大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法
【专利摘要】本发明提供一种制备纯度好、活性高且能够稳定存在的AHAS的方法。该方法包括以下步骤：根据大肠杆菌AHAS催化亚基的基因序列设计上下游引物，设计的上游引物带有Xho?I酶切位点，下游引物带有BamHⅠ酶切位点，以大肠杆菌BL21菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目的片断ahas；将目的片断ahas连接到表达载体PGEX-AT-1上，得到重组质粒PGEX-4T-1-ahas，并在原核表达系统中实现诱导表达；用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）修饰的琼脂糖凝胶树脂对所表达的酶进行纯化，从而获得活性良好的乙酰乳酸合酶。
【专利说明】大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于遗传工程领域，具体涉及大肠杆菌乙酰乳酸合酶基因的克隆、可溶性表达、纯化以及保存方法。
【背景技术】
[0002]乙酸乳酸合酶(acetolactatesynthase, AHAS, EC4.1.3.18)首先在大肠杆菌(E.coli)中被发现。迄今为止，能够在GenBank中搜索到来源于六十个不同生物种类的AHAS基因，这些生物以细菌、藻类、真菌等为主。通常情况下，在一种生物体中可能有很多个与AHAS基因同源性很高的基因，但并不是每个基因都能起到与AHAS相应的作用，同一生物体内的不同部位AHAS基因的拷贝数也存在较大差异。在一些低等生物中，AHAS的核苷酸序列高度保守，其相似度一般在80%左右。大肠杆菌的AHAS是一个四聚体，由两个大亚基和两个小亚基组成，研究发现其大亚基的分子量约为60-70kD，主要起催化作用，故被称为催化亚基；小亚基的分子量约为10-50kD，主要起调节作用，故被称为调节亚基。高等植物的AHAS是控制其体内合成支链氨基酸公共途径的关键酶，催化支链氨基酸如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等的生物合成途径的第一步反应。
[0003]AHAS的底物可以是两分子丙酮酸，在辅酶硫胺素焦磷酸(ThPP)辅助下，首先合成乙酰乳酸，生成的乙酰乳酸再经后续步骤转化为缬氨酸和亮氨酸。该酶也可以一分子丙酮酸和一分子2-丁酮酸为底物，首先合成乙酰羟基丁酸，生成的乙酰羟基丁酸再经后续转化形成异亮氨酸。AHAS酶的活性主要依赖于辅酶ThDP，黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)以及二价阳离子如Mg2+，Mn2+， Zn2+等。E.coli源的AHAS有三种类型，AHAS I无底物偏好，AHAS II与AHASIII均偏好2- 丁酮酸。本专利选择具有最强催化活性的AHAS I作为研究对象。
[0004]AHAS的应用领域:
[0005](一)AHAS 一般分布在细菌，酵母及高等植物体内，并在不同的物种之间有着高度保守的基因序列，但动物体内未发现有AHAS基因，因此AHAS抑制型除草剂对人畜比较安全，所以AHAS便成为筛选除草剂的重要靶点。黄酰脲类和咪唑啉酮类除草剂是目前世界上使用量较大的两类除草剂，其中黄酰脲类除草剂品种很多，成功应用的有近30多种。近年来，随着除草剂的大量滥用，杂草耐药性成为一个很严峻的问题，因此急需寻找新的ASAH抑制剂并在此基础上开发新的除草剂。
[0006](二)此外，近来的研究发现，AHAS除了可催化丙酮酸与丙酮酸或与2-丁酮酸生成乙酰乳酸或2-乙酰基-2-羟基丁酸外，它还可催化丙酮酸与苯甲醛之间的缩合反应生成苯基乙酰甲醇(PAC)。PAC是医药工业中合成α/β-肾上腺素和其它手性邻羟基酮化合物的重要前体，Ε.coli AHAS I已被成功用于工业化生产PAC。不仅如此，AHAS广泛的底物谱也有望使其应用于合成其它手性医药前体。
[0007](三)同时，随着近年来异丁醇高辛烷值、高能量密度、低吸湿性等燃料特性的发现，利用合成生物学思想生产异丁醇成为世界各国研究热点，而AHAS作为异丁醇代谢途径中的关键酶也引起了大家的广泛关注。[0008]然而，上述研究的顺利进行都要建立在能够获得纯度高、稳定性良好的AHAS的基础之上，但是该酶在生物体内分布不均匀且丰度很低，加上本身稳定性差，易失活，这些因素使它的分离纯化和储存都有一定难度。如有文献报道在PH8的Tris-HCl缓冲液中，4°C条件下AHAS只能存活几天。改进的保存方法也有报道，如在保存缓冲液中加入ThDP，或黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，或支链氨基酸如亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或Mg2+等辅助因子，但即使这样，AHAS在4°C条件下也只能存活三十天。利用基因工程技术制备重组AHAS的方法也已有报道，所用的载体多为PET系列载体，但所表达的AHAS蛋白量都比较低，或者是以包涵体形式表达，要经过变性复性等步骤，操作复杂，成本较高，而且这些方法也未能解决该酶稳定性差且易失活的问题，国内外也因此均无商品化的AHAS产品销售。这些问题的存在严重地阻碍了对AHAS的深入全面的研究以及新型AHAS抑制剂的寻找，也在很大程度上限制了它在许多重要工业领域内的广泛应用。
【发明内容】
[0009]为获得纯度高、稳定性良好的AHAS，本发明提出了一种新的大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法。
[0010]本发明的技术思想如下:
[0011]PGEX-4T-1载体是一种常用的原核表达载体，具有Amp抗性，是一种高效的蛋白表达载体，有利于可溶性蛋白的表达；同时，由于其序列中含有谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签序列，故所表达的AHAS为融合蛋白，其中带有GST序列，可用GST修饰的琼脂糖凝胶树脂方便地进行纯化。本发明利用该载体构建大肠杆菌AHAS的表达载体，建立了制备AHAS的方法:
[0012]根据GenBank 中E.coli AHAS酶的基因序列设计引物，以E.coli基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目标酶基因，目的片段全长为1689bp。将目的片段连接到PGEX-4T-1载体上，得到重组质粒pGEX-4T-l-ahas，并在E.coli BL21 (DE3)中实现高效可溶性融合表达；用GST琼脂糖凝胶柱对其进行纯化获得了纯度、浓度和活性皆令人满意的AHAS0并且，进一步研发出合适的保存体系，结果显示所得到的高活性AHAS可在磷酸盐缓冲液中稳定保存，这就解决了 AHAS不稳定、不易稳定保存的缺点。究其原因，可能是因为所获得的AHAS中带有GST标签，它才能够在磷酸盐缓冲液(PBS)中得以稳定保存。
[0013]本发明给出的技术方案具体如下:
[0014]该大肠杆菌乙酰乳酸合酶(AHAS)的制备方法，包括以下步骤:
[0015]根据大肠杆菌AHAS催化亚基的基因序列设计上下游引物，设计的上游引物带有Xho I酶切位点，下游引物带有BamH I酶切位点，具体如下:
[0016]上游引物:5'-GCAGGATCCATGGCAAGTTCGGGCACA-3'
[0017]下游引物:5'-GATCTCGAGTTATTCCCCCACCATTTC-3'；
[0018]以大肠杆菌BL21菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目的片断ahas ；
[0019]将目的片断ahas连接到表达载体PGEX_AT_1上，得到重组质粒PGEX_4T-l_ahas，并在原核表达系统中实现诱导表达；
[0020]用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)修饰的琼脂糖凝胶树脂对所表达的酶进行纯化，从而获得活性良好的乙酰乳酸合酶。[0021]基于上述基本的制备方法，本发明还进一步对各环节作如下优化:
[0022]其中，PCR扩增所配置的反应体系，以总体积50 μ L计，则具体包括以下组分:
[0023]
[0024]
【权利要求】
1.一种大肠杆菌乙酰乳酸合酶(AHAS)的制备方法，包括以下步骤: 根据大肠杆菌AHAS催化亚基的基因序列设计上下游引物，设计的上游引物带有Xho I酶切位点，下游引物带有BamH I酶切位点，具体如下: 上游引物:
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备方法，其特征在于，PCR扩增所配置的反应体系，以总体积50 μ L计，则具体包括以下组分:
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备方法，其特征在于，重组质粒pGEX-4T-l-ahas的制备过程具体如下: 1)用XhoI与BamHI两种限制性内切酶对PCR扩增得到的目的片断ahas和载体PGEX4T-1同时分别进行双酶切，酶切条件为37°C水浴中反应12~16h ;配置的酶切体系，以总体积40 μ L计，则具体包括以下组分:
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备方法，其特征在于，得到的重组质粒pGEX-4T-l-ahas在原核表达系统中的诱导表达过程具体如下: 1)将测序正确的重组质粒pGEX-4T-l-ahas用热击法转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,得到重组表达菌株 E.coli BL21(DE3)-pGEX-4T-l-ahas ； 2)取上述表达菌株2~3μL划线于含有氨苄青霉素的LB (Amp+LB)固体培养基上，37°C倒置培养12~14h ； 3)挑取单克隆转接于5mLAmp+LB液体培养基中，37°C、200rpm/min培养10~12h ;然后取ImL转接于IOOmL Amp+LB液体培养基中，37°C、200rpm/min培养10~12h ;取5ml菌液，转接至500ml Amp+LB液体培养基中，37°C、200rpm/min培养至OD6tltl在0.6~0.8时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.5mM，30°C、200rpm/min诱导4~5h,然后在4°C、10000rpm/min下离心得到菌体沉淀； 4)所得到的菌体沉淀Ig中加入3~4mlPBS溶菌酶裂解液并使菌体沉淀重悬，冰上放置30min后继续置于冰上进行超声破碎，超声功率为200W，频率为超声10s，间隙15s，重复25~30次；破碎后在10000rpm/min,4°C下离心20min,保留上清液，即为粗蛋白。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备方法，其特征在于，用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱对粗蛋白进行纯化的过程具体如下: 把粗蛋白在室温下与谷胱甘肽琼脂糖凝胶混合并在垂直脱色摇床上结合30min，收集流穿液；然后用10倍柱体积、pH7.3~7.5的PBS清洗未与柱子结合的杂蛋白，收集清洗液；再用10~25mM、pH8.0的还原性谷胱甘肽缓冲液洗脱3次，每次3ml，收集洗脱液，即完成纯化，获得活性良好的乙酰乳酸合酶。
6.按照权利要求1所述制备方法获得的大肠杆菌乙酰乳酸合酶的保存方法，其特征在于:将带有GST标签的乙酰乳酸合酶于50-100mM、pH7.0-8.5的磷酸盐(PBS)缓冲液中4°C下透析6~10h，将透析后的酶用液氮速冻，然后于-80°C冻存。
【文档编号】C12N9/88GK103710328SQ201310743685
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】高文运, 李恒, 刘楠, 王文婷 申请人:西北大学