一种漆酶基因Lac7及其表达蛋白和应用的制作方法

一种漆酶基因Lac7及其表达蛋白和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种漆酶基因Lac7及其表达蛋白和应用，该漆酶基因Lac7的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明通过13种染料对重组鸡腿菇漆酶脱色进行研究，发现重组漆酶Lac7+10AA的脱色作用主要发生在反应开始的1，2小时内，随着时间的延长，脱色速度减缓，纯酶的脱色效果明显优于粗酶液，且无论粗酶还是纯酶在加入HBT后脱色率都会增加。Lac7+10AA对雷玛唑亮蓝和孔雀石绿的脱色效果比较好，加入介体HBT后脱色率都可达90%以上。具有很好的工业应用前景，能产生较好的经济效益和社会效应。
【专利说明】一种漆酶基因Lac7及其表达蛋白和应用
【技术领域】
[0001]本发明基因工程【技术领域】，特别涉及一种漆酶基因Lac7及其表达蛋白和应用。
【背景技术】
[0002]漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源，都属于蓝色多铜氧化酶家族，由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，其在纺织染料脱色和纸浆漂白，高分子合成，环境检测，食品工业，解毒和生物修复等方面具有潜在应用价值，因此，关于漆酶的异源表达及其表达调控的研究成为目前国际上酶工程学和环境科学交叉领域研究的热点。
[0003]关于食用真菌漆酶的研究越来越多，例如已经出现蜜环菌、杏鲍菇、鸡腿菇、平菇、香菇、金针菇等的相关报道。现在关于漆酶的研究不仅涉及其生物学特性、分离纯化等方面，而且已经深入到分子水平进入基因工程阶段。但多种漆酶自身的表达量很低，对漆酶基因的克隆和序列分析，使其在异源宿主上高效表达重组漆酶蛋白，是解决其高表达并得以应用是一个重要的手段，因此一直有人研究漆酶的异源表达。
[0004]漆酶具有多种同功酶，不同来源的真菌漆酶，在分子量、对温度和pH的适应性以及耐受能力、酶反应动力学等特征方面都有一定的差异，同一生物产生的不同同功酶的酶学特性也存在差异。因此还需要对漆酶进行不断的深入研究。

【发明内容】

[0005]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种漆酶基因Lac7。本发明的另一目的是提供一种上述漆酶基因Lac7的表达蛋白。本发明还有一目的是提供一种上述漆酶基因Lac7的应用。通过对13种不同染料的脱色作用，为漆酶的外源表达及其工业化应用提供理论依据。
[0006]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种漆酶基因Lac7，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述漆酶基因的表达蛋白，其氣基酸序列如SEQ ID N0.2所不。
[0009]一种所述漆酶基因的表达蛋白的表达方法，在所述的SEQ ID N0.2所不氣基酸序列上添加有10个氨基酸序列组成的表达标签，所述的氨基酸序列为TPFPPFNTNS ;所表达的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]所述的漆酶基因Lac7在对染料的脱色中的应用。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明的漆酶基因及其表达蛋白和应用，具有的优点在于:通过13种染料对重组鸡腿菇漆酶脱色进行研究，发现重组漆酶Lac7+10AA的脱色作用主要发生在反应开始的1，2小时内，随着时间的延长，脱色速度减缓，纯酶的脱色效果明显优于粗酶液，且无论粗酶还是纯酶 在加入HBT后脱色率都会增加。Lac7+10AA对雷玛唑亮蓝和孔雀石绿的脱色效果比较好，加入介体HBT后脱色率都可达90%以上。具有很好的工业应用前景，能产生较好的经济效益和社会效应。【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1是鸡腿菇总RNA琼脂糖凝胶电泳图；图中，M为Marker，I为提取的鸡腿菇总RNA ；
[0013]图2是鸡腿菇DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中，M为Marker，1、2为提取的鸡腿菇DNA ；
[0014]图3是简并性引物的扩增结果图；左图为一号位与二号位引物PCR结果，右图为一号位与四号位引物PCR结果；
[0015]图4是重组质粒PCR筛选鉴定结果图；图中，M为Marker，1-8为阳性克隆结果；
[0016]图5是重组质粒PCR筛选鉴定结果图；图中，M为Marker，1-10为阳性克隆结果；
[0017]图6是5’ RACE扩增结果图；M为Marker, I号泳道为扩增产物；D:lac75’ RACE ；
[0018]图7是漆酶3’ -RACE扩增结果；
[0019]图8是Iac7+10AA Xba I，sac II酶切位点的PCR获得电泳图，M为Marker, I号为PCR引入酶切位点的结果；
[0020]图9是重组质粒Iac7+10AA PCR筛选鉴定结果图，M为Marker ;1_10号泳道为挑选的白斑做PCR的结果；
[0021]图10是重组质 粒提取结果电泳图；M:mark, 3:lac7+10AA ；
[0022]图11是丽平板生物反应检测漆酶lac7活性结果图；B:lac7+10AA ；
[0023]图12是重组漆酶的生长曲线图；
[0024]图13是铜离子浓度对漆酶Iac7+10AA表达的影响结果图；
[0025]图14是酶液经分离纯化后SDS-PAGE检测结果图；
[0026]图15是鸡腿菇重组漆酶Lac7+10AA的最适温度结果图；
[0027]图16重组漆酶Lac7+10AA的热稳定性结果图；
[0028]图17重组漆酶Lac7+10AA的最适反应pH结果图；
[0029]图18重组漆酶Lac7+10AA的pH稳定性结果图；
[0030]图19是不同时间对Lac7+10AA纯酶(无介质)脱色的影响结果图；
[0031]图20是不同时间对Lac7+10AA纯酶(有介质)脱色的影响影响结果图；
[0032]图21是重组鸡腿菇漆酶Lac7+10AA对蒽醌类染料的脱色结果图；
[0033]图22是重组鸡腿菇漆酶Lac7+10AA对偶氮类染料的脱色结果图；
[0034]图23是重组鸡腿菇漆酶Lac7+10AA对三苯甲烷类染料的脱色结果图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0036]实施例1
[0037](I)鸡腿菇菌丝的获取
[0038]将鸡腿菇菌种从试管斜面接种到PDA平板上，置于25°C恒温培养箱中培养。用灭过菌的直径为Icm的打孔器在长满菌丝的PDA平板上(鸡腿菇需十天左右)打孔，挑四块菌落放于每个灭过菌的250mL三角瓶中(每瓶含有30mL液体培养基)，置于25°C恒温培养箱中培养。在第10天，加入咖啡酸(终浓度为ImM)诱导，第22天收集菌丝。将菌丝用纱布过滤，然后用PBS冲洗两次,液氮速冻后放入_80°C冰箱保存备用。
[0039](2)总RNA的提取
[0040]采用Invitrogen的TRIZOL试剂提取，具体过程:将鸡腿菇样品从_80°C冰箱中取出，液氮研磨成粉末；取适量粉末加入ImL TRIZOL试剂，振荡6次，每次15s，室温放置5min ;加入0.2mL氯仿,震荡混合均匀，室温静置5min ;用小于等于12000g的转速4°C离心15min ;上清液转移至干净的离心管,加入异丙醇0.25mL, NaAc0.25mL上下颠倒数次室温静置IOmin,用不超过12000g的转速离心4°C离心IOmin ;弃上清,沉淀用75%乙醇清洗,用枪轻柔吹打，使沉淀漂起；用小于7500g的速度4°C离心5min ;弃上清，加入75%乙醇再次漂洗，离心步骤同上；弃上清干燥RNA，加入20-30 μ LDEPC-H2O溶解，_80°C保存。
[0041]提取的RNA跑琼脂糖电泳，经电泳分离和溴化乙锭染色后，根据高丰度的28S和18S核糖体RNA (rRNA)条带的亮度来判断RNA的完整性。粗提取的RNA经非变性1%的琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，样品出现18S和28S两条RNA特征亮带，RNA质量较好，可以后续使用。
[0042](3)鸡腿菇基因组DNA的提取
[0043]真菌DNA的提取方法参照实验手册:取Ig菌丝，用液氮研磨充分；加入IOmL DNAlysis buffer (0.1M Tris-Hcl (pH8.0),0.05M EDTA，0.5%SDS，1%β -巯基乙醇，65°C保温Ih ;加入等体积苯酹:氯仿:异戍醇(25:24:1), 1000Og,4°C, 15min ;转上清至一干净离心管，加等体积氯仿:异戊醇(24:1)，10000g，4°C，15min ;转上清液，加入1/3体积的3M NaAc(ρΗ5.2)，一倍体积异丙醇;-20°C放置I小时，10000g，4°C，5min ;加入15mL75%乙醇，漂洗DNA沉淀，室温放置干燥30min (至无乙醇味)；加入500 μ L TE buffer溶解，转移到1.5mL的离心管；加入RNasel0uL，37°C保温Ih ;酚仿抽提:①加入I倍体积酚,室温放置lOmin，13000rmp, IOmin,取上清·?，② 1/2 体积酹+1/2 体积氯仿，室温放置 lOmin, 13000rmp, IOmin,取上清！③一倍体积氯仿，室温放置lOmin, 13000rmp, IOmin,取上清。乙醇沉淀:①2倍体积无水乙醇，1/10 体积 3M NaAc (ρΗ5.2)，_20°C放置数小时；? 4°C，16000rmp，离心 15min，弃上清；③加入75%乙醇漂洗沉淀2次，风干；④加入500 μ L TE buffer溶解沉淀，-20°C保存。
[0044]提取的DNA用琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示，可见在5000bp以上有清晰条带，此DNA可用作后续试验。
[0045](4)鸡腿菇漆酶基因组DNA序列的获得
[0046]多数真菌漆酶是单体蛋白质，酶分子中一般都含有4个铜原子，根据铜结合区的保守氨基酸序列可设计简并性引物，克隆漆酶。
[0047]扩增漆酶基因片段引物:一号位正向引物:5’ -CAYTGGCAYGGNTTYTTYCA-3 ’ ；二号位反向引物:5’-GRCTGTGGTACCAGAANGTNCC-3’ ；四号位反向引物:5’ -TGCCARTCDATRTGRCARTG-3’。
[0048]普通PCR，采用 25 μ L PCR 体系:2yL25XdNTP Mix, 1.5μ L Mg+ (MgCl2),
2.5μ L10XAdvantage2PCR buffer, 15.375 μ L PCR-H2O, 2.5 μ L 模板 DNA，0.125 μ L RTaq,
0.5μ L正向引物，0.5μ L反向引物。
[0049]PCR 条件:95°C (lmin),95°C (30s)，55°C (30s)，72°C (2min) ;28circles。
[0050]目的片段的回收，步骤如下:(I)先称量空的1.5mL的离心管的质量，随后称量放入胶的离心管的重量。以便测得胶的重量，Img对应I μ L。(2)加入buffer GC于68°C恒温水浴中6~Smin至完全溶解(期间每过2分钟最好摇晃数次以确保充分溶解)。(3)将溶解后的溶液转入纯化专用离心管中，12000g，lmin。(4)弃管中溶液，加入500MLDNA WashingBuffer, 12000g, lmin。(5)弃管中溶液，空转一次以去除DNA Washing Buffer中残留的酒精。(6)取一干净的离心管，将过滤器置于离心管中。(7)加入约30yL ddH20充分溶解，12000g，离心lmin。(8)为保证目的样完全溶解，将试管中的溶解液吸出并再次打入过滤器，再次离心。(9)取5 μ L提纯后的DNA，进行鉴定DNA质量。
[0051]使用一号位正向引物和二号位反向引物、一号位正向引物和四号位反向引物，以提取的DNA为模板，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3所示，一号位与二号位引物的扩增产物大小在200bp左右，一号位与四号位引物的扩增产物大小在1600bp左右，这与预期结果相同，可用这些扩增产物进行后续试验。
[0052]纯化产物与PCR载体的连接:纯化产物加A (腺嘌呤)尾后放入PCR仪中，70°C，30min。加尾体系为:I μ LlOXPCR buffer (Mg2+free)、I μ L MgCl2 (25mM)U μ L dATP(50X )>1 μ L Taq polymerase、7 μ L 纯化产物。
[0053]将上述加完A尾的片段连接到PCR载体上，4°C连接过夜。连接体系为:I μ LlOXligation buffer,2y L PCR2.lvector、6 μ L 加 A 尾后的产物、I μ L T4DNAIigase0
[0054]制备大肠杆菌感受态细胞:活化大肠杆菌，用IL的三角瓶(加250mLLB培养基)培养菌，约2小时,测OD值在0.5即可。分装5OmL离心管中离心，2000g,离心6mim。加IOmL氯化1丐(先在冰中放置)悬浮，3管并I管,最后定容至20mL。1200g,6min离心。加IOmL氯化钙轻轻悬浮，在冰中放置30min。1200g,6min离心。加2mL~3mL氯化钙悬浮,分装IOOul一管，一80°C保存。
[0055]转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞:①将DH5 α感受态细胞(200 μ I)从_80°C冰箱中取出，冰上解冻。②将连接产物加入化冻的DH5a中，用移液枪混合均匀。③冰浴30min甚至更长时间。④42°C热击2min `(精确)。⑤加入0.5mL LB培养基，37°C，200rpm，摇床培养I小时。⑥由于菌液较浓，故不进行离心浓缩，IPTG40y L和X_Gal20l.! L混合均匀，后将菌体加入涂LBA平板。⑦37°C培养箱中培养过夜。
[0056]蓝白斑及菌落PCR筛选阳性克隆并测序:从涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板中挑取白斑为模板，以T7、M13reverse为引物用程序2.2.4.2进行PCR扩增，筛选长度合适的白斑，取阳性菌株测序。把两组PCR产物与PCR载体相连接，转入大肠杆菌感受态，涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板，37°C过夜培养得到蓝白斑，根据β -葡糖糖苷酶的α -互补原理，知道得到的白斑是插入外源基因片段的阳性克隆。对白斑进行菌落PCR筛选，以确定插入外源基因片段的重组质粒。
[0057]由于M13reverse，T7引物间长度大约180bp，所以扩增出来的片段比插入片段要大，结果如图4和5所示,重组转化效率很高，随机各挑取若干测序。以通用M13reverse,T7为引物PCR筛选出扩增出片段长度合适的菌体，测序。获得鸡腿菇基因组DNA序列片段。
[0058]引物设计是RACE能否成功的重要因素。根据已测序获得的鸡腿菇基因组DNA序列片段设计了用于扩增鸡腿菇5’端序列的基因特异性引物:
[0059]Laccase7GSPl:5’ -CTCCGGAACCACCATCAGCCCAATTAG-3，；[0060]5’ RACE 反应体系:2.5μ L5，RACE-ready cDNA、5y L UPM (10X )、1 μ L LaccaseGSPl >41.5 μ L Master Mix (34.5 μ L PCR_H20、I μ L50 X Advantage2polymerase Mix、5μ L10XAdvantage2PCR bufferU μ L50XdNTP Mix)。
[0061]PCR 程序:94°C预变性 5min ；94°C 30s,65°C 30s, 72°C 3min ；34cycles ；72°C 5min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0062]使用CLONTECH 公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplification 试剂盒，以总 RNA 为原料合成的5’ -RACE ready cDNA为模版(方法同3’ -RACE ready cDNA)，用试剂盒自带引物UPM和漆酶特异性引物Laccase7GSPl扩增，电泳检测结果如图6所示，漆酶基因5’ -RACE扩增后在500bp左右位置都出现一条特异性亮带，扩增效果明显，扩增产物使用TIANGEN的Universal DNA Purification Kit 纯化后-20°C保存。
[0063]目的片段的回收纯化、纯化产物与PCR载体的连接、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞、蓝白斑筛选阳性克隆、测序，方法均同上。
[0064]漆酶5’ -RACE扩增、纯化后的片段与PCR2.1Vector连接，转化DH5 α，涂布含有IPTG和X-Gal的LBA平板，根据β-葡糖糖苷酶的α -互补原理，得到的白斑很有可能是插入外源基因片段的阳性克隆。因此每组随机挑取10个白色菌落进行菌落PCR扩增，而后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，选择条带位置正确的送公司测序。获得5’ -RACE序列片段序列如下:
[0065]
【权利要求】
1.一种漆酶基因Lac7，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述漆酶基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.—种权利要求2所述漆酶基因的表达蛋白的表达方法，其特征在于:在所述的SEQID N0.2所示氨基酸序列上添加有10个氨基酸序列组成的表达标签，所述的氨基酸序列为TPFPPFNTNS ;所表达的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
4.权利要求1所述的漆酶 基因Lac7在对染料脱色中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103710364SQ201310690989
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】丁少军, 顾春娟, 王燕 申请人:南京林业大学