本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及毛竹漆酶基因pelac190及其应用。
背景技术：
漆酶(laccase,lac)属于多酚氧化酶，在花青素形成、逆境胁迫、细胞壁形成和酚类物质的催化等过程中均发挥着重要的作用。落叶松(larixgmelinii)体胚中漆酶基因参与细胞壁的加厚和木质化过程；柑橘(citrussinensis)中lac4和lac17在应对硼胁迫中发挥着至关重要的作用；番茄(solanumlycopersicum)中lelac表达量下调，引起ppo、sod和pod酶活性降低，影响其抗性。漆酶作为木质素生物合成中木质素单体形成的最后一个关键酶，对木质素的生物合成具有重要作用。如拟南芥漆酶atlac4和atlac17定位于次生细胞壁，决定着细胞壁木质化的模式；漆酶参与二穗短柄草(brachypodiumdistachyon)茎秆的木质化；过量表达棉花galac1增加了转基因植株中总木质素含量。
近年来，随着我国天然林的全面禁伐，木材供给短缺的问题更为明显，因此木本竹的开发利用更成为研究的热点。竹材用途广泛，涉及家具、建筑、造纸等各个方面，其中竹浆造纸具有原料易得、成纸光滑等优点，在一定程度上可代替部分木浆造纸。然而，造纸过程中木质素的降解一直是竹浆造纸工业实现绿色环保的难点之一，利用生物工程手段来调控竹子木质素生物合成将是解决该问题的重要途径。
毛竹(phyllostachysedulis)是我国重要的经济竹种之一，是我国竹材总产量最大的竹种，是木材短缺最有效的补充。以毛竹为材料研究木质素生物合成关键酶基因，对于解析毛竹木质素形成与调控机制以及更好地开发利用毛竹资源具有重要的现实意义。
然而，虽然对竹子木质素生物合成酶基因已有报道，如pepal、4cl、c4h、c3h、comt、ccoaomt等，但对竹子漆酶基因功能的研究尚属空白。
技术实现要素：
本发明的目的是提供毛竹漆酶基因pelac190及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的毛竹漆酶基因pelac190，基因pelac190编码的蛋白质为如下(a)或(b)：
(a)由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)seqidno:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
基因pelac190的cds序列为：
i)seqidno:1所示的核苷酸序列；或
ii)seqidno:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与seqidno:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明还提供含有所述基因pelac190的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或非可再生的植物部分。
本发明还提供所述基因pelac190或含有该基因的生物材料的以下任一种应用：
1)提高植物木质素含量中的应用；
2)提高植物对抗非生物逆境胁迫中的应用；
3)在植物育种中的应用。
所述非生物逆境胁迫包括但不限于酚酸类物质、干旱胁迫。
其中，所述酚酸类物质包括但不限于丁香酸、芥子酸。
具体地，所述应用包括：
(1)使植物包含基因pelac190；或者，
(2)使植物过表达基因pelac190。
本发明所述植物为单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于禾本科植物，例如竹子等。
可使用的植物双元表达载体包括pcambia1301、经改造的pcambia1301载体pc1301-35s-ocs等；其中，所述改造的pc1301-35s-ocs是在载体pcambia1301引入花椰菜花叶病毒35s启动子和章鱼碱合成酶基因ocs终止子以及多克隆位点(kpni、smai、clai、hindiii、bamhi和xbai)。
携带有目的片段的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2ndedition)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述植物为拟南芥。将毛竹漆酶基因pelac190的cds序列构建到pc1301-35s-ocs上，转化野生型拟南芥，从而提高转基因拟南芥植株：①耐干旱、酚酸类物质的能力；②木质素的含量。
本发明优选采用农杆菌转化法转化植物。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次发现毛竹漆酶基因pelac190具有提高植物木质素含量、对抗非生物逆境胁迫的功能，将毛竹漆酶基因cds序列导入植物(如拟南芥)中，得到木质素含量提高的转基因植株，且转基因植株的耐干旱、酚酸类物质能力均明显提高，为植物的木质素改良、抗性育种奠定了基础。毛竹漆酶基因pelac190在竹子等禾本科植物定向育种中具有广泛的应用前景，为植物基因工程提供了新的基因资源。
附图说明
图1为本发明实施例1中基因pelac190扩增产物电泳图；其中，m：dna分子量标记；1-4：pcr扩增产物。
图2为本发明实施例1中基因pelac190的ta克隆质粒酶切电泳图。
图3为本发明实施例1中pelac190与ph01000829g0190编码蛋白序列的比较分析；其中，方框内为差异氨基酸。
图4分别为本发明实施例2中表达载体pc1301-35s-ocs(a)和正义植物表达载体pelac190sense(b)的质粒图谱。
图5为本发明实施例3中pelac190sense单克隆菌落pcr电泳结果；其中，m：dna分子量标记；1-4：转化pelac190sense的单克隆菌落；5：水对照；6：pc1301-35s-ocs空载体；7：pc1301-35s-pelac190-ocs载体质粒。
图6为本发明实施例4中转基因拟南芥植株rt-pcr检测结果；其中，1-4：转基因植株；5：野生型。
图7为本发明实施例5中拟南芥耐旱性表型分析，其中，col-0：野生型拟南芥；35s∷pelac190：过量表达pelac190转基因植株。
图8为本发明实施例7中拟南芥木质素染色分析，其中，col-0：野生型拟南芥；l1和l2：过量表达pelac190转基因植株。
图9为本发明实施例7中拟南芥木质素含量分析，其中，col-0：野生型拟南芥；l1和l2：过量表达pelac190转基因植株。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1毛竹漆酶基因pelac190的cds序列获得
以毛竹(phyllostachysedulis)幼茎为材料，提取rna，并反转录成cdna作为模板。根据漆酶基因同源序列(ph01000829g0190，可登录http://bioinformatics.cau.edu.cn/bamboo/查询)设计特异性引物，pcr扩增编码区序列。引物序列如下：
上游引物：5′-atgggaggagcacactgcct-3′
下游引物：5′-ctaacacttgggaagatcggacg-3′
对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，切下目的条带纯化回收，将回收的dna片段连接到pgem-teasy载体上，转化大肠杆菌(esherichiacoli)dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析(图2)后，再将单克隆测序，插入片段为1719bp，如seqidno:1所示。应用blast在线软件，将测序的片段与已ph01000829g0190序列进行比较，发现插入片段与ph01000829g0190(1698bp)有着较高的相似性为98.7％，相当于在ph01000829g0190编码区的第1221位和第1222位之间插入了21bp(caggcgcactacggcggcaac)，其余部分完全一致，编码蛋白相差7个氨基酸(gln-ala-his-tyr-gly-gly-asn)(图3)。将该基因命名为pelac190。
通过blast软件在线比较分析，发现pelac190编码的氨基酸序列(seqidno:2)与其它单子叶植物的漆酶具有较高的一致性，其中与二穗短柄草的漆酶(xp_003558420)一致性最高为86％，其次与水稻(oryzasativa)漆酶(np_001049699)的一致性为85％；而与已报道的毛竹pelac(ph01001798g0410)编码蛋白的一致性仅为57.1％。该基因编码的蛋白推测等电点为8.045，分子量为62.247kda。在第34-105位、第160-315位和第442-556位具有3个漆酶典型的铜离子结构域，同时具有参与铜离子绑定的组氨酸残基(his)及半胱氨酰残基(cys)，多结构域分析显示该蛋白具有漆酶的结构特征。由此可见，克隆得到的pelac190基因为一个新的毛竹漆酶基因。
实施例2携带毛竹漆酶基因pelac190的植物表达载体构建
以毛竹cdna为模板，根据seqidno:1所示序列设计引物，pcr扩增毛竹漆酶基因编码区的脱氧核糖核苷酸序列。在引物两端分别引入claⅰ和xbaⅰ酶切位点，引物序列如下：
上游引物：5′-atcgatatgggaggagcacactgcct-3′(引入claⅰ酶切位点)
下游引物：5′-tctagactaacacttgggaagatcggacg-3′(引入xbaⅰ酶切位点3)
对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带纯化回收，将回收的dna片段连接到pgem-teasy载体上，转化大肠杆菌(esherichiacoli)dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆测序，得到含有claⅰ和xbaⅰ酶切位点及编码毛竹漆酶基因pelac190的脱氧核糖核苷酸序列的质粒pt-pelac190。
将质粒pt-pelac190和表达载体pc1301-35s-ocs质粒(图4a)在37℃条件下分别用claⅰ和xbaⅰ双酶切6h，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，用t4dna连接酶4℃连接过夜。连接产物转化dh5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性(50mg·l-1)平板上长出的单克隆，提取质粒，进行pcr鉴定和酶切图谱鉴定。将获得的重组表达载体命名为pelac190sense，重组表达载体pelac190sense如图4b所示。
实施例3重组表达载体转化宿主、阳性克隆鉴定
将实施例2中构建的表达载体pelac190sense通过电击的方法转入农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株eha105感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性(50mg·l-1)平板上长出的单菌落进行pcr鉴定。以pelac190基因重组表达载体转化后形成的单克隆菌落为模板，用实施例2中引物进行pcr检测，同时以重组质粒和水为对照。菌落pcr产物的电泳结果表明，单克隆菌落含有目的基因片段，如图5所示，可用于侵染转化实验。
实施例4毛竹pelac190基因转化拟南芥及rt-pcr检测
利用实施例3中获得的工程菌株，采用蘸花法分别转化野生型拟南芥(col-0)。通过连续抗性(潮霉素b50mg·l-1)筛选，最终获得不分离的t3代抗性株系4个。采用rt-pcr阳性检测方法，以拟南芥actin(正向引物5′-gtatgtggctattcaggctgt-3′，反向引物5′-ctggcggtgcttcttctctg-3′)为内参基因。结果表明，在抗性株系中均检测到了目的片段，而在野生型植株中未检测到目的片段(图6)，证明目的基因在转基因植株中得到了表达。
实施例5转pelac190基因拟南芥植株表型及耐旱分析
选择生长30d左右的拟南芥野生型(col-0)与转基因株系植株进行自然干旱胁迫处理(温度22±2℃，光照/黑暗为16h/8h，光照强度200μmol·m-2·s-1)，分别在处理0d、15d和20d时观察植株表型并拍照。对转基因植株的表型观察发现，与野生型拟南芥相比，纯合转基因株系l1和l2植株呈现相似的表型，表现为植株变小、叶柄缩短。耐旱性分析结果表明，干旱胁迫处理15d后，野生型拟南芥出现较大程度的萎蔫现象，而过量表达pelac190拟南芥植株能够正常生长；处理20d后，野生型拟南芥萎蔫程度加剧，基本死亡，而过量表达pelac190拟南芥植株依然能够维持正常表型，但生长减缓(图7)，说明过量表达pelac190增强了转基因拟南芥的耐旱能力。
实施例6转pelac190基因拟南芥植株抗酚酸物质分析
将获得的过量表达pelac190拟南芥植株与野生型拟南芥植株分别播种在含0.5mmol·l-1丁香酸的1/2ms培养基上与含2mmol·l-1芥子酸的1/2ms培养基上进行处理，4℃黑暗保湿2d后转移至培养室培养，生长10d后观察植株表型并统计成活率，每个株系重复设置15个植株，进行3次实验重复。结果显示，转基因与野生型种子萌发后的长势出现一定程度的差异，丁香酸处理10d后，野生型株系种子萌发后存活率为34％，对应同时期过量表达pelac190株系l1和l2种子萌发后存活率分别为75％和73％；经芥子酸处理10d后，野生型株系的萌发后存活率为67％，对应同时期过量表达pelac190株系l1和l2种子萌发后存活率分别为81％和79％。由此表明，过量表达pelac190植株增强了对酚酸类物质的抗性。
实施例7转pelac190基因拟南芥植株木质素含量分析
选取生长6周的野生型及转基因拟南芥株系，取拟南芥茎基部2cm，用7％琼脂固定后手动切片，厚度约为100μm，经wiesner法染色后制作临时切片，观察拟南芥木质素的含量及分布。木质素能在盐酸存在的条件下与间苯三酚聚合成紫红色的化合物。wiesner法染色后发现，转基因植株染色程度较深，被染的细胞数较多(图8)，由此表明转基因植株中木质素含量多于野生型。
取生长6周的野生型拟南芥和转基因株系，取拟南芥茎基部3cm长的茎，用溴乙酰法测定其中木质素的含量。对拟南芥茎中木质素含量定性分析表明，过量表达pelac190拟南芥株系中木质素的含量比野生型明显增加(l1和l2分别为对照的111％和130％)，这与组织化学染色法取得的结果相一致，表明过量表达pelac190增加了转基因拟南芥株系的木质素含量(图9)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>国际竹藤中心
<120>毛竹漆酶基因pelac190及其应用
<130>khp181113481.8
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1719
<212>dna
<213>毛竹(phyllostachysedulis)
<400>1
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<210>2
<211>572
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<213>毛竹(phyllostachysedulis)
<400>2
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