一种与乳腺癌多西紫杉醇耐药相关的microRNA分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与乳腺癌多西紫杉醇耐药相关的microRNA分子及其应用，该microRNA分子为MiR-129-3p，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明提供的MiR-129与乳腺癌细胞密切相关，转染miR-129-3p组的细胞多西紫杉醇耐药能力显著高于其他组细胞，而miR-129-3p表达降低组的细胞对多西紫杉醇的敏感性显著增强。
【专利说明】—种与乳腺癌多西紫杉醇耐药相关的microRNA分子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤生物治疗【技术领域】，涉及一种与乳腺癌多西紫杉醇耐药相关的microRNA分子及其应用。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，其高发病率严重威胁着女性的身体健康。目前，乳腺癌的治疗以手术治疗结合化疗、放疗为主。但在肯定化疗效果的同时我们不得不承认肿瘤细胞产生耐药现象是乳腺癌转移和复发的重要原因。
[0003]多西紫杉醇是目前乳腺癌化疗的临床一线用药，通过与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制其解聚，导致丧失了正常功能的微管束的产生和微管的固定，发挥干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用。
[0004]近年来随着HiiCT0RNA在肿瘤发生和耐药性获得过程中的研究不断深入，可以通过生物信息学技术预测可能参与乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药的microRNA分子，有可能筛选出逆转乳腺癌多西紫杉醇耐药及提高乳腺癌的临床化疗效果的相关分子。
【发明内容】
[0005]本发明解决的问 题在于提供一种与乳腺癌多西紫杉醇耐药相关的microRNA分子及其应用，该microRNA分子具有在乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞中过度表达、在乳腺癌多西紫杉醇敏感细胞中低表达的特性，是一种新的乳腺癌多西紫杉醇耐药标志物。
[0006]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0007]—种与乳腺癌多西紫杉醇耐药相关的microRNA分子，该microRNA分子为MiR-129-3p，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0008]进一步，提供MiR-129_3p、MiR-129与乳腺癌多西紫杉醇耐药的相关应用:
[0009]MiR-129-3p在制备检测乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
[0010]MiR-129-3p作为目标靶点在制备克服乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
[0011]降低MiR-129-3p在乳腺癌表达的载体、分子或组合物在制备抗乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
[0012]降低MiR-129_3p在乳腺癌表达的载体、分子或组合物在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用。
[0013]MiR-129在制备检测乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
[0014]MiR-129作为目标靶点在制备检测乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
[0015]MiR-129作为目标靶点在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用。[0016]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0017]本发明提供的所涉及的MiR-129_3p是一种microRNA分子，具有在乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞中过度表达、在乳腺癌多西紫杉醇敏感细胞中低表达的特性，是一种新的乳腺癌多西紫杉醇耐药标志物。多西紫杉醇在乳腺癌的治疗过程中发挥着重要作用，但出现的耐药现象是限制其临床疗效的主要原因。因此明确新的microRNA在乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药中作用能够为有效提高乳腺癌的临床疗效提供新的生物靶标选择。
[0018]本发明提供的MiR-129与乳腺癌细胞密切相关，过表达miR-129后的乳腺癌细胞针对多西紫杉醇的耐药能力有所增强，miR-129-3P在乳腺癌MDA-MB-231/taxol耐药细胞中比miR-129-5P的表达显著升高；而且miR-129过表达组EdU阳性细胞百分比较阴性对照Cherry组有所增高，促增殖作用明显。
[0019]本发明提供的所涉及的MiR-129-3p、MiR-129为设计抗乳腺癌多西紫杉醇耐药药物提供了新的靶点，并以此为依据，用以设计和开发直接针对乳腺癌多西紫杉醇耐药的新药。转染miR-129-3p组的细胞多西紫杉醇耐药能力显著高于其他组细胞，而miR-129-3p表达降低组的细胞对多西紫杉醇的敏感性显著增强。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1利用细胞增殖-毒性实验检测乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/taxol感染miR-129病毒组和对照组后耐药能力；
[0021]图2 构建的 MDA-MB-231-miR-129 和 MCF-7_miR-129 稳转细胞系，Cherry 红色荧光标记感染效率；
[0022]图 3-1、图 3-2 为 Real-time PCR 检测 MDA-MB-231_miR-129 和 MCF-7_miR-129 中miR-129的表达水平；
[0023]图4为细胞增殖-毒性实验检测MDA-MB-231-miR-129和MCF-7_miR-129过表达稳转细胞系的耐药能力；`
[0024]图5 为 Real-time PCR 检测乳腺癌 MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/taxol 耐药细胞中miR-129的表达水平；
[0025]图6-1、6_2为EdU掺入检测过表达miR-129对乳腺癌细胞增殖能力的影响；
[0026]图7为软琼脂集落形成实验检测过表达miR-129对乳腺癌细胞增殖能力的影响；
[0027]图8为平板克隆实验检测过表达miR-129对乳腺癌细胞增殖能力的影响；
[0028]图9为细胞增殖-毒性实验检测转染miR-129_3p/5p/NC mimics (化学合成的miRNA模拟体)后乳腺癌MDA-MB-231细胞对多西紫杉醇的耐药能力；
[0029]图10为细胞增殖-毒性实验检测转染miR-129_3p inhibitor后乳腺癌MDA-MB-231/taxol细胞对多西紫杉醇的耐药能力。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0031]1.1明确miR-129发挥促进乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药作用
[0032]A.miR-129 的其序列:miR-129Pre_For sequence (5，to3，)gggggATCCATTACAgCTgggATTCCTgTTgCC ；miR-129Pre-Rev sequence (5，to3，)gggCTCgAggTggAgtTCTCTCACTTgACATTgC)，利用分子克隆技术扩增miR-129，并包装入慢病毒表达载体。
[0033]B.按Lipofectamine2000脂质体转染说明书将miR-129重组质粒及Gateway慢病毒系统Plenti6.3-V5包装质粒共转染293T细胞包装慢病毒，6小时后更换培养液，约48小时后收取慢病毒。
[0034]C.将收取的病毒原液用0.45 y m过滤器过滤并进行分装。
[0035]D.利用收取的慢病毒感染乳腺癌MDA-MB-231/taxol耐药细胞(通过6个月低剂量(IOnM)多西紫杉醇诱导具有稳定耐药性质)，48小时后按每孔I X IO5个细胞接种于96孔板培养箱预培养24小时(在37°C，5%C02的条件下)，待细胞贴壁后给予不同梯度浓度(0，2，4，8，16，32，64，128nM)多西紫杉醇处理，将96孔板在培养箱孵育4天后，更换新鲜培养液后向每孔加入10iilCCK-8溶液(商品化试剂盒，用于快速高灵敏的检测细胞增殖和细胞毒性)，37°C孵育2.5小时后，取出后振荡摇匀后酶标仪测定在450nm处的OD值，处理实验数据绘制药物杀伤曲线。
[0036]结果表明感染miR-129病毒后，乳腺癌耐药细胞给予多系紫杉醇处理后耐药性增强，miR-129与细胞耐药相关。(见图1)
[0037]1.2构建miR-129过表达稳转细胞系
[0038]分别选用乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231，在亲本细胞中分别用药物Blasticidin(杀稻瘟菌素)处理，筛选大部分细胞死亡时的的药物浓度；结果表明(IOy g/ml)为合适的药物浓度。
[0039]利用Gateway慢病毒系统Plenti6.3-V5载体构建的miR-129重组的慢病毒分别感染MCF-7和MDA-MB-231细胞，48小时后利用确定的浓度(10 y g/ml) Blasticidin筛选细胞，过表达miR-129的细胞将继续存活，而其他细胞死亡。
[0040]Blasticidin筛选约I月左右，细胞稳定生长并且状态良好后，大量扩增细胞，冻存备用。
[0041]对于所构建的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞系两种miR-129高表达的细胞系，利用红色荧光Cherry标记(同时设阴性对照组)，显示在MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-129高表达的稳转细胞株构建成功(染色结果如图2所示)。
[0042]对获得的稳定细胞株利用qRT-PCR对miR-129的表达状态进行分析。
[0043]1.3qRT-PCR 检测 mRNA 表达
[0044]microRNA前体长度大约为70~80nt,很可能两个臂分别产生成熟的microRNA。如miR-129-5p和miR-129-3p，分别表明从miR-129前体的5’端臂和3’端臂加工而来的。
[0045]1.3.1引物设计
[0046]hsa_miR_129-3P_Primer Forward Primer(20 u M):
[0047]AAGCCCTTACCCCAAAAAGTAT
[0048]hsa_miR_129-5P_Primer Forward Primer(20 u M):
[0049]CTTTTTGCGGTCTGGGCTTGC
[0050]备注:3P,5P 的下游引物相同，均为 takara 公司 PrimeScript?miRNA qPCRStarter Kit Ver.2.0 中自带 Un1-miR qPCR Primer (10 u M)
[0051]Control Primer:Universal_RNU6B_Primer Mix(20 u M)[0052]F:5’ GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’
[0053]R:5， CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’
[0054]1.3.2两种miR-129高表达的细胞系细胞总RNA提取
[0055]整个RNA提取过程需要带口罩和手套，并且在冰上操作。防止RNA降解。将细胞用预冷的PBS洗涤两次，每组样品加入ImL提前预冷的Trizol，用加样枪反复吹打。
[0056]在冰上放置5min，保证细胞充分的裂解。
[0057]将上步处理的样品转入DEPC水处理过的1.5mL EP管中，加入200 U L氯仿，上下颠倒充分混匀摇匀，静置5min使其分层。4°C 12000rpm离心15min，离心后吸取约500 u L上层液体至新的1.5mL DEPC水处理过的EP管中。然后加入步等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀。
[0058]室温静置IOmin后，4°C 12000rpm离心15min,弃上清。加入ImL乙醇，可见有白色沉淀析出。将洗涤后的乙醇洗干净，后倒置在滤纸上，静止一段时间，用20y L DEPC水溶解。
[0059]定量提取的RNA:取2 ii L RNA溶解于98 y L TE buffer中，用紫外分光光度计测定其A260和A280值，分析RNA的纯度。
[0060]1.3.3两种miR-129高表达的细胞系细胞总mRNA反转录
[0061]取提取好的5 ii g总RNA,用TaKaRa公司的PrimeScript RT逆转录试剂盒进行反
转录实验，反应体系为:
[0062]
【权利要求】
1.一种与乳腺癌多西紫杉醇耐药相关的microRNA分子,其特征在于,该microRNA分子为MiR-129-3p，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.MiR-129-3p在制备检测乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
3.MiR-129-3p作为目标靶点在制备克服乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
4.降低MiR-129-3p在乳腺癌表达的载体、分子或组合物在制备抗乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
5.降低MiR-129-3p在乳腺癌表达的载体、分子或组合物在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用。
6.MiR-129在制备检测乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
7.MiR-129作为目标靶点在制备检测乳腺癌多西紫杉醇耐药的制剂或药物中的应用。
8.MiR-129作为目标靶`点在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用。
【文档编号】C12N15/113GK103667292SQ201310637262
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】张健, 张媛, 陈苏宁, 吴 琳, 韦伊芳, 药立波, 刘文超 申请人:中国人民解放军第四军医大学