减少1->3读框移位的方法
【专利摘要】本文报道了一种重组生产包含三肽QKK的多肽的方法，其特征在于所述方法包括从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收多肽从而生产所述多肽的步骤，其中包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸cag?aaa?aaa或寡核苷酸caa?aag?aaa编码。
【专利说明】减少1->3读框移位的方法
[0001 ] 本发明属于重组多肽生产领域。本文报道了一种重组生产具有减少的副产物含量的多肽的方法，其中通过修饰在翻译或转录过程中减少移码(frameshift)的编码核酸实现副产物含量的减少。
_2] 发明背景
[0003]蛋白质在现今的医用组合中发挥重要作用。对于人的应用，每种药用物质必须满足不同的标准。为了保证生物药剂对人的安全性，尤其必须将会引起严重危害的核酸，病毒，和宿主细胞蛋白质移除。为了满足质量管理规格标准(regulatory specificat1n),—个或更多个纯化步骤必须按照制造工艺。
[0004]可以例如通过原核细胞(比如大肠杆菌)生产重组多肽。重组生产的多肽占原核细胞的多肽含量的大多数并且经常在原核细胞内沉积为不溶的聚集体，即为所谓的包涵体。为了分离重组多肽，必须将细胞破碎并且必须在从细胞碎片分离包涵体之后将包含在包涵体中的重组多肽溶解。对于增溶离液剂，使用比如脲或盐酸胍。为了切开二硫键，尤其在碱性条件下加入还原剂，比如二硫赤藓醇，二硫苏糖醇，或巯基乙醇。溶解聚集的多肽之后，必须将重组多肽的对于生物活性至关重要的球状结构重建。在该所谓的复性过程中，例如通过针对合适的缓冲液透析(缓慢)降低还原剂的浓度，其允许变性的多肽重折叠为其生物活性结构。复性后，纯化重组多肽到对于预期用途可接受的纯度。例如，对于作为治疗性蛋白质的使用，必须建立大于90 %的纯度。
[0005]重组生产的多肽通常伴有来自生产细胞的核酸，内毒素，和/或多肽。除了宿主细胞来源的副产物，在粗制多肽制备物中还存在多肽来源的副产物。除了别的以外，可以存在研究的多肽的截短的变体。
[0006]WO 95/25786中报道了在细菌表达系统中生产人载脂蛋白Al。Karathanasis，
S.K.，等人，报道了人载脂蛋白A-1基因的分离和表征(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80(1983)6147-6151)。由 Gurvich, 0.L.，等人在 EMBO Journal (22(2003)5941-5950)中报道了在大肠杆菌的编码区中引导显著的移码水平的序列是常见的。Graversen，J.H.，等人，报道了载脂蛋白A-1的三聚化阻滞血浆清除并保持抗动脉粥样硬化的性质(J.Card1vascular Pharmacology 51 (2008) 170-177)。
[0007]发明概沭
[0008]已经发现，编码三肽QKK的寡核苷酸可以是在编码包含三肽QKK的多肽的核酸的转录或翻译过程中1->3移码的点。由于移码的出现，产生具有不编码的氨基酸序列的无义多肽。
[0009]因此，作为一个方面，本文报道了重组生产包含三肽QKK(SEQ ID NO:06)的多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0010]-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽从而生产所述多肽。
[0011]其中包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸cag aag aag (SEQ ID N0:03)，或寡核昔酸 caa aag aaa (SEQ ID NO:04),或寡核昔酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)编码。
[0012]在一个实施方案中，包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸caa aag aaa(SEQID NO:04)或寡核苷酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)编码。
[0013]如本文报道的一个方面是编码在其氨基酸序列中包含三肽QKK的多肽的核酸，其中所述三肽QKK由寡核苷酸cag aag aag (SEQ ID NO:03),或寡核苷酸caa aag aaa (SEQID NO:04)，或寡核苷酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)编码。
[0014]如本文报道的一个方面是编码在其氨基酸序列中包含三肽QKK的多肽的核酸，其中所述三妝QKK由寡核苷酸caa aag aaa (SEQ IDNO:04)或寡核苷酸cag aaa aaa (SEQ IDNO:05)编码。
[0015]如本文报道的一个方面是包含如本文报道的核酸的细胞。
[0016]如本文报道的一个方面是用于编码包含于将在大肠杆菌中表达的多肽中的三肽QKK 的寡核苷酸 cag aag aag (SEQ ID NO:03),或寡核苷酸 caa aag aaa (SEQ ID NO:04),或寡核苷酸cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)的用途。
[0017]如本文报道的一个方面是用于编码包含于将在大肠杆菌中表达的多肽中的三肽QKK 的寡核昔酸 caa aag aaa (SEQ ID NO:04)或寡核昔酸 cag aaa aaa (SEQ ID NO:05)的用途。
[0018]以下具体说明如本文报道的所有方面的实施方案。
[0019]在一个实施方案中，所述三肽QKK由寡核苷酸caa aag aaa (SEQ ID NO:04)编码。
[0020]在一个实施方案中，所述三肽QKK由寡核苷酸eag aaa aaa (SEQ ID NO:05)编码。
[0021]在一个实施方案中，所述(全长)多肽包含约50个氨基酸残基至约500个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述(全长)多肽包含约100个氨基酸残基至约400个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述(全长)多肽包含约250个氨基酸残基至约350个氨基酸残基。
[0022]在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞。在一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞，或芽胞杆菌(bacillus)细胞。
[0023]在一个实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一个实施方案中，所述细胞是CHO细胞，或HEK细胞，或BHK细胞，或NSO细胞，或SP2/0细胞，或酵母细胞。
[0024]在一个实施方案中，所述多肽是异源多聚多肽。在一个实施方案中，所述多肽是抗体或抗体片段。
[0025]在一个实施方案中，所述多肽是同源多聚多肽。在一个实施方案中，所述多肽是同源二聚体或同源三聚体。
[0026]在一个实施方案中，所述多肽是人载脂蛋白A-1或其变体或包含其的融合多肽，其中所述变体或所述融合多肽显示人载脂蛋白A-1的体外和体内功能。在一个实施方案中，所述载脂蛋白A-1变体具有选自SEQ ID NO:09至SEQ ID NO:14的组的氨基酸序列。
[0027]发明详沭
[0028]定义:
[0029]术语"氨基酸"指羧基α-氨基酸类，其可以直接或以前体的形式由核酸编码。个体氨基酸被由三个核苷酸组成的核酸(所谓密码子或碱基三联体)编码。每个氨基酸由至少一个密码子编码。由不同密码子编码相同氨基酸被称为“遗传密码的简并”。术语”氨基酸”指天然存在的羧基α -氨基酸并且包括丙氨酸(三字母代码:ala，单字母代码:A)，精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp, D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gin,Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys, K)，甲硫氨酸(met, Μ)，苯丙氨酸(phe, F)，脯氨酸(pro, P)，丝氨酸(ser, S)，苏氨酸(thr, T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr, Y),和纟颜氨酸(val,V)。
[0030]术语"载脂蛋白A-1"指具有蛋白质-脂和蛋白质-蛋白质相互作用性质的，两亲的，螺旋多肽。载脂蛋白A-1由肝和小肠合成为267个氨基酸残基的前载脂蛋白原(prepro-apolipoprotein),其以载脂蛋白原(pro-apolipoprotein)分泌，所述载脂蛋白原被切割为具有243个氨基酸残基的成熟多肽。载脂蛋白A-1由6至8个不同氨基酸重复(每个由被接头部分(常常是脯氨酸)分开的22个氨基酸残基组成)组成，并且在一些情况下由通过一些残基构成的区段组成。在GenPept数据库入口(database entry)NM-000039或数据库入口 X00566 ;GenBank NP-000030.1 (gi 4557321)中报道了代表性的人载脂蛋白A-1氨基酸序列。存在人载脂蛋白 A-1 (SEQ ID NO:07)的天然存在的变体，比如P27H，P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D，D127N, K131 的缺失，K131M, W132R, E133K,R151C(氨基酸残基 151 从 Arg 改变为 Cys，载脂蛋白 A-1-Paris)，E160K, E163G，P167R，L168R，E171V，P189R，R197C (氨基酸残基 173 从 Arg 改变为 Cys，载脂蛋白 A-1-Milano)和E222K。还包括的是具有保守氨基酸修饰的变体。
[0031]术语“密码子”指由编码限定的氨基酸的三个核苷酸组成的寡核苷酸。由于遗传密码的简并性，一些氨基酸由多于一种密码子编码。这些编码相同氨基酸的不同密码子在个体宿主细胞中具有不同的相对使用频率。因此，特定氨基酸可以由一组不同的密码子编码。同样地，多肽的氨基酸序列可以由不同核酸编码。因此，特定氨基酸可以由一组不同的密码子编码，其中这些密码子中的每个具有给定的宿主细胞中的使用频率。
[0032]表:大肠杆菌密码子使用(密码子I编码的氨基酸I使用频率[% ])
[0033]
【权利要求】
1.一种在大肠杆菌细胞中重组生产包含三肽QKK的(全长)多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: -从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的大肠杆菌细胞的培养物的培养基回收所述多肽，从而生产所述多肽， 其中包含在所述多肽中的三肽QKK由寡核苷酸cag aaa aaa,或寡核苷酸caa aag aaa编码。
2.一种在大肠杆菌中重组生产包含三肽QKK的全长多肽的过程中减少副产物形成的方法，其包括以下步骤: -在编码多肽的核酸中，取代编码三肽QKK的寡核苷酸caa aaa aag (SEQ ID N0.01)，或寡核苷酸 caa aag aag (SEQ ID NO:02),或寡核苷酸 cag aag aag (SEQ ID NO:03)中的一到三个核苷酸以获得寡核苷酸caa aag aaa (SEQ ID NO:04),或寡核苷酸cag aaa aaa (SEQID NO:05)，从而产生取代的编码多肽的核酸，和 -从包含编码所述多肽的取代的核酸的细胞或包含编码所述多肽的取代的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽，从而在重组生产包含所述三肽QKK的多肽的过程中减少副产物形成。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括以下另外步骤中的一个或更多个: -提供包含三肽QKK的多肽的氨基酸序列或编码核酸，和/或 -用编码所述多肽的取代的核酸转染细胞，和/或 -培养转染有所述取代的核酸的细胞(在适于表达所述多肽的条件下)，和/或 -从细胞或培养基回收所述多肽，和/或 -任选地以一个或更多个层析步骤纯化生产的多肽。
4.根据权利要求2至3任一项所述的方法，其特征在于以一至五个层析步骤纯化生产的多肽。
5.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述多肽是载脂蛋白A-1，或具有载脂蛋白A-1功能的其变体，或其融合多肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述多肽具有选自包含SEQID N0:09至SEQ ID NO: 14的组的氨基酸序列。
7.根据权利要求5至6任一项所述的方法，其特征在于所述多肽具有SEQID ΝΟ:11的氨基酸序列。
【文档编号】C12N15/67GK104136460SQ201380011165
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年2月26日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】阿德尔伯特·格罗斯曼, F·黑塞, 埃哈德·科佩茨基, 维尔马·劳, 克里斯蒂安·尚茨 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司