一种新型微生态肥的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型微生态肥的制备方法，属于农用肥料【技术领域】,所述新型微生态肥的制备方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌培养物、黑曲霉培养物、植物乳杆菌剂按照比例混合或造粒即可。本发明的肥料由复合微生物发酵发放制备而成，营养丰富，有机质含量高，在能够满足有机食品的生产需要时，还能够改善土壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件；本发明的肥料还能够增强作物的抗病虫害能力。
【专利说明】一种新型微生态肥的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生态肥的制备方法，属于农用肥料【技术领域】。
【背景技术】
[0002]微生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的基础，而不像其它肥料是以氮、磷、钾等主要元素的形式和多少为基础。正因为微生物肥料是活制剂，所以其肥效与活菌数量、强度及周围环境条件密切相关，包括温度、水分、酸碱度、营养条件及原生活在土壤中土著微生物排斥作用都有一定影响。
[0003]中国专利一种黑曲霉菌株及其在果胶酶固态发酵生产中的应用，申请号:200410006199.5，该发明涉及一种黑曲霉菌株及其在固态发酵生产中的应用，其黑曲霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC.N0.1100;本发明的微生物菌株可用于果胶酶的固态发酵生产中培养本发明黑曲霉H)2菌株(Aspergillus niger F02)的营养源有碳源、氮源、无机盐和微量营养物；采用本发明菌株生产原料主要是麦麸、米糠和面粉等农副产品，故投资少、操作方便；以单位体积计算，固态发酵果胶酶的活力要比液态发酵高5-6倍。
[0004]微生物肥体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果表现欠稳定的问题。在农业可持续发展已成为人类共识的今天，这些问题成了微生物肥行业函待打通的“瓶颈”。
【发明内容】
[0005]一种新型微生态肥的制备方法，包括如下步骤:将枯草芽孢杆菌培养物、黑曲霉培养物、植物乳杆菌剂按照比例混`合或造粒即可。
[0006]所述微生态肥的重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物20-28，黑曲霉培养物15-25，植物乳杆菌剂8-15份。
[0007]所述枯草芽孢杆菌培养物制备:从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得含有枯草芽孢杆菌菌剂和酶制剂的培养物。
[0008]植物乳杆菌剂的制备方法:从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体:向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为:CaC0320-23份，糊精10-12份。流化床干燥，干燥温度50°C。
[0009]黑曲霉培养物制备:菌种培养，固体发酵培养:孢子液接种到固态发酵培养料中，26-33°C培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物；采用常见固态发酵法制备获得。
[0010]本产品使用方法简单，每亩地使用量0.3-1公斤，成本仅为80-100元/亩，拌种或生长期灌水前地表喷洒。
[0011]有益效果[0012]本发明的肥料。。
[0013]本发明的肥料由复合微生物发酵发放制备而成，营养丰富，有机质含量高，在能够满足有机食品的生产需要时，还能够改善土壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件。
[0014]本发明的肥料能够增强作物的抗病虫害能力。
[0015]本发明的肥料能够改良土壤。肥料中有益微生物能产生糖类物质，占土壤有机质的0.1%，与植物粘液，矿物胚体和有机胶体结合在一起，可以改善土壤团粒结构，增强土壤的物理性能和减少土壤颗粒的损失，在一定的条件下，还能参与腐殖质形成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。
【具体实施方式】:
[0016]除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的反应条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0017]下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0018]本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L1-2013_02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.7926。
[0019]所述菌株特点如下:
[0020]所述菌株在固体 平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
[0021]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L1-2013_02由一株保藏于天津工业大学实验室的产耐高温a -淀粉酶的枯草芽孢杆菌L1-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下:
[0022](I)菌悬液的制备
[0023]将在平板划线分离后长出的L1-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40°C培养12h后,取ImL培养液离心后用生理盐水洗漆两次,并重悬与9mL生理盐水中。
[0024](2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
[0025]将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。
[0026](3)高产菌种的初筛
[0027]将上述涂布均匀的平板，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03
[0028](4)摇瓶发酵复筛
[0029]将获得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，40°C、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。
[0030](5)酶活测定
[0031]酶活单位的定义:lmL粗酶液,于105°C、pH4.2条件下，Imin液化Img可溶性淀粉，
[0032]即为I个酶活力单位，以U/mL表示。
[0033]经测定，菌株L1-2013-02，为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0034]所述氯化锂平板:淀粉1%，蛋白胨 1%，(NH)2SO40.4%, K2HPO40.8%, CaCl20.2%，氯化锂0.9%，琼脂2%。
[0035]所述的种子培养基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0036]所述的发酵培养基:玉米粉5%~15%，豆饼粉4%~10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0037]所述的摇瓶培养条件:该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10%(V/V)，100r/min、40°C 发酵培养 72h。
[0038]由菌株L1-2013-02发酵获得了一种耐高温的α -淀粉酶，其酶学性质如下:
[0039](I)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105_115°C之间，且在110°C以下保存的温度稳定性较好，而115°C以上保存长时间温度稳定性较差。
[0040](2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0_7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。
[0041](3)酶活性:由本发明所提供的突变株L1-2013-02，制备的耐高温α -淀粉酶酶活力为 30000-35000U/ml。
[0042]1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆菌L1-2013-02，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。
[0043]2、有该菌株生产所得的耐高温α-淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml，；适用温度范围为25-115°C，最适反应温度110°C，在110°C酶活完全稳定；适用反应pH值范围为
3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高温α -淀粉酶酶活力高，酶作用最适PH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
[0044]本发明提供的黑曲霉Aspergillus niger L1-2013-03是由天津工业大学实验室保藏的一株产纤维素酶的黑曲霉Aspergillus niger L1-2010经亚硝基胍多轮诱变筛选，然后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillusniger L1-2013_03o
[0045]本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.7927。
[0046]本发明黑曲霉菌株Aspergillusniger L1-2013-03 (CGMCC N0.7927)具有以下微生物学特征:
[0047]1、形态学特征:
[0048]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450 ym，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000 (长度)X 12-20 (直径)y m，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径45-75 u m,表面全面可育；产胞结构双层，梗基10-20 (长度)X 4.5-7.0 (直径)y m,瓶梗6-10 (长度)X 2.5-3.5 (直径)m，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5 u m,褐色，壁粗糙。
[0049]2、培养学特征:
[0050]菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28 V 4天孢子可铺满斜面；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。
[0051]3、生理生化特征:
[0052]黑曲霉菌株CGMCC N0.7927可在玉米秸杆、稻草、木屑、马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生长，最适pH范围5-6，最适生长温度范围28-33°C，最适产酶温度范围28-30。。。
[0053]本发明黑曲霉菌株CGMCC N0.7927的筛选技术路线为:出发菌株一斜面培养一孢子悬液的制备一诱变处理一平板分离一初筛一复筛一遗传稳定性测定一扩大实验(发酵性能测定)。
[0054]按诱变筛选方案，对突变株逐级`筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株黑曲霉菌AspergiIIus niger L1-2013-03,发酵96小时后纤维素酶的外切P -葡聚糖酶、内切P -葡聚糖酶、P -葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL。
[0055]28°C发酵4天直径75mm，发酵液纤维素酶的的外切(6-葡聚糖酶、内切(6-葡聚糖酶、P -葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株提高了 9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0056]产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤:
[0057]I)斜面培养:将原始黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2010划线接种斜面培养基，30°C培养2~3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下:120Brix 麦芽汁 lOOOmL，pH 值自然，121°C灭菌 20min ；
[0058]2)孢子悬液制备(以下步骤均在无菌条件下操作):向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。
[0059]3)亚硝基胍(NTG )诱变
[0060]A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成106-107个/mL。
[0061]B.取IOmL菌悬液转移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG,配制成终浓度为IOmg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0062]C.在30°C下200rpm振荡反应30min, 5000rpm离心IOmin收集菌体,用无菌生理
盐水洗涤数次，中止反应。[0063]D.适当稀释将孢子浓度调节为103个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL,稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30°C培养2~3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。(所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下:纤维素粉10g、刚果红
0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL, pH 值 5-6，121°C灭菌 20min)。
[0064]E.复筛:将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30°C培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10%( v/v)，30°C、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。(所述复筛培养基组成如下:纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、自来水定容1000mL，pH值5-6，121°C灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。
[0065]4)遗传稳定性试验
[0066]将L1-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
[0067]5)放大试验
[0068]①种子培养:将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger L1-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30°C、150rpm摇床培养72_96h。
[0069]③种子罐培养:将种子液以10% (v/v)接种量接入装有7.5L发酵液的IOL发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1°C，搅拌速度300rpm，通风量(v/v)1:0.8-1.2，培养时间96h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基组成为:纤维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、自来水定容lOOOmL，pH值5-6，121°C灭菌20mino
[0070]发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillusniger L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分别比出发菌株 Aspergillus nigerL1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0071]实施例1
[0072]—种复合肥，重量份数组成为:微生态肥的重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物24，黑曲霉培养物18，植物乳杆菌剂12份。
[0073]枯草芽孢杆菌培养物的制备方法:
[0074]1.发酵液的获得:采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；
[0075](I) 一级种子培养:将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度35°C，培养时间24小时；
[0076](2)二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0077](3)三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度35°C，培养时间24小时；
[0078](4) 一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度35°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V) 1:0.5,罐压
0.05Mpa,培养时间24小时；
[0079](5)发酵培养:将一级种子罐菌种以10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量I吨，培养条件培养温度35°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V) 1:0.5，罐压0.05Mpa,培养时间24小时。
[0080]培养基组成:葡萄糖6%，酵母提取物1%,蛋白胨0.2%，CaC031%, pH6.8。
[0081]植物乳杆菌剂的制备方法:
[0082]常规种子发酵培养方法获得种子液； [0083]发酵罐培养:将一级种子罐菌种以5%接种量接入总容积为3吨罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度28°C，罐压0.05Mpa,培养时间22小时。发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体:向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为:CaC0325份，糊精12份。流化床干燥，干燥温度50 °C。
[0084]培养基组成为:酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%,葡萄糖0.5%,乙酸钠 0.5%,柠檬酸二胺 0.2%, Tween800.1%, K2HP040.2%, MgS04.7H200.02%, MnS04.H200.005%, CaC032%,琼脂 1.5%, pH6.8。
[0085]植物乳杆菌菌种为CICC20390.[0086]实施例2微生态肥的重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物20，黑曲霉培养物25，植物乳杆菌剂15份。
[0087]实施例3:微生态肥的重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物25，黑曲霉培养物20，植物乳杆菌剂10份。
[0088]实施例4:微生态肥的重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物20，黑曲霉培养物25，植物乳杆菌剂15份。
[0089]制备方法:按照上述比例混合或造粒即可。
[0090]产品效果实验
[0091]试验地的选择与试验设计:试验于2009年3月27日一 10月30日在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。
[0092]试验田达到田种植玉米10亩,分别在种植时使用本发明产品每亩0.6公斤，出苗I个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.4公斤，对照组使用常规肥料。
[0093]发明产品使用玉米地玉米产量达到650公斤，对照组达到510公斤；该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了 420公斤，比对照组单产提高了 20%。且试验田土壤结构良好，无大块和板结。
【权利要求】
1.一种新型微生态肥的制备方法，包括如下步骤:将枯草芽孢杆菌培养物、黑曲霉培养物、植物乳杆菌剂按照比例混合或造粒即可。
2.根据权利要求1所述的新型微生态肥的制备方法，其特征在于，微生态肥的重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物20-28，黑曲霉培养物15-25，植物乳杆菌剂8-15份，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) L1-2013-02保藏号为CGMCC N0.7926，所述黑曲霉(Aspergillus niger) L1-2013-03 保藏号为 CGMCC N0.7927。
3.根据权利要求1所述的新型微生态肥的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌培养物制备方法如下:从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得含有枯草芽孢杆菌菌剂和酶制剂的培养物。
4.根据权利要求1所述的新型微生态肥的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌剂的制备方法如下:从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液；添加载体:向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为:CaC0320-23份，糊精10-12份；流化床干燥，干燥温度50°C。
5.根据权利要求2所述的新型微生态肥的制备方法，其特征在于，微生态肥的重量份数组成为:枯草芽孢杆菌培养物25，黑曲霉培养物20，植物乳杆菌剂10份。
6.根据权利要求2所述的新型微生态肥的制备方法，其特征在于，微生态肥的重量份数组成为:枯草芽 孢杆菌培养物25，黑曲霉培养物20，植物乳杆菌剂10份。
【文档编号】C12R1/685GK103773718SQ201310743722
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】邵素英, 孔日祥 申请人:邵素英