050]图5为莱茵衣藻突变株AT-CR和TAGLP-CR相对野生型的中性脂含量变化
[0051]图6为莱茵衣藻突变株AT-CR和TAGLP-CR相对野生型的总脂含量变化
【具体实施方式】
[0052]本发明对莱茵衣藻进行深入研究。与其它微藻相同，莱茵衣藻在对数生长期不会积累大量的中性脂(TAG)，而到了对数生长末期，当它们处于环境胁迫的情况下，如氮缺乏的条件下时，就会放慢生长速率并开始积累TAG。本发明通过运用功能基因组学、分子遗传学和全基因组分析等技术来探究莱茵衣藻在不同生长时期(对数生长期、稳定期、油脂积累期和细胞衰亡期)的差别基因表达情况，来鉴别油脂积累的关键酶和调控因子。
[0053]MicroRNA是一类长度大约为21_23个核苷酸的单链小分子RNA，它主要是通过与相关蛋白质形成RNA诱导沉默复合物来介导基因的表达调控过程一一抑制靶基因的翻译过程或者促使靶基因的mRNA降解。MicroRNA的初始转录产物是pri_miRNA。MicroRNA成熟的第一步是由Drosha RNase III核酸内切酶剪切priniRNA形成60_70nt长的、具有茎环结构的 microRNA 前体 pre-miRNA, Ran-GTP/Exportin-5 负责将 pre-miRNA 由细胞核运输到细胞质中；Dicer，另外一种RNase III核酸内切酶在胞质中负责剪切pre-miRNA，形成21-23nt长的miRNA:miRNA*双体，随后，双螺旋解旋，成熟的miRNA选择性的结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-1nducedsilencing complex, RISC)中，形成非对称miRISC复合物，该复合物可以结合到有互补序列的mRNA上，对mRNA的表达进行调控。
[0054]MicroRNA主要用于在翻译水平负调控靶mRNA的表达、抑制翻译起始或翻译后起始、介导mRNA的衰减等，其中，MicroRNA在基因沉默方面的应用主要有通过构建特异的人工MicroRNA，利用高特异高通量的基因沉默机制，分析特定基因序列的功能。
[0055]本发明将围绕相关主题展开。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:《Molecular Cloning:A Laboratory Manual)) (Sambrook, J., Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
[0056]文中所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度(单位g/100ml)，或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0057]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0058]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0059]本发明以下所用试剂来自http://www.chlamy.0rg/TAP.html,摘自 Gorman, D.S., and R.P.Levine (1965) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA54, 1665-1669.介绍的配方。其中:
[0060]1.TAP盐离子溶液
[0061]NH4Cl15.0g
[0062]MgSO4.7H204.0g
[0063]CaCl2.2H202.0g
[0064]加水至I升
[0065]2.磷酸盐溶液
[0066]K2HPO428.8g
[0067]KH2PO414.4g
[0068]加水至100毫升
[0069]3.Hutner，s 微量元素
`[0070]总体积为1L，可按如下要求将所有药品先溶解在水中。
[0071]EDTA.2Na(乙二胺四乙酸二钠)在沸水中溶解，FeSO4最后加入以防止氧化。
[0072]
【权利要求】
1.油脂代谢途径相关基因AT,来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii ),是下述核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID NO:1的DNA序列； 2)编码序列表中SEQID NO:2的DNA序列； 3)与序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列具有90%以上同源性并具有转移乙酰辅酶A酰基功能的乙酰转移酶的核苷酸序列； 4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQID NO:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.权利要求1所述油脂代谢途径相关基因AT编码的蛋白AT，是下述氨基酸残基序列之一: 1)序列表中的SEQID NO:2 ； 2)将序列表中SEQID NO:2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有转移乙酰辅酶A酰基功能的乙酰转移酶的蛋白质。
3.油脂代谢途径相关基因TAGLP,来源于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii ),是下述核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID NO:3的DNA序列； 2)编码序列表中SEQID NO:4的DNA序列； 3)与序列表中SEQID NO:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性并具有还原三酰甘油成二酰甘油功能的甘油三酯脂肪酶的核苷酸序列； 4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQID NO:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.权利要求3所述油脂代谢途径相关基因TAGLP编码的蛋白TAGLP，是下述氨基酸残基序列之一: 1)序列表中的SEQID NO:4 ； 2)将序列表中SEQID NO:4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有还原三酰甘油成二酰甘油功能的甘油三酯脂肪酶的蛋白质。
5.含有权利要求1或3所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
6.抑制权利要求1所述AT基因表达的RNA(microRNA)，是序列表的序列5所示的RNA ；或抑制权利要求3所述TAGLP基因表达的RNA (microRNA)是序列表的序列6所示的RNA。
7.权利要求6所述RNA(microRNA)的编码序列，具体的，所述AT基因RNA (microRNA)的编码序列可为序列表的序列7所示的DNA ;所述TAGLP基因RNA(HiicroRNA)的编码序列可为序列表的序列8所示的DNA。
8.含有权利要求7所述编码序列的基因沉默载体；具体的，所述基因沉默载体是将所述能合成AT基因或TAGLP基因的RNA (mi croRNA)及其反向互补序列的编码基因插入pChlamiRNA2载体的多克隆位点得到的重组载体；更具体的， 所述AT基因沉默载体中的RNA (microRNA)及其反向互补序列的编码基因，命名为AT-miDNA,可具有下述双链核苷酸序列:有义链(正义链，不做模板的DNA链)具有序列表中序列9的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列10的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列10限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；携带AT-miDNA的pChlamiRNA2载体命名为 pChlamiRNA2/AT-miDNA (简称 AT_mic-RNA2);或所述TAGLP基因沉默载体中的RNA(microRNA)及其反向互补序列的编码基因，命名为TAGLP-miDNA，可具有下述双链核苷酸序列:有义链(正义链，不做模板的DNA链)具有序列表中序列11的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列12的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；携带TAGLP-miDNA的pChlamiRNA2 载体命名为 pChlamiRNA2/TAGLP_miDNA (简称 TAGLP-miC-RNA2)。
9.转化有权利要求6所述抑制AT、TAGLP基因表达的microRNA、权利要求7所述编码序列、权利要求8所述基因沉默载体的转基因细胞系、重组菌或藻株；具体的，可为转化有权利要求8中AT基因沉默载体AT-mic-RNA2的莱茵衣藻突变藻株(Chlamydomonasreinhardtii)或转化有权利要求8中TAGLP基因沉默载体TAGLP-miC-RNA2的莱茵衣藻突变藻株(Chlamydomonas reinhardtii)。
10.转化有权利要求8中AT基因沉默载体AT-mic-RNA2的莱茵衣藻突变藻株(Chlamydomonas reinhardtii) at 突变株，其保藏编号为 CGMCC N0.6946 ； 或转化有权利要求8中TAGLP基因沉默载体TAGLP-miC-RNA2的莱茵衣藻突变藻株(Chlamydomonas reinhardtii) taglp 突变株,其保藏编号为 CGMCC N0.6945。
11.一种提高莱茵衣藻中性脂含量、总脂含量的方法，是将权利要求6所述抑制AT、TAGLP基因表达的microRNA、权利要求7所述编码序列、权利要求8所述基因沉默载体转化莱茵衣藻，使莱茵衣藻中的AT或TAGLP基因沉默，以提高莱茵衣藻中的总脂含量。
12.一种脂类提取方法，其特征在于，用AT或TAGLP基因沉默载体使莱茵衣藻中的AT或TAGLP基因沉默，得到AT或TAGLP基因突变藻株，再从莱茵衣藻AT或TAGLP基因突变藻株中提取总脂。
【文档编号】C12N15/55GK103695445SQ201310628458
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2012年11月28日
【发明者】田朝光, 齐西珍, 卢丽娜, 吕和鑫, 曲戈, 马延和 申请人:天津工业生物技术研究所