吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记及筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记及筛选方法，分子标记为SEQ?ID?NO.20所示序列；筛选方法包括海豚链球菌感染，基因组DNA的提取，引物筛选，SRAP-PCR扩增，序列测定与分析五个步骤，通过此方法可以较为准确、快捷地找到抗海豚链球菌病能力较强的亲本家系，强化培育后，可以作为苗种繁育的亲本。将筛选出的分子标记制备成探针进行不同亲本家系的检验，可以较为简单准确地挑选出抗海豚链球菌病感染的亲本，方便了不同家系间亲本的选择。同时，利用选育的抗病亲本作为繁育亲本可以进一步提高苗种的品质，增加吉富罗非鱼的养殖效益。
【专利说明】吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记及筛选方法
【技术领域】
[0001]本项发明属于水产养殖的抗病家系选育技术，特别涉及吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记及筛选方法。
【背景技术】
[0002]吉富罗非鱼具有生长快，无肌间刺，肌肉中氨基酸和高度不饱和脂肪酸含量丰富等优点。自2006年引入中国以来，已在广东、广西、海南等南方各省广泛养殖，取得了良好的经济效益。优质的苗种供应是罗非鱼产业可持续发展的保证。当前提高苗种质量最主要的措施是人工选育高品质的亲本。人工选育的方法也较为简单，根据一些可测量的形态学指标，加上一些特定的遗传效应分析即可。此种选育方法在提高吉富罗非鱼的生长速度上取得了良好的效果。
[0003]近几年，随着吉富罗非鱼集约化养殖的深入，引起海豚链球菌病的频发。目前，采取的抗海豚链球菌病的方法主要有口服疫苗、投喂添加抗生素或其他药物饲料等。这些方法要么成本较高，难以得到普及，要么可能引起药物在鱼体的残留或污染水质，不符合健康绿色水产品的要求。另外，传统的人工选育方法也无法在抗病家系选育上提供切实有效的支持。因此必须借助分子育种手段，筛选与抗海豚链球菌病基因紧密连锁的分子标记，通过抗病亲本家系的选育来提高子代的抗病能力。现有吉富罗非鱼亲本家系选育中不能区分所筛选的亲本个体抗海豚链球菌感染能力是强还是弱，因此限制了其进一步应用。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的不足，本发明提供了吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记及筛选方法，该方法能够较为简单、准确地筛选出抗海豚链球菌的亲本，有效提高吉富罗非鱼的抗海豚链球菌感染能力，增加罗非鱼产量。
[0005]本发明是通过以下技术手段实现的:
[0006]一种吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记，该分子标记的序列为SEQ IDN0.20所示。
[0007]—种筛选以上所述的吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记的引物对，该引物对的序列为SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.3所示。
[0008]一种筛选以上所述的吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记的方法，包括以下步骤:
[0009](1)海豚链球菌感染:利用现有吉富罗非鱼的家系，每个家系各选相同数量的罗非鱼，相同饲养环境中进行养殖，达到规格一致；采用海豚链球菌进行人工腹腔注射感染，比较感染后各家系的累积死亡率；根据感染后不同家系的正态分布，取左右两个极端的家系个体作为敏感组和耐受组；
[0010](2)基因组DNA的提取:分别取敏感组和耐受组血液样本，提取吉富罗非鱼血液基因组DNA，测定浓度和纯度后保存备用；[0011](3)引物筛选:取SRAP正向与反向引物，将血液样本DNA溶液分别混合构成相应的敏感池和耐受池，以此SRAP引物分别对两个DNA池进行PCR扩增，筛选BSA池出现差异条带基因片段的引物；
[0012](4) SRAP-PCR扩增:根据筛选出的两个DNA池扩增出现差异基因片段的SRAP引物，按照建立的吉富罗非鱼SRAP反应体系与程序对敏感组和耐受组试验样本进行扩增，筛选扩增产生的特异条带；
[0013](5)序列测定与分析:以回收的特异性片段序列作为抗病相关的分子标记备选序列，通过Blast同源性比对，找出吉富罗非鱼抗海豚链球菌病感染相关的分子标记，然后，通过选育出的亲本繁育的后代进行验证性试验，分析分子标记筛选效果。 [0014]所述的筛选吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记方法，步骤(1)中感染所用海豚链球菌浓度可以为5X 107-3X 108CPU/cell。
[0015]所述的筛选吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记方法，步骤(3)中PCR扩增条件可以为 94°C 5min，94°C 30s，40。。30s，72。。lmin 共 5 个循环；94°C 30s，52。。30s,72°C lmin, 72°C 8min 共 35 个循环。
[0016]所述的吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记制备的探针。
[0017]以上所述的引物对在筛选吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记中的应用。
[0018]相关序列多态性(SRAP)是近年来发展起来的一种新型分子标记系统，具有简便、稳定、中等产率、高共显性、易于测序等优点。它利用独特的引物设计对开放式阅读框进行扩增，正、反引物分别与外显子和内含子(或启动子)区域配对，因不同物种、不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。
[0019]BSA池(bulk segregate analysis gene pool):又称集团分离分析法，该方法首先从一对具有目标基因的表型差异的亲本所产生的任何一种分离群体中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的样本，构成2个亚群或集团。将每群的DNA等量混合，形成两个相对性状的“基因池”(gene pool)，然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两群间表现多态性的分子标记遗传上与目标性状基因座位相连锁。在获得了与目标基因相连锁的分子标记以后，可以利用某一作图群体进行分析以便进一步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位置，这样才能完成真正意义上的对基因的标记定位。
[0020]本发明与现有技术相比有以下突出的有益效果:
[0021](l)SRAP分子标记技术主要是针对开放阅读框进行扩增，该标记操作简单，扩增后产生高强带，很少重叠，多态性较好。
[0022](2)较长引物以及50°C以上的退火温度，保证了扩增结果的稳定性。
[0023](3)采用SRAP对敏感池和耐受池的血液DNA样本分别进行扩增后,通过差异条带的比对，可以较为准确的辨别。
[0024](4) SRAP的扩增结果比其它分子标记稳定，筛选出的分子标记在世代中的遗传效果较好，可以稳定的在后代中表现。
【专利附图】
【附图说明】[0025]图1是特异引物EmlMe3的扩增结果图，其中1为耐受组，2为敏感组，3为抗病标记。
[0026]图2是按照建立的吉富罗非鱼SRAP反应体系与程序分别对敏感组和耐受组的试验样本进行扩增，比对扩增产生的特异条带图，其中4为marker，5为耐受组，6为敏感组，7为特异性条带。
[0027]图3是采用酚氯仿方法提取标记组存活的123尾罗非鱼血液基因组DNA，运用EmlMe3对引物进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，116个个体带有特异性标记片段，部分电泳图谱。
【具体实施方式】[0028]筛选吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记方法，按照以下步骤进行:
[0029](1)海豚链球菌感染:选取基地保种的120个优良家系，每个家系各选25-30尾罗非鱼，相同饲养环境中养殖2个月，规格一致。采用5X 107-3X 108CPU/cell浓度海豚链球菌菌液进行人工腹腔注射感染，注射浓度与体重比按照600 μ L/100g。计算48h后各家系的累积死亡率。根据感染后不同家系的正态分布，取左右两个极端各3个家系个体作为敏感组和耐受组。
[0030]感染浓度确定:选取健康的一般吉富罗非鱼，以10的倍数为梯度进行人工感染，计算48h后的累积死亡率，通过死亡率与海豚链球菌菌液浓度的数学关系，得到48h的半致死浓度范围作为本次的感染浓度。
[0031](2)基因组DNA的提取:分别取敏感组和耐受组血液样本各30个/组，采用酚氯仿方法提取吉富罗非鱼血液基因组DNA。测定浓度和纯度后，于-80°C保存备用。
[0032](3)引物筛选:取正向引物8个，反向引物11个，共88对SRAP引物，引物设计参照文献(L i G and Quros CF.Sequence-related amplified polymorphism (SRAP, a newmarker systembased on simple PCR reaction:1ts application to mapping and genetagging in Brassica.Theor Appl Genet，2001，103 (2-3):455-461.)，具体见表 1。通过不同引物组的电泳效果，筛选多态性位点较多，特异性较好的引物组。
[0033]表1引物筛选所选取的正向引物与反向引物
[0034]
【权利要求】
1.一种吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记，其特征在于，该分子标记的序列为SEQ ID N0.20所示。
2.一种筛选权利要求1所述的吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记的引物对，其特征在于，该引物对的序列为SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.3所示。
3.一种筛选权利要求1所述的吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)海豚链球菌感染:利用现有吉富罗非鱼的家系，每个家系各选相同数量的罗非鱼，相同饲养环境中进行养殖，达到规格一致；采用海豚链球菌进行人工腹腔注射感染，比较感染后各家系的累积死亡率；根据感染后不同家系的正态分布，取左右两个极端的家系个体作为敏感组和耐受组；(2)基因组DNA的提取:分别取敏感组和耐受组血液样本，提取吉富罗非鱼血液基因组DNA，测定浓度和纯度后保存备用；(3 )引物筛选:取SRAP正向与反向引物，将血液样本DNA溶液分别混合构成相应的敏感池和耐受池，以此SRAP引物分别对两个DNA池进行PCR扩增，筛选BSA池出现差异条带基因片段的引物；(4)SRAP-PCR扩增:根据筛选出的两个DNA池扩增出现差异基因片段的SRAP引物，按照建立的吉富罗非鱼SRAP反应体系与程序对敏感组和耐受组试验样本进行扩增，筛选扩增产生的特异条带；(5)序列测定与分析:以 回收的特异性片段序列作为抗病相关的分子标记备选序列，通过Blast同源性比对，找出吉富罗非鱼抗海豚链球菌病感染相关的分子标记，然后，通过选育出的亲本繁育的后代进行验证性试验，分析分子标记筛选效果。
4.根据权利要求3所述的筛选吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记方法，其特征在于，步骤(1)中感染所用海豚链球菌浓度为5X 107-3X 108CPU/cell。
5.根据权利要求3所述的筛选吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增条件为94°C 5min,94°C 30s,40°C 30s，72°C lmin共5个循环；94°C 30s, 52°C 30s, 72°C lmin, 72°C 8 min 共 35 个循环。
6.权利要求1所述的吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记制备的探针。
7.权利要求2所述的引物对在筛选吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染家系的分子标记中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103642802SQ201310641738
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】强俊, 何杰, 徐跑, 朱志祥, 王辉, 董在杰 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心