一种改良的解磷菌分离鉴别及解磷能力测定方法
【专利摘要】一种改良的解磷菌分离鉴别及解磷能力测定方法，取土壤样品并进行初筛和复筛，筛选出解磷菌，进行解磷能力的测定，以溶磷圈直径和培养液中含磷量来综合反映菌株解磷能力的强弱。本发明以溴酚蓝指示剂作为筛选标记，通过加入溴酚蓝作为解磷菌初筛的指示剂，通过观察溶磷圈进行复筛，可以有效、快速、直观的筛选出目标菌株。同时通过测定液体培养液中磷含量，对解磷菌的分解能力做到定量。
【专利说明】一种改良的解磷菌分离鉴别及解磷能力测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于解磷菌的选择性分离培养及解磷能力检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]磷是植物生长发育所必需的营养元素之一，缺磷会影响植物生长、产量和品质。土壤是植物磷素的主要来源，我国大部分的土壤都处于缺磷的状态，这不是因为土壤中缺乏这种元素，而是土壤中的磷素绝大部分存在于难溶态的钙、铁、铝等磷酸盐或复杂的有机磷化合物中，能为植物吸收利用的有效磷含量一般小于土壤全磷的5%。在农业生产中，磷素化肥施用是必须的，但由于磷矿资源的有限性和不可再生性，以及长期施用化肥引起的土壤板结等问题，人们便开始关注土壤磷素资源的合理利用和土壤改良剂的开发应用。在环境中和生物体内存在能够通过溶解、摄磷、络合等作用，使无效态磷如矿物态磷和有机磷转变为有效磷，满足植物对磷素需求的微生物，这种微生物被称为解磷菌，这一类微生物对改善土壤结构，提高植物对磷的利用率，增强植物抗逆、抗病能力方面有着重要作用。土壤中解磷菌种类及数量的变化及其在土壤中的某些生物化学过程强度在一定程度上反映了土壤养分矿化的速度及存在的状态，直接影响土壤的供磷状况。因此，快速准确的解磷菌分离检测方法对于筛选高效解磷菌、开发生物肥料产品有重要价值，同时对于监测土壤供磷能力也有一定指示作用。但传统的解磷菌分离检测方法分离培养基培养周期长、分离不完全、筛选标记不明显，常常导致解磷菌目标菌株筛选的误判或遗漏等。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是 针对传统方法在分离筛选解磷菌中存在的不足，提供一种以溴酚蓝为筛选标记，同时在培养基中加入一定比例的土壤浸提液以丰富微量元素来源的解磷菌初筛方法，并结合溶磷圈及溶磷能力测定进行复筛和验证，快速、直观、准确的解磷菌分离鉴别及解磷能力测定方法。
[0004]本发明的目的通过如下技术方案实现。
[0005]一种改良的解磷菌分离鉴别及解磷能力测定方法，包括如下步骤:
A、解磷菌的初筛:配制改良的解磷菌分离培养基，配方为葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)2
4-5g/L、(NH4)2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO4 0.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母膏 0.1-0.2g/L、质量浓度0.4%且pH 6.7的溴酚蓝6mL /L,同时加入制备好的质量浓度10%的土壤浸提液100 ml/L、琼脂粉15 g/L，培养基pH 7.(T7.2，将配制好的培养基于115°C灭菌20-30分钟后倒板；称取25g 土壤样品于225ml无菌生理盐水悬浮混匀，制成1:10的样品匀液，用Iml无菌吸管吸取1:10的样品匀液Iml注入盛有9ml无菌水的无菌试管中，制成1:100的样品匀液，以此类推，制备10倍系列稀释样品匀液，取3-4个适宜浓度的稀释液0.1ml涂布于分离培养基上，28-30°C倒置培养2-3天，通过观察菌落周围培养基颜色变化情况，进而初步筛选解磷菌，若菌落周围培养基颜色由紫色逐渐变为黄色，则可初步确定该菌株为解磷菌，由此获取得到初筛菌株；B、解磷菌的复筛:配制解磷菌的固体复筛培养基，配方为葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)2
5-6 g/L、MgCl2 5 g/L、MgSO4 0.25 g/L、KCl 0.2 g/L、(NH4)2SO4 0.1 g/L、琼脂粉 15 g/L,固体复筛培养基pH 7.0 ;将配制好的培养基于115°C灭菌20-30分钟后倒板；基于步骤A所得初筛菌株，采用三点点植法将初筛菌株点接在固体复筛培养基上，28-30°C培养6-7天，观察菌落周围是否有溶磷圈，从而进一步判定是否为解磷菌，若菌落周围培养基沉淀逐渐消失变透明，出现明显的透明圈，则可确定初筛菌株为解磷菌；
C、解磷能力的测定:分别配制液体复筛培养基和固体复筛培养基，液体复筛培养基和固体复筛培养基的配方均与步骤B的固体复筛培养基相同，采用测量溶磷圈直径和钥锑抗比色法测定液体培养液中磷含量来综合反映目标菌株解磷能力的强弱，具体步骤为:选取初筛菌株用点植法点接于固体复筛培养基上，28-30°C培养6-7天，测量溶磷圈直径；同时将初筛菌株按1%的接种量接入液体复筛培养基中，以不接菌的培养液作为对照，于28-30°C, 200 rpm下振荡培养6-7天，取培养液10000 rpm离心10 min，采用钥锑抗比色法测定培养液中含磷量；以溶磷圈直径和培养液中含磷量来综合反映菌株解磷能力的强弱。
[0006]本发明通过在培养基中加入土壤浸提液来替代原培养基中所需铁盐、锰盐等微量元素，丰富了培养基中微量元素来源及其他营养成分，以提高筛选能力。并以溴酚蓝指示剂作为筛选标记，通过加入溴酚蓝作为解磷菌初筛的指示剂，通过观察溶磷圈进行复筛，可以有效、快速、直观的筛选出目标菌株。与传统分离培养基相比，更直观、快速，仅培养2-3天即可判定，初筛准确率达到90%以上；为了剔除假阳性判定结果，本发明配制复筛培养基通过观察是否出现溶磷圈进一步判别初筛结果，复筛准确率达99%以上，同时通过测定液体培养液中磷含量，对解磷菌的分解能力做到定量。该方法具有快速、直观、准确等特点，提供了一种解决传统分离培养基培养周期长、筛选标记不明显而导致误判或遗漏等问题的检测方法。
【具体实施方式】
[0007]下面结合实例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制。
[0008]1、植物根际土中解磷菌的初筛:
(1)分离培养基的配制:
配方为葡萄糖 9-10 g/L、Ca3(PO4)2 4-5g/L、(NH4)2SO4 0.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO40.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母膏 0.1-0.2 g/L、质量浓度 0.4% 且pH 6.7 的溴酚蓝 6mL /L，同时加入制备好的质量浓度10%的土壤浸提液100 ml/L、琼脂粉15 g/L，培养基pH 7.(T7.2，将配制好的培养基于115°C灭菌20-30分钟后倒板；
(2)土壤样品稀释与培养:
土壤样品来源于植物根际土壤，称取25g 土壤样品于225ml无菌生理盐水悬浮混匀，制成1:10的样品匀液，用Iml无菌吸管吸取1:10的样品匀液Iml注入盛有9ml无菌水的无菌试管中，制成1:100的样品匀液，以此类推，制备10倍系列稀释样品匀液，取3-4个适宜浓度(根据预实验中平板上菌落数为20-200个的稀释梯度较为适宜)的稀释液0.1ml涂布于分离培养基上，28-30°C倒置培养2-3天；
(3)初筛菌株:
溴酚蓝颜色会随PH变化而变化，解磷菌在分解难溶性磷的过程中会产酸，从而改变培养基的酸碱度，使得培养基变色。判定依据为:若菌落周围甚至整个平板培养基颜色由紫色逐渐变为黄色，则可初步确定该菌株为解磷菌，由此得到初筛菌株。
[0009]2、植物根际土壤中解磷菌的复筛:
(1)复筛培养基的配制:
配制解磷菌的固体复筛培养基，配方为葡萄糖9-10 g/L、Ca3(PO4)2 5-6 g/L、MgCl2 5g/L、MgS04 0.25 g/L、KCl 0.2 g/L、(NH4)2SO4 0.1 g/L、琼脂粉 15 g/L，固体复筛培养基 pH
7.0 ;将配制好的固体复筛培养基于115°C灭菌20-30分钟后倒板；
(2)培养及结果判别:
采用三点点植法将初筛菌株点接在固体复筛培养基上，28-30°C培养6-7天，若菌落周围培养基中的沉淀逐渐消失变透明，出现明显的透明圈，磷酸钙沉淀已被分解，即为溶磷圈，则可确定初筛菌株为解磷菌；
初筛疑似解磷菌菌株经复筛验证后，发现均有溶磷圈，都具有解磷能力，表明初筛培养基中加入的溴酚蓝指示剂具有较好的判别效果，初筛判别准确率可达到90%以上，可作为监测土壤或其他环境中解磷菌数量较为理想的选择性培养基。复筛后有溶磷圈的菌株经液体培养法检测磷含量，发现菌株的解磷能力强弱与溶磷圈大小相吻合，表明复筛培养基对筛选高效解磷菌具有较好的判别作用，且复筛判别准确率可达到99%以上。
[0010]3、解磷能力的测定
分别配制液体复筛培养基和固体复筛培养基，采用测量溶磷圈直径(D)和钥锑抗比色法测定液体培养液中磷含量来综合反映目标菌株解磷能力的强弱。具体步骤为:选取初筛菌株点植法将初筛菌株点接于固体复筛培养基上，28-30°C培养6-7天，测量溶磷圈直径(D);同时将初筛菌株按1%的接种量接入液体复筛培养基中，以不接菌的培养液作为对照，于28-30°C、200 rpm下振荡培养6-7天，取一定量的培养液10000 rpm离心10 min，采用钥锑抗比色法测定。以测量得到的溶磷圈直径D值和培养液中含磷量来综合反映菌株解磷能力的强弱，溶磷圈直径和磷含量检测结果见表1。
[0011]表1解磷菌@磷能力的测定结果 __
检测项目I对照|P1 |P4
磷含量(tig/mL)0 0.126 0.177`
溶磷圈直径 D (cm) I无 |l.3~1.5 |l.8~2.^~
上表中，PU P4分别代表2株不同的菌。
[0012]从溶磷圈直径大小和磷含量高低，可以看出P4的解磷能力较强，且溶磷圈直径大小与培养液中磷含量高低相吻合。
【权利要求】
1.一种改良的解磷菌分离鉴别及解磷能力测定方法，其特征在于，包括如下步骤: A、解磷菌的初筛:配制改良的解磷菌分离培养基，配方为葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)24-5g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO4 0.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母膏 0.1-0.2g/L、质量浓度0.4%且pH 6.7的溴酚蓝6mL /L,同时加入制备好的质量浓度10%的土壤浸提液100 ml/L、琼脂粉15 g/L，培养基pH 7.(T7.2，将配制好的培养基于115°C灭菌20-30分钟后倒板；称取25g 土壤样品于225ml无菌生理盐水悬浮混匀，制成1:10的样品匀液，用Iml无菌吸管吸取1:10的样品匀液Iml注入盛有9ml无菌水的无菌试管中，制成1:100的样品匀液，以此类推，制备10倍系列稀释样品匀液，取3-4个适宜浓度的稀释液0.1ml涂布于分离培养基上，28-30°C倒置培养2-3天，通过观察菌落周围培养基颜色变化情况，进而初步筛选解磷菌，若菌落周围培养基颜色由紫色逐渐变为黄色，则可初步确定该菌株为解磷菌，由此获取得到初筛菌株； B、解磷菌的复筛:配制解磷菌的固体复筛培养基，配方为葡萄糖9-10g/L、Ca3(PO4)25-6g/L、MgCl2 5 g/L、MgSO4 0.25 g/L、KCl 0.2 g/L、(NH4)2SO4 0.1 g/L、琼脂粉 15 g/L,固体复筛培养基pH 7.0 ;将配制好的培养基于115°C灭菌20-30分钟后倒板；基于步骤A所得初筛菌株，采用三点点植法将初筛菌株点接在固体复筛培养基上，28-30°C培养6-7天，观察菌落周围是否有溶磷圈，从而进一步判定是否为解磷菌，若菌落周围培养基沉淀逐渐消失变透明，出现明显的透明圈，则可确定初筛菌株为解磷菌； C、解磷能力的测定:分别配制液体复筛培养基和固体复筛培养基，液体复筛培养基和固体复筛培养基的配方均与步骤B的固体复筛培养基相同，采用测量溶磷圈直径和钥锑抗比色法测定液体培养液中磷含量来综合反映目标菌株解磷能力的强弱，具体步骤为:选取初筛菌株用点植法点接于固体复筛培养基上，28-30°C培养6-7天，测量溶磷圈直径；同时将初筛菌株按1%的接种量接入液体复筛培养基中，以不接菌的培养液作为对照，于28-30°C, 200 rpm下振荡培养6-7天`，取培养液10000 rpm离心10 min，采用钥锑抗比色法测定培养液中含磷量；以溶磷圈直径和培养液中含磷量来综合反映菌株解磷能力的强弱。
【文档编号】C12Q1/04GK103667157SQ201310725654
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】薛红芬, 陈云娇, 张晓龙, 罗华元, 董石飞, 周芳芳, 周丽娟, 王娟 申请人:云南瑞升烟草技术（集团）有限公司, 红云红河烟草(集团)有限责任公司