本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种调控豆科根瘤生长的基因gmspx5及其应用。
背景技术：
近年来，关于spx蛋白的研究报道越来越多，而且进展非常快，许多研究证明，包含spx结构域的蛋白在磷信号和磷平衡调节相关（duanetal.,2008;wangetal.,2009;guetal.,2012）。拟南芥spx基因有4个，分别为atspx1~atspx4（duanetal.,2008），其中，超量表达atspx1增加了磷饥饿诱导基因如acp5、pap2以及rns1的表达，从而增加了磷浓度，表明atspx1在转录水平参与了磷饥饿信号的调控（duanetal.,2008）。相反，突变atspx3能够增加atpht1;4、atpht1;5、atacp5、atrns和atat4的表达，说明atspx3是一个负调控因子（duanetal.,2008;wangetal.,2009）。这些结果表明，spx蛋白在磷信号网路调控中存在功能多样性。水稻spx有6个，分别为osspx1~osspx6（seccoetal.,2012）。其中，osspx1在根中受缺磷上调表达，且位于osphr2和pho2的下游，干涉osspx1的表型与超量表达osphr2和突变pho2相似，都能导致磷的过量累积（wangetal.,2009;liuetal.,2010）。osspx3和osspx5功能冗余负调控磷平衡（shietal.,2014）。osspx1、osspx2和osspx4分别与osphr2互作，负调控磷信号和磷平衡，而且这种互作依赖于磷浓度（lvetal.,2014;wangetal.,2014）。
随着模式植物拟南芥和水稻中spx的报道，非模式植物中的同源基因也相继被克隆。例如，在豆科作物菜豆中共克隆到3个pvspx基因，其中pvspx1在磷信号网路中位于pvphr1下游，超量表达pvspx1正调控磷平衡，表现为增加磷浓度，上调10个缺磷响应基因的表达（yaoetal.,2014a）。在大豆中共有克隆到10个gmspx基因，其中gmspx3正调控磷的平衡，超量表达gmspx3增加磷浓度，且上调7个磷饥饿诱导基因的表达（yaoetal.,2014b）；相反，gmspx1扮演了负调控角色，在拟南芥atspx3突变体中超量表达gmspx1负调缺磷响应基因的表达（zhangetal.,2016）。此外，小麦中的taspx1被报道可能参与小麦籽粒磷的平衡（shuklaetal.,2016）。油菜中的bnspx3;1和bnspx3;2特异受缺磷诱导表达，被作为磷饥饿信号的标记基因（yangetal.,2012）；在拟南芥中超量表达油菜bnaa2.spx1，增加了对缺磷的敏感性，延缓了拟南芥生长（duetal.,2017）。
除了参与磷的信号和平衡调节，研究发现包含spx结构域的蛋白还参与了缺铁响应、低氧响应、光明色素介导的光信号途径等调节（nakanishietal.,1993;selletal.,2005;kangetal.,2006）。例如，在水稻中的研究发现，干涉osspx1影响花药及花粉的发育，降低水稻产量（zhangetal.,2016）。这些研究结果大大补充和扩展了对spx的认识，同时也暗示了spx在植物生长发育过程中参与了多样的调控作用。
另外，大豆是我国重要的粮食和油料作物，同时作为典型的豆科作物，大豆能够与土壤中的根瘤菌共生，形成根瘤。根瘤的共生固氮不仅对农业生产提供了必需的氮养分，而且对于减肥改土，环境保护具有重要意义。而且，与根瘤菌共生形成根瘤也被认为是豆科作物适应缺磷胁迫的重要机制之一（chengetal.,2009;liangetal.,2014）；同时，在长期适应缺磷的环境中，根瘤自身也形成了一些与植物根系类似或者不同的适应性机制（chenetal.,2011;qinetal.,2011;qinetal.,2012b;dingetal.,2012）。但是，关于根瘤适应缺磷的分子机制尤其是根瘤磷信号关键调控因子的研究较少。前期的研究结果表明，在大豆gmspx基因家族中，有6个成员在根瘤受缺磷上调表达（yaoetal.,2014b），但是至今未有相应的基因功能报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供了一种植物根瘤磷信号网络中耐低磷关键调控因子基因，即通过实时荧光定量pcr方法，鉴定了一个在根瘤低磷增强表达的基因gmspx5，该基因的表达受外源磷浓度的调控。并通过构建大豆转基因材料，对根瘤缺磷上调表达的gmspx5进行了系统的功能分析，结果表明gmspx5基因具有调控大豆根瘤生长及发育、提高大豆氮磷含量和产量的功能。
本发明的目的是提供一种调控豆科根瘤生长的基因gmspx5。
本发明另一目的是提供所述基因gmspx5的编码蛋白。
本发明再一目的是提供所述基因gmspx5在调控大豆根瘤生长及氮磷含量方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明公开了一种根瘤磷信号网络中耐低磷胁迫基因gmspx5，是一种植物根瘤磷信号途径关键基因，其cdna核苷酸序列如seqidno.1所示。
所述基因gmspx5编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。
一种含有所述基因gmspx5的表达载体，以及含有该所述表达载体的基因工程菌，也都应在本发明的保护范围之内。
上述含有gmspx5基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有gmspx5基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如ptf101s或其它衍生植物表达载体。
本发明还涉及细胞，其包含本发明的gmspx5基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。
本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如菜豆和大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。
本发明研究发现，gmspx5是主要在大豆根瘤表达，而且显著受低磷增强表达的基因，基因gmspx5和蛋白质能够调控包含它的转基大豆根瘤的生长和植株氮磷营养及产量。
因此，所述根瘤缺磷响应基因gmspx5在调控植物及根瘤生长及氮磷协同高效方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
另外，所述根瘤缺磷响应基因gmspx5或包含该基因的表达载体在制备转基因植物中的应用，以及在制备促进植物适应酸性土壤的制剂方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述转基因植物是指能够与根瘤菌共生的转基因植物。
优选地，所述植物为双子叶植物。
更优选地，所述双子叶植物为豆科作物。
更优选地，所述豆科作物为大豆。
因此，本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括：从本发明的植物细胞再生转基因植物。
本发明还涉及gmspx5基因或重组载体在调控植物根瘤生长和植株氮磷营养中的用途，包括制备转基因植物以及制备促进植物适应酸性土壤的制剂。
本发明还涉及调控植物适应酸性土壤的方法，该方法包括制备含有本发明的gmspx5基因或重组载体的植物。例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物。
本发明所提供的一个优选实施方案是：将包含上述基因gmspx5的重组载体导入大豆子叶中，得到大豆整株转基因株系；所述大豆转基因株系的根瘤数目和植株氮磷营养和产量发生明显变化。
所述基因gmspx5可以例如是通过所述重组表达载体导入受体大豆中。携带有本发明的基因gmspx5的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的整株转化法转化到大豆中。携带有本发明的基因gmspx5的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的转化法转化到烟草表皮细胞中。
本发明还提供了一种明确的构建氮磷协同高效转基因植物的方法，是利用转基因技术将所述基因gmspx5重组入植物的基因组，进而获得转基因植物。如：将本发明的基因gmspx5通过发根农杆菌转入植物中，与其本身的基因组进行重组，从而培育成新的转基因植株。
以大豆为例，获得氮磷协同高效转基因大豆的方法为：运用上述包含基因gmspx5的基因工程菌，侵染大豆子叶结，得到大豆体外诱导再生转基因植株。
具体地，作为一种可选择的实施案例，一种明确的构建转基因大豆的方法，包括如下步骤：
（1）种子萌发。挑选种皮无破损的大豆种子于氯气中进行表面消毒12~14小时；然后播种于萌发培养基上，在28℃光照条件下培养4天。
（2）菌液的准备。将保存的农杆菌划板活化后，挑取单克隆于5毫升添加了相应抗生素的yep液体培养基中，28℃每分钟220的转速下培养至od650为1.0，然后离心收集菌落，用cm液体悬浮菌体至od650为1.0。
（3）子叶节侵染及共培养。用解剖刀切下发芽的种子，切口在离子叶节约0.5厘米的下胚轴区域，然后用手术刀垂直剖开种子，并去除子叶上胚轴（幼芽），垂直于子叶节切出7~8个伤口（约0.5毫米深，3~4毫米长），然后浸入农杆菌菌液30分钟；然后用镊子将外植体转移到共培养的培养基上，切口向下，水平放置，用保鲜膜封住培养皿，转移到培养箱中（24℃），暗培养3天。
（4）诱导长芽。先将共培养后的外植体在液体幼芽诱导培养基（si）中浸洗2~3分钟，然后转移到加有相应抗生素的si培养基上，用透气胶带封口，光照培养生长14天（24℃，18小时光照/6小时黑暗）。14天后切去子叶下胚轴，插入新的si培养基中，同样条件下继续诱导培养14天。
（4）诱芽伸长。将分化的外植体转移到se培养基上，切去子叶，在生长箱中培养2～8周。每隔2周换一次新鲜的se培养基。每一次换培养基时在外植体基部切一个新鲜的水平切口。
（5）诱导生根。待幼芽生长到至少3cm长时，把它们从组织上切下来，转移到生根培养基（rm）中继续培养。约两周后，当茎上长出多于2条根时，将植株轻轻地从培养基中取出，移植到水培瓶中生长约四周，然后将幼苗移植到温室中用营养液培养至结荚。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究显示，超量表达gmspx5可增加高磷处理下大豆的根瘤数目及其侵染细胞密度，而且提高了植株的氮、磷含量和生物量，这对阐明spx基因在调控豆科作物根瘤生长及氮磷养分效率的生物学功能有着重要意义。
本发明研究显示，基因gmspx5不仅受磷的调控，而且超量表达该基因还增强了植株的氮含量提高了产量，该基因的功能研究对于解析“以磷增氮”的分子机理有着深远的研究意义。
本发明还创制了一批超量表达gmspx5转基因大豆新材料，对于豆科作物适应酸性土壤的遗传改良，具有十分重要的市场前景。
本发明不仅在理论上具有十分重要的意义，而且还能用于豆科作物氮磷协同高效的遗传改良，可以通过转基因育种手段用于豆科作物的减肥增效的遗传改良，对植物营养学科的发展具有十分重要的作用，具有十分重要的市场前景。
附图说明
图1为大豆gmspx5在根部和根瘤对缺磷的响应；数据为四次重复的平均值与标准误；“*”表示缺磷处理（-p）与正常磷处理（+p）之间差异显著（student’st-test,p<0.05）。
图2为gmspx5融合gfp蛋白在烟草叶片的亚细胞定位分析结果；图中第一排为转化空载体的烟草亚细胞定位图（35s:gfp），第二排为gmspx5融合gfp蛋白在烟草叶片的亚细胞定位图（35s:gfp-gmspx5）；图片分别为在激光共聚焦显微镜下绿色荧光通道（gfp）、红色荧光通道（细胞膜标记基因）和重叠后的图片（融合）观察拍摄的内容；标尺=20µm。
图3为gmspx5转基因大豆植株鉴定；a：除草剂抗性检测；b：bar基因pcr检测；c：gmspx5在不同株系叶部的表达量检测；wt：野生型株系；ox8和ox12：两个不同的超量表达gmspx5的转基因大豆株系；图中数据为4次重复的平均值和标准误；“*”表示与wt相比差异显著（student’st-test,p<0.05）。
图4为超量表达gmspx5对大豆及根瘤生长的影响；a：大豆及根瘤在不同磷浓度处理下的表型；b：干重；c：氮含量；d：磷含量；e：根瘤数目；f：根瘤鲜重。野生型（wt）和转基因（ox8和ox12）大豆幼苗在正常磷（+p：250mμmkh2po4）和缺磷（-p：5mμmkh2po4）营养液中生长25天；图中数据为4次重复的平均值和标准误；“*”表示与wt相比差异显著（student’st-test,p<0.05）；图中大豆整株标尺为10cm，根系放大图和根瘤标尺为1cm。
图5为超量表达gmspx5对大豆根瘤侵染细胞密度的影响；a：为野生型（wt）和转基因株系（ox12）大豆根瘤横切面的甲苯胺蓝染色结果，其中第二排图片分别为第一排图片中红色方框区域的放大图；b：根瘤侵染细胞密度，根瘤侵染细胞密度用0.04mm2区域内的侵染细胞数目表示，每个根瘤统计两次的数据为一个重复；图中数据为三次重复的平均值和标准误；“*”表示与wt相比差异显著（student’st-test,p<0.05）；图中标尺为100µm。
图6为超量表达gmspx5对大豆产量的影响；a：大田收获表型；b：籽粒数目；c：籽粒干重；数据为15个植株的平均值和标准误差；“*”表示与wt相比差异显著（student’st-test,p<0.05）；图中标尺为20cm。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1gmspx5基因克隆及载体构建
1、超量（ox-gmspx5-ptf）表达载体的构建
（1）设计gmspx5基因特异引物ox-gmspx5-ptf-f和ox-gmspx5-ptf-r：
引物ox-gmspx5-ptf-f（seqidno.3）：
5’-gctctagaatgaagtttgagaagatcctgaag-3’
引物ox-gmspx5-ptf-r（seqidno.4）：
5’-tcccccgggctagttgtgtggagaagatggg-3’。
（2）pcr扩增：以大豆基因型yc03-3缺磷处理根瘤cdna为模板，用基因特异引物ox-gmspx5-ptf-f（seqidno.3）和引物ox-gmspx5-ptf-r（seqidno.4）扩增出gmspx5编码区片段。pcr反应体系为50微升，包含5微升的10×extaqbuffer，4微升2.5毫摩尔/升的dntp，3微升的cdna模板，10微摩尔/升的正反向引物各1微升，extaq酶0.5微升，最后用双蒸水补足至50微升。反应条件为：94℃，3分钟（预变性）；94℃，30秒（变性）；58℃，30秒（复性）；72℃，1分钟（延伸）；重复35个循环的变性-复性-延伸；72℃，10分钟。
（3）将pcr扩增所得片断插入pmd18-t载体，在16℃连接6小时后转化dh10b并涂板，37℃培养12小时后将阳性克隆摇菌，抽提得到重组质粒。用xbai和smai双酶切重组质粒和ptf101s载体，回收酶切片段，将目的基因片段和载体片段用连接试剂盒在16℃，进行连接反应，6小时后，将获得的重组质粒ox-gmspx5-ptf转化dh10b，12小时后将阳性克隆摇菌，送样测序无误后抽提质粒在-20℃保存待用。
2、亚细胞定位分析表达载体的构建：
（1）设计特异引物gfp-gmspx5-f和gfp-gmspx5-r：
引物gfp-gmspx5-f（seqidno.5）：
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatgaagtttgagaagatcctgaag-3’
引物gfp-gmspx5-r（seqidno.6）：
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagttgtgtggagaagatgg-3’
（2）pcr扩增：以大豆基因型yc03-3低磷处理的根瘤cdna为模板，用基因特异引物gfp-gmspx5-f（seqidno.5）和gfp-gmspx5-r（seqidno.6）对大豆gmspx5基因orf全长进行扩增。反应条件为94℃，3分钟（预变性）；94℃，30秒（变性）；58℃，30秒（复性）；72℃，1分钟（延伸）；重复35个循环的变性-复性-延伸；72℃，10分钟。
（3）pcr扩增的产物通过凝胶电泳，利用试剂盒进行回收纯化。获得纯化pcr产物后，与pdonr207进行重组反应。反应体系为10微升，包含pcr产物150纳克，pdonr207载体质粒150纳克，用tebuffer（ph=8.0）补足至8微升，再加入bp酶2微升。将试剂混合物于25℃反应1小时。然后加入1微升蛋白酶k，37℃反应10分钟。待反应结束，将获得的pdonr207-gmspx5质粒转化大肠杆菌并进行测序，无误后提取质粒。将pdonr207-gmspx5的质粒与pmdc43载体质粒进行重组反应，反应体系为10微升，包含pdonr207-gmspx5的质粒150纳克，pmdc43载体质粒150纳克，用tebuffer（ph=8.0）补足至8微升，再加入lr酶2微升。将试剂混合物于25℃反应1小时。下一步加入1微升蛋白酶k，37℃反应10分钟。待反应结束将获得的pmdc43-gmspx5质粒转化大肠杆菌并进行测序，无误后提取质粒。将pmdc43-gmspx5质粒转化农杆菌gv3101，检测无误后保存备用。
实施例2gmspx5基因表达模式及蛋白亚细胞定位分析
1、gmspx5基因的表达模式分析
（1）实验方法
试验设计：设置两个磷浓度处理，高磷（+p）为250微摩尔/升的kh2po4，缺磷（-p）为5微摩尔/升的kh2po4；氮水平为500微摩尔/升的总氮；栽培装置为15升的蓝色不透光面包箱，在日光温室进行培养，每个处理设置四个重复。
育苗：采用卷纸育苗。挑选大小一致的种子，用氯气干消毒（100毫升的次氯酸钠+4.2毫升的盐酸）12小时，之后并排放于润湿的育苗纸的一边，间距约为1厘米，卷起育苗纸，固定有种子的一端朝上（种脐朝下），竖直放于盛有营养液的烧杯中，用保鲜膜包好放于培养箱中24~26℃培养4~5天。
根瘤菌的准备：从-80℃取一支甘油菌，划板活化后挑取单克隆接种于yma培养液（1000毫升中包含10克的甘露醇、0.2克的mgso4•7h2o、0.1克的nacl、3克的酵母粉、0.25克的k2hpo4和0.25克的kh2po4），温度设置为28℃，转速为每分钟180转，培养4天左右直至od600约为1.0。
移苗与培养：将萌发好的大豆幼苗根系浸泡于根瘤菌液中1小时进行接种，然后移植到包含不同磷浓度的营养液中培养，分别在处理后第5、10、15、20、25天收获根部和根瘤，先用液氮快速冷冻，分别提取总rna。第一链cdna通过promega逆转录试剂盒获得。首先，基因组dna的去除：每5微升反应体系包括1微升的gdnaremover、1微克的总rna和适量的nuclease-free水，混匀后于37℃反应10分钟，然后70℃热变性5分钟；其次进行逆转录反应：在上一步骤的反应液中加入2微升的5×easteprtmastermix和3微升的nuclease-free水，混匀后于37℃反应15分钟，然后98℃（逆转录酶失活）反应5分钟。完成逆转录的产物稀释30倍后通过appliedbiosystemssteponeplusreal-timepcrsystem进行实时荧光定量pcr分析。反应体系为20微升，包括10微升的2×gotaqqpcrmastermix、0.5微升的上下游引物、0.4微升的cxrreferencedye、2微升的cdna模板、6.6微升的nuclease-free水；反应程序为：95℃预变性10分钟，40个循环的（95℃变性15秒，60℃复性及延伸1分钟）。标准样品的制备：以待测基因肯定会表达的cdna原液稀释5倍为第一个标样，再将第一个标样稀释5倍作为第二个标样，以此类推制备5个标样梯度。以看家基因ef1-α（glyma17g23900）为内参，相对表达量用待测基因的表达量与看家基因的表达量的比值表示。大豆的看家基因ef1-α定量引物为：ef1-α-f（seqidno.7）和ef1-α-r（seqidno.8）。大豆gmspx5定量引物为：gmspx5-rt-f（seqidno.9）和gmspx5-rt-r（seqidno.10）。
大豆的看家基因ef1-α-f（seqidno.7）：
5’-tgcaaaggaggctgctaact-3’
大豆的看家基因ef1-α-r（seqidno.8）：
5’-cagcatcaccgttcttcaaa-3’
定量引物gmspx5-rt-f（seqidno.9）：
5’-aagatggccaagctccac-3’
定量引物gmspx5-rt-r（seqidno.10）：
5’-gtcttgcaactccctcca-3’
（2）结果如图1所示。幼苗分别在正常供磷及缺磷营养液中生长5、10、15、20、25天分别收获根部和根瘤，提取总rna进行定量pcr分析。
从图1可以看出，无论在正常供磷（+p）还是缺磷（-p）条件下，gmspx5在根瘤中的表达量远高于在根系中的表达量；在+p和-p条件下，gmspx5在根瘤中的表达量分别是在根系中的24倍和10倍以上。从接种根瘤菌后第15天根瘤基本成型到第25天根瘤完全成熟，gmspx5在根和根瘤中受缺磷增强表达。gmspx5在第15、20和25天-p根瘤中的表达量分别是+p根瘤中的2.1倍、3.1倍和2.6倍，差异显著。
2、gmspx5亚细胞定位分析
通过农杆菌侵染法，将装载pmdc43-gmspx5载体和pmdc43空载体导入烟草表皮细胞中进行瞬时表达。然后用激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞的gfp荧光信号。
结果如图2所示。由结果可知，35s：gfp-gmphr25的荧光分布于细胞核、细胞质以及细胞膜，说明gmspx5蛋白在细胞核、细胞质以及细胞膜都有定位。
实施例3转基因材料的研究
1、转基因材料的获得
采用根癌农杆菌介导的大豆子叶节整株转化法。主要步骤包括：
（1）种子萌发。挑选种皮无破损的大豆种子于氯气中进行表面消毒12~14小时，之后将种子置于超净工作台风吹30分钟以除去多余氯气；然后播种于萌发培养基上，在28℃光照条件下培养4天。
（2）菌液的准备。将构建好的超量表达ox-gmspx5-ptf载体质粒用冻融法转入根癌农杆菌eha101，挑取阳性克隆接种于含相应抗性的yep培养液，28℃，每分钟200的转速培养至od650为1.0，然后离心收集菌落，用cm液体悬浮菌体至od650为1.0。
（3）子叶节侵染及共培养。用解剖刀切下发芽的种子，切口在离子叶节约0.5厘米的下胚轴区域，然后用手术刀垂直剖开种子，并去除子叶上胚轴（幼芽），垂直于子叶节切出7~8个伤口，然后浸入农杆菌菌液30分钟，期间经常搅动菌液，以使外植体充分接触新鲜菌液；然后用镊子将外植体转移到共培养的培养基上，切口向下，水平放置，用保鲜膜封住培养皿，转移到培养箱中（24℃），暗培养3天。
（4）诱导长芽。先将共培养后的外植体在液体幼芽诱导培养基（si）中浸洗2~3分钟，然后转移到加有相应抗生素的si培养基上，外植体的子叶及下胚轴部分须插入培养基中，用透气胶带封口，光照培养生长14天（24℃，18小时光照/6小时黑暗）。14天后切去子叶下胚轴，插入新的si培养基中，分化区域则与培养基表面齐平，同样条件下继续诱导培养14天。
（4）诱芽伸长。将分化的外植体转移到se培养基上，切去子叶，在生长箱中培养2~8周。每隔2周换一次新鲜的se培养基。每一次换培养基时在外植体基部切一个新鲜的水平切口。
（5）诱导生根。待幼芽生长到至少3厘米长时，把它们从组织上切下来，转移到生根培养基（rm）中继续培养。约两周后，当茎上长出多于2条根时，将植株轻轻地从培养基中取出，移植到水培瓶中生长约四周，然后将幼苗移植到温室中用营养液培养至结荚。
2、转基因植株的鉴定
转基因大豆的鉴定依次用三种检测方法，首先是除草剂检测：将除草剂涂抹于完全展开的新叶上，其中一半涂抹除草剂，一半不涂抹除草剂，2~3天后观察叶片的反应，出现除草剂反应（发黄枯萎）的说明不抗除草剂，为阴性转基因植株，相反，没有变化的说明抗除草剂，可能为阳性植株，进行下一步验证。其次为抗除草剂基因（bar基因）pcr检测：提取野生型及待检测转基因植株叶片总rna，反转为cdna，用bar基因引物进行pcr鉴定，能扩增出约500bp的bar基因条带的为阳性植株，可进行下一步检测。荧光定量pcr检测：提取野生型及待检测转基因植株叶部（或其它部位）总rna，反转cdna后用gmspx5荧光定量pcr引物检测gmspx5的表达量；与野生型相比，gmspx5的表达量有显著上调的转基因植株为阳性gmspx5超量表达转基因大豆材料。
引物bar-f（seqidno.11）：
5’-caaccactacatcgagacaagca-3’
引物bar-r（seqidno.12）：
5’-tcatcagatctcggtgacggg-3’
结果如图3所示，与野生型（wt）大豆相比，转基因株系具有除草剂抗性（图3a），pcr结果表明转基因株系中有bar基因表达（图3b），实时荧光定量pcr结果表明，相比wt，超量表达株系ox8和ox12中gmspx5的表达量分别增加了3.4倍和5.8倍（图3c），差异显著。
3、gmspx5功能分析
（1）超量表达gmspx5对大豆及根瘤生长的影响
采用砂培育苗：分别挑选大小一致的野生型大豆（wt）、两个超量表达（ox）t1代转基因株系的种子，种脐朝下播于用1/2大豆水培营养液润湿的石英砂中，深度约为2厘米。萌发5天后，将幼苗根系接种根瘤菌，并移植于低氮（500微摩尔/升的总氮）营养液中培养，设置两个磷水平处理（-p：5微摩尔/升的kh2po4；+p：250微摩尔/升的kh2po4），每个处理4个重复；处理25天后收获，进行根瘤数、根瘤鲜重、植株生物量、氮磷含量的测定。
结果如图4所示，在磷充足条件下（+p），超量表达gmspx5促进大豆及根瘤的生长（图4）。在+p条件下，相比wt，超量表达株系的干重、氮含量、磷含量分别增加了24%、26%和28%以上（图4b、c、d）。与野生型（wt）相比，两个超量表达株系（ox8和ox12）的根瘤数目分别增加了32%和37%（图4e），根瘤鲜重分别增加了39%和66%（图4f）。超量表达gmspx5增加了大豆整个植株的生物量和氮磷含量（图4）。在缺磷条件下（-p），只有一个超量表达株系（ox12）在根瘤数目、根瘤鲜重和植株氮含量上与wt相比差异显著，分别增加了39%、49%和34%（图4c、e、f）。这些结果表明，gmspx5能够调控大豆根瘤的生长以及改善大豆的氮磷营养。
（2）超量表达gmspx5对大豆根瘤内部侵染细胞密度的影响
将新鲜的根瘤组织切片常规脱蜡至水，然后浸入0.5%的甲苯胺蓝液染色30分钟，稍水洗后转移到0.5%的冰醋酸液进行分化3~5分钟，水洗2~3次，用冷风吹干，经二甲苯透明后用中性树胶封固；在显微镜下观察野生型（wt）和超量表达gmspx5株系（ox12）根瘤内部侵染细胞。
结果如图5所示，超量表达gmspx5影响了大豆根瘤固氮区侵染细胞的密度。与wt相比，超量表达gmspx5株系大豆根瘤侵染细胞更加密集（图5a），统计表明，超量表达gmspx5大豆根瘤侵染细胞密度相比wt增加了31%（图5b）。进一步表明gmspx5能够调控大豆根瘤侵染细胞密度，影响根瘤生长。
（3）超量表达gmspx5对大豆产量的影响
田间试验于2016年3月至6月在华南农业大学试验基地（广州市增城区宁西镇）进行。大豆材料为：大豆磷高效品种yc03-3野生型和两个超量表达gmspx5整株转基因株系ox8和ox12（t1代的种子）。试验采用随机区组设置，每个小区预计30株苗，株距为20厘米，行距为30厘米；氮磷钾肥以基肥的形式一次性施入，每亩施肥量为：尿素2.5千克，过磷酸钙20千克，氯化钾5千克。播种前将野生型大豆种子和两个超量表达株系的种子分别用三种根瘤菌（bxyd3、bxbl9和bdyd1）混合制成的菌剂拌种，播种后约半个月，对转基因株系的幼苗进行叶面除草剂抗性筛选，并间苗以除去不抗除草剂的阴性植株。最后收获种子，统计籽粒数和籽粒干重。
结果如图6所示，野生型大豆（wt）和两个超量表达gmspx5转基因株系（ox8和ox12）大豆在宁西实验基地（华南红壤地）种植86天收获（图6a）。从图中可以看出，超量表达gmspx5显著增加大豆产量。与wt相比，两个超量表达gmspx5转基因株系（ox8和ox12）的籽粒数量分别增加了25%和20%，籽粒干重分别增加了21%和20%（图6b）。这些结果说明超量表达gmspx5能够调控大豆根瘤的生长和发育，影响大豆氮磷营养，进而提高大豆的产量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
<120>一种调控豆科根瘤生长的基因gmspx5及其应用
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>753
<212>dna
<213>基因gmspx5序列(gmspx5)
<400>1
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ctaagcatgttcccatcttctccacacaactag753
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<212>prt
<213>基因gmspx5编码蛋白序列(gmspx5)
<400>2
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<212>dna
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<212>dna
<213>引物gfp-gmspx5-r(primergfp-gmspx5-r)
<400>6
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<210>7
<211>20
<212>dna
<213>大豆的看家基因ef1-α-f上游引物(primeref1-α-f)
<400>7
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<210>8
<211>20
<212>dna
<213>大豆的看家基因ef1-α-r下游引物(primeref1-α-r)
<400>8
cagcatcaccgttcttcaaa20
<210>9
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<212>dna
<213>定量引物gmspx5-rt-f(primergmspx5-rt-f)
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aagatggccaagctccac18
<210>10
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<212>dna
<213>定量引物gmspx5-rt-r(primergmspx5-rt-r)
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<212>dna
<213>引物bar-f(primerbar-f)
<400>11
caaccactacatcgagacaagca23
<210>12
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<212>dna
<213>引物bar-r(primerbar-r)
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