用于蛋白质表达的重组细菌宿主细胞的制作方法

用于蛋白质表达的重组细菌宿主细胞的制作方法
【专利摘要】本公开内容涉及重组革兰阴性细菌细胞，所述细胞包含：a.)编码在选自D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸上具有突变的spr蛋白的突变spr基因，和b.)能够表达或过表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD的基因，其中细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，使用所述细胞的方法，细胞用于表达蛋白特别是抗体，例如抗FcRn抗体的用途，以及通过本文中描述的方法产生的蛋白。
【专利说明】用于蛋白质表达的重组细菌宿主细胞
[0001] 本发明涉及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌（E. COli)。本发明还涉及用于在 这样的细胞中产生目标蛋白的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 细菌细胞例如大肠杆菌通常用于产生重组蛋白。特别地由于细菌细胞作为宿主细 胞允许通过质粒进行基因插入的通用性质，将细菌细胞例如大肠杆菌用于产生重组蛋白有 许多有利方面。大肠杆菌已被用于产生许多重组蛋白，包括人胰岛素。
[0004] 尽管使用细菌细胞来产生重组蛋白存在许多有利方面，但仍然存在显著的缺陷， 包括难以产生蛋白酶敏感性蛋白质。蛋白酶在代谢回转大肠杆菌周质和细胞质中老旧的、 受损的或错误折叠的蛋白质中起着重要作用。细菌蛋白酶对目标重组蛋白进行降解，从而 通常显著地减少活性蛋白的产率。
[0005] 许多细菌蛋白酶已被鉴定。在大肠杆菌中，已鉴定了蛋白酶，包括蛋白酶 III (ptr)、DegP、OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP 和 Ion0
[0006] Tsp (也称为Prc)为60kDa的周质蛋白酶。Tsp的第一种已知底物为青霉素结合蛋 白-3(PBP3)(Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3of Escherichia coli ；Nagasawa H, Sakagami Y1Suzuki A1Suzuki H1Hara H1Hirota Y. J Bacteriol. 1989Nov ； 171 (I I) : 5890-3 和 Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 ； Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol. 1991Aug ； 173 (15) : 4799-813)，但后来发现Tsp还能够切割噬菌体尾部蛋白，从而其被更名为尾特异 性蛋白酶（Tsp) (Silber 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:295-299(1992))。Silber 等 A (Deletion of the prc (tsp)gene provides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12 ；Silber,K. R. , Sauer, R. T. ；Mol Gen Genet 1994 242:237-240)描述了 prc缺失株（KSlOOO)，其中通过用包含Kanlr标记物的片 段替代prc基因的区段来产生突变。
[0007] 期望降低Tsp(Prc)活性以减少目标蛋白的蛋白水解。然而，发现不存在蛋白酶 prc的细胞在低同渗容摩下显示热敏生长。Hara等人分离了包含基因外抑制子（spr)突变 的抗热回复体（Hara 等人，Microbial Drug Resistance，2:63_72(1996))。Spr 是 18kDa 的膜结合周质蛋白酶，并且spr的底物为Tsp和外膜中在细胞分裂过程中参与细胞壁水解 的肽聚糖。Spr 基因被命名为 UniProtKB/Swiss-ProtP0AFV4(SPR_EC0LI) 〇
[0008] 已描述了包含突变的spr基因的改良蛋白酶缺陷型菌株。Chen等人描述了具有 Prc(Tsp)和另一种蛋白酶DegP的突变的不同组合的大肠杆菌菌株的构建，其通过扩增基 因的上下游区域，随后将这些区域一起连接在包含选择标记和sprW174R突变（重组抗体 片段在大肠杆菌（Escherichia coli)周质中的高水平积累需要三重突变（ADegPAprc sprWl74R)宿主菌株）的载体上来产生（Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng. 2004Mar 5 ;85 (5) : 463-74)。已发现Δ DegP、Δ prc和sprW174R突变的组合提供最高水平的抗体轻 链、抗体重链和F(ab'）2-LZ。EP1341899公开了一种大肠杆菌菌株，其缺乏分别编码蛋白酶 DegP和Prc的染色体DegP和prc，并且具有突变spr基因，所述基因编码抑制由具有prc 突变体的菌株显示的生长表型的蛋白。
[0009] 包含Tsp和spr的突变的其它改良蛋白酶缺陷型菌株已描述于W02011/086136 中。
[0010] W002/48376中公开的菌株为lac_，其不能在其中将胸苷、岩藻糖或麦芽糖用作碳 源的培养物中生长。这对于期望以商业规模使用的菌株可以是严重的不利方面。还存在与 所述菌株相关的其它不利方面，例如缺乏碱性磷酸酶的产生。后者是参与利用来自培养基 的磷酸盐的周质蛋白。
[0011] 某些蛋白显示肽酰脯氨酰异构酶和/或异构酶活性和/或伴侣蛋白活性，并且已 被发现当在用于重组蛋白表达的细胞系中使用时提供有利性质。
[0012] 本发明提供了具有Tsp和spr突变以及至少一个编码能够促进蛋白质折叠的蛋白 的基因的新型细菌菌株，这为产生重组蛋白提供了有利的工具。
[0013] 发明概述
[0014] 在本发明的第一方面，提供了重组革兰阴性细菌细胞，其包含：
[0015] a.编码在选自 D133、H145、H157、N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、 L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸上具有突变的spr蛋白的 突变spr基因，和
[0016] b.能够表达或过表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白例如FkpA、Skp、 SurA、PPiA 和 PPiD 的基因，
[0017] 其中细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，提供了重组革兰阴性细菌细胞，其编码：
[0019] a.编码在选自 D133、H145、H157、N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、 L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸上具有突变的spr蛋白的 突变spr基因，
[0020] b.能够表达或过表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白例如FkpA、Skp、 SurA、PPiA 和 PPiD 的基因，
[0021] c.能够表达目标蛋白例如抗体或其结合片段的基因
[0022] 其中细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，并且细胞基因组DNA的其 余部分与重组细胞所源自的野生型细胞是同基因的。
[0023] 在一个实施方案中，细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的，除了突变的spr 基因、相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰和表达能够促进蛋白质折叠的蛋白 的基因以外。
[0024] 在第二方面，本发明提供了重组革兰阴性细菌细胞，其相较于野生型细胞具有降 低的Tsp蛋白活性并且包含编码spr蛋白的突变spr基因，其中细胞的基因组与野生型细 菌细胞是同基因的，除了相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰、突变的spr基因 和被引入来表达能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因以外。
[0025] 本发明的第一和第二方面提供的细胞显示有利的生长和蛋白质产生表型。
[0026] 在第三方面，本发明提供了用于产生目标蛋白的方法，包括在如上定义的重组革 兰阴性细菌细胞中表达目标蛋白。
[0027] 在第四方面，本发明还扩展至从本文中描述的方法表达的蛋白质。
[0028] 附图概述
[0029] 图1显示在5L规模上利用宿主细胞和"伴侣蛋白"的不同组合进行的发酵的结 果。W3110为野生型大肠杆菌菌株。不同的组合是：不具有伴侣蛋白的野生型；具有FkpA和 Skp的野生型；如在W02011/086136中公开的MXE016突变体spr和ATsp ;MXE016和FkpA ; MXE016 和 Skp ;MXE016 和 FkpA 以及 Skp ;W02011/086136 中公开的 MXE017 ;MXE017 和 FkpA 以及Skp
[0030] 图2显示了以诱导后补料速率5. 4、6. 0和7. Og/h进行的补料速率变化实验的结 果，对于MXE016,在更高补料速率下产生的额外Fab'的大部分丢失在上清液中。
[0031] 图3A，B显示MXE016+/-FkpA的细胞活力（3A)和Fab'的滴度（3B)。
[0032] 图4显示20L中试生产的初步回收数据。
[0033] 图5显示20L中试生产在非还原条件下在SDS-PAGE染色凝胶上的初步回收。除 FkpA相关条带外，蛋白谱在两个菌株间显得非常相似。
[0034] 图6显示20L中试规模工艺的非还原条件下的His-标记western印迹。检测到 全长FkpA，其对应于?30kDa的条带，如所预期的，在单独的MXE016中未检测到信号。
[0035] 图7A-C显示不同基因的不同突变。
[0036] 图7D显示包含编码抗体的轻链（LC)、抗体的重链（HC)的多核苷酸序列、FkpA多 核苷酸序列和/或Skp多核苷酸的载体的产生的图示。
[0037] 图8显示不同的多核苷酸和氨基酸序列。
[0038] 序列概述
[0039] SEQ ID NO: 1为在起始密码子上游包括6个核苷酸ATGAAC的野生型Tsp基因的 DNA序列。
[0040] SEQ ID N0:2为野生型Tsp蛋白的氨基酸序列。
[0041] SEQ ID NO: 3为在起始密码子上游包括6个核苷酸ATGAAT的突变敲除Tsp基因的 DNA序列。
[0042] SEQ ID N0:4为野生型蛋白酶III基因的DNA序列。
[0043] SEQ ID NO:5为野生型蛋白酶III蛋白的氨基酸序列。
[0044] SEQ ID NO:6为突变敲除蛋白酶III基因的DNA序列。
[0045] SEQ ID NO: 7为野生型DegP基因的DNA序列。
[0046] SEQ ID N0:8为野生型DegP蛋白的氨基酸序列。
[0047] SEQ ID NO:9为突变的DegP基因的DNA序列。
[0048] SEQ ID NO: 10为突变的DegP蛋白的氨基酸序列。
[0049] SEQ ID N0:11为用于包含Ase I限制性位点的突变的DegP基因的区域的5'寡核 苷酸引物的序列。
[0050] SEQ ID NO: 12为用于包含Ase I限制性位点的突变的DegP基因的区域的3'寡核 苷酸引物的序列。
[0051] SEQ ID NO: 13为用于包含Ase I限制性位点的突变的Tsp基因的区域的5'寡核 苷酸引物的序列。
[0052] SEQ ID NO: 14为用于包含Ase I限制性位点的突变的蛋白酶III基因的区域的 3'寡核苷酸引物的序列。
[0053] SEQ ID NO: 15为用于包含Ase I限制性位点的突变的蛋白酶III基因的区域的 5'寡核苷酸引物的序列。
[0054] SEQ ID NO: 16为用于包含Ase I限制性位点的突变的Tsp基因的区域的3'寡核 苷酸引物的序列。
[0055] SEQ ID NO: 17为野生型spr基因的DNA序列。
[0056] SEQ ID NO: 18为包含作为前26个氨基酸残基的信号序列的野生型spr基因的序 列。
[0057] SEQ ID NO: 19为不具有信号序列的非突变的spr基因的序列。
[0058] SEQ ID NO: 20为包含D210A和H212A突变的突变的OmpT序列的核苷酸序列。
[0059] SEQ ID NO: 21为包含D210A和H212A突变的突变的OmpT序列的氨基酸序列。
[0060] SEQ ID NO: 22为突变敲除OmpT序列的核苷酸序列。
[0061] SEQ ID NO: 23显示OmpA寡核苷酸接头的序列。
[0062] SEQ ID NO:24显示编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列I(IGSl)的寡核苷酸 盒。
[0063] SEQ ID NO: 25显示编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列2 (IGS2)的寡核苷酸 盒。
[0064] SEQ ID NO: 26显示编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列3 (IGS3)的寡核苷酸 盒。
[0065] SEQ ID NO: 27显示编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列4 (IGS4)的寡核苷酸 盒。
[0066] SEQ ID NO: 28为野生型FkpA基因的DNA序列。
[0067] SEQ ID NO: 29为野生型FkpA基因的蛋白质序列。
[0068] SEQ ID NO: 30为FkpA his标记的基因的DNA序列。
[0069] SEQ ID N0:31为FkpA his标记的基因的蛋白质序列。
[0070] SEQ ID NO: 32为野生型skp基因的DNA序列。
[0071] SEQ ID N0:33为野生型skp基因的蛋白质序列。
[0072] SEQ ID NO: 34为skp his标记的基因的DNA序列。
[0073] SEQ ID N0:35为skp his标记的基因的蛋白质序列。
[0074] SEQ ID NO: 36至74显示FcRn抗体或其片段的不同氨基酸和DNA序列，其适合用 于在本发明的细胞系中表达。特别地，SEQ ID N0:50为抗-FcRn抗体轻链1519gH20的轻 链可变区的氨基酸序列，SEQ ID N0:58为抗-FcRn抗体重链1519gH20的重链可变区的氨 基酸序列。
[0075] 本发明的优选实施方案的详述
[0076] 本发明人已提供了适合用于表达目标重组蛋白的改良重组革兰阴性细菌细胞。
[0077] 在一个实施方案中，蛋白质为抗体或其结合片段，特别地治疗性抗体。
[0078] 特别地，本发明人已通过将一个或多个编码用于促进蛋白质折叠的蛋白的基因整 合入具有突变的Tsp基因和突变的spr基因的革兰阴性细菌细胞，来提供适合用于表达目 标重组蛋白的改良重组革兰阴性细菌细胞。
[0079] 在一个实施方案中，将编码用于促进蛋白质折叠的蛋白的基因整合入细胞基因 组，例如以提供稳定的细胞系。在一个实施方案中，将待表达的重组蛋白（例如治疗性蛋 白）转染入稳定的细胞系以提供期望的重组蛋白的表达。
[0080] 在一个实施方案中，将编码用于促进蛋白质折叠的蛋白的基因提供在一个或多个 质粒上，例如将质粒瞬时转染入细胞以提供本公开内容的细胞系。
[0081] 在一个实施方案中，在也包含目标重组蛋白的编码序列的质粒上提供编码用于促 进蛋白质折叠的蛋白的基因。
[0082] 在一个实施方案中，在不包含目标重组蛋白的编码序列的质粒上提供编码用于促 进蛋白质折叠的蛋白的基因。
[0083] 在一个实施方案中，本发明提供了相较于野生型细菌细胞和仅具有突变的Tsp基 因或突变的Tsp和突变的spr基因的细胞，具有改良的细胞生长表型的新型菌株。
[0084] 本发明的细胞具有许多有利方面。本发明已令人惊讶地发现，根据本公开内容的 细胞相较于野生型细胞或包含突变的Tsp基因和突变的spr基因的细胞可显示增强的细胞 活力。
[0085] 细胞活力在实用方面具有特别的重要性，因为无活力的细胞在培养中倾向于裂 解和产生DNA碎片。该DNA碎片增加纯化期望蛋白质的困难、成本和消耗。因此，使来 自裂解的无活力细胞的DNA碎片降至最低是高效地生产重组蛋白的重要问题，参见例如 US6, 258, 560。
[0086] 细胞活力可通过许多常规技术的任一技术，例如使用荧光染料和FACS分析或类 似方法来测量。
[0087] 特别地，根据本公开内容的细胞相较于具有突变的Tsp基因和突变的spr基因的 细胞通常显示减少的细胞裂解表型。
[0088] 此外，相较于具有突变的Tsp基因和突变的spr基因的细胞，新型菌株可减少蛋白 质从细胞渗漏并且允许延长的周质积累。这是特别重要的，因为例如当靶蛋白的总表达水 平相似，而由于菌株具有更少的渗漏，更多的蛋白质被积累至周质中或更少的蛋白质被积 累在上清液中，那么具有这些更少渗漏性质的细胞将通常更适合于工厂规模生产，因为它 们促进蛋白质回收。
[0089] 此外，，相较于野生型细菌细胞或在编码蛋白例如FkpA的基因不存在的情况下包 含突变的Tsp基因和突变的spr基因的细胞，根据本公开内容的细胞可显示增加的目标蛋 白的广率。改良的蛋白质广率可以是周质蛋白广率和/或上清液蛋白质广率。在一个实施 方案中，本发明的细胞因减少从细胞的渗漏而相较于具有突变的Tsp基因和突变的spr基 因的细胞显不改良的周质蛋白质广率。
[0090] 重组细菌细胞可以能够具有更快的目标蛋白生产速率，从而相较于野生型细菌细 胞或包含突变的Tsp基因和突变的spr基因的细胞，可以在更短的时间内产生相同量的目 标蛋白。目标蛋白的更快速的生产速率在细胞生长的初始期，例如在诱导蛋白质表达后的 前5、10、20或30小时内可以是特别显著的。
[0091] 根据本发明的细胞优选在周质和/或培养基中表达约l.〇g/L、1.5g/L、1.8g/L、 2. 0g/L、2. 4g/L、2. 5g/L、3. 0g/L、3. 5g/L 或 4. Og/L 的最大产率的目标蛋白。
[0092] 此外，促进折叠的蛋白质的表达通过使以正确折叠提供的蛋白质最大化来进一步 优化表达。本领域技术人员充分意识到适当的折叠是生物功能所必需的，从而分离具有期 望的折叠的蛋白质是至关重要的。当蛋白质在革兰阴性细胞中表达时这是特别重要的，因 为表达的蛋白质对于细胞是非天然的，从而细胞不可以自主地表达具有适当折叠的蛋白 质。不恰当的折叠可将自身表达为聚集体或其它杂质。期望的蛋白质的分离可能需要广泛 的纯化，这具有成本的影响，并且还可导致低产率的期望的蛋白质。使表达的恰当折叠的蛋 白的量最大化使得需要纯化的量降至最低，并且可最优化可使用的产率，从而是有利的。
[0093] 与促进折叠的蛋白质的表达相关的有利方面包括下列方面的一个或多个方面： 更高的滴度（例如相较于野生型的〇.5g/L增加至约1.05g/L);收获时更高的活力（例如 >95%);随补料速率增加而增加的滴度（更好的工艺开发前景）；在商业生产规模例如20L 规模上更高的滴度和收获时更高的活力；和更容易纯化提取物（特别是在20L规模上）。
[0094] 由本发明提供的细胞相较于野生型细胞具有减弱的Tsp蛋白酶活性，这可减少目 标蛋白，特别是在蛋白水解上对Tsp敏感的目标蛋白的蛋白水解。因此，本发明提供的细胞 相较于野生型细菌细胞，可提供更高的完整蛋白质优选目标蛋白的产率和更低的蛋白质优 选目标蛋白的蛋白水解片段的产率或优选无蛋白水解片段。
[0095] 在本发明的一个实施方案中，细胞仅具有引入根据本公开内容的修饰所需的对基 因组的最少突变。细菌细胞可与野生型细菌细胞仅相异于一个或多个针对spr基因的突变 和相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰，因为例如编码用于促进蛋白质折叠的 蛋白的基因可以例如在质粒上被瞬时引入细胞。在一个实施方案中，细胞不具有任何其它 的可对细胞的生长和/或表达目标蛋白的能力具有有害作用的突变。
[0096] 因此，本发明的一种或多种重组宿主细胞相较于包含其它的针对基因组序列的基 因工程突变的细胞可显示增加的蛋白质表达和/或改善的生长特征。本发明提供的细胞相 较于包含其它的对细胞基因组的破坏的细胞，也更适合用于产生治疗性蛋白。
[0097] 本领域技术人员通过使用本领域公知的方法（包括发酵法、ELISA和蛋白G HPLC) 能够容易地测试候选细胞克隆以判断其是否具有期望的目标蛋白产率。适当的发酵法描 述于 Humphreys D P,等人（1997) · Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond,Fabi expression levels, tail piece sequences and growth conditions.J. IMMUNOL. METH. 209:193-202 ； Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N. Bowering L. Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli,Journal Article. Research Support,Non-U.S.Gov't Journal of Biotechnology.135(4):358-65, 2008Jul 31 ；Champion KM.Nishihara JC.Joly JC.Arnott D.Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article]Proteomics. I(9):1133-48, 2001Sep ；和 Horn U. Strittmatter ff. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli,using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions, Journal Article. Research Support, Non-U. S. Gov't Applied Microbiology&Biotechnology. 46 (5 -6) :524-32, 1996Dec中。本领域技术人员通过使用本领域公知的方法例如蛋白G HPLC、圆 二色性、NMR、X射线晶体学和表位亲和力测量法，还能够容易地测试分泌的蛋白质以判断蛋 白质是否正确折叠。
[0098] 现将更详细地描述本发明。
[0099] 除非上下文另有所指，否则术语"蛋白质"和"多肽"在本文中可互换使用。"肽" 意欲指10个或更少的氨基酸。
[0100] 除非上下文另有所指，否则术语"多核苷酸"包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。
[0101] 如本文中所用，'降低的活性'意指'当在适当的测定中在可比较的条件下测量时， 相较于野生型菌株中对应的酶促活性更低水平的酶促活性，例如Tsp酶促活性'。在一个 实施方案中，降低的活性为野生型比较物的酶促活性的50 %或更少、40 %或更少、30 %或更 少、20 %或更少、10 %或更少或5 %或更少。在一个实施方案中，当结果将用于直接比较时， 并行地进行测定酶促活性的水平的分析。
[0102] 如本文中所用，直接比较是指在其中为了评价是否存在本文中定义的降低的活性 或将获自测定的活性结果进行分级的目的而比较两个或更多个结果的数值。
[0103] 如本文中所用，在本说明书的上下文中，术语"包含"应当解释为"包括"。
[0104] 本文中使用的野生型细胞可与非突变的细胞或对照细胞互换使用。
[0105] 本发明的上下文中的非突变细胞或对照细胞意指与本发明的重组革兰阴性细胞 的类型相同的细胞，其中该细胞未被修饰来具有上述降低的Tsp蛋白活性和具有突变spr 基因。例如，非突变细胞可以是野生型细胞，并可来源于与引入任何突变的修饰之前的本发 明的细胞相同的宿主细胞群体。
[0106] 表述"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物"和"菌株"可互换使用。
[0107] 在本发明的上下文中，表述"包含突变的Tsp基因的细胞的表型"意指由具有突变 Tsp基因的细胞显示的表型。通常地，包含突变Tsp基因的细胞可裂解（特别是在高细胞密 度下）。这些细胞的裂解导致任何重组蛋白渗漏至上清液中。具有突变的Tsp基因的细胞 在低同渗容摩下还可显示热敏生长。例如，在低渗培养基中，细胞在高温例如40°C或更高温 度下不显示生长速率或显示减小的生长速率或死亡。
[0108] 在本发明的上下文中，术语"同基因的"意指除突变的spr基因和相较于野生型细 胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰外，本发明的细胞的基因组相较于细胞所源自的野生型细 胞具有大体上相同或相同的基因组序列。在本实施方案中，细胞的基因组不包含其它非天 然存在或基因工程化的突变。在一个实施方案中，除突变的spr基因和相较于野生型细胞 降低Tsp蛋白活性所需的修饰以及任何天然存在的突变以外，根据本发明的细胞相较于野 生型细胞可具有大体上相同的基因组序列。在一个实施方案中，除突变的spr基因和相较 于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰外，根据本发明的细胞相较于野生型细胞可具 有完全相同的基因组序列。
[0109] 本发明的上下文中的术语"野生型"意指革兰阴性细菌细胞的菌株，其可天然地存 在或可从环境分离，其不具有任何基因工程突变。大肠杆菌的野生型菌株的实例为W3110 例如W3110K-12菌株。
[0110] 任何适当的革兰阴性细菌可用作用于产生本发明的重组细胞的亲代细胞。适当的 革兰阴性细菌包括鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium)、焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)、胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora)、志贺菌属（Shigella)、肺炎克 雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团病杆菌（Legionella pneumophila)、铜绿假单 胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii)和大肠杆菌。 优选地，亲代细胞是大肠杆菌。大肠杆菌的任何适当菌株可用于本发明，但优选使用野生型 W3110 菌株例如 K-12W3110。
[0111] 与先前产生的用于表达重组蛋白的蛋白酶缺陷型细菌菌株相关的缺点是，它们包 含另外的参与细胞代谢和DNA复制的基因（例如大肠杆菌菌株中的phoA，fhuA，lac, rec，ga l，ara，arg，thi和pro)的突变。这些突变可对宿主细胞具有许多不利影响，包括对细胞生 长、稳定性、重组蛋白表达产率和毒性的影响。具有一种或多种这些基因组突变的菌株，特 别是具有大数量的这些突变的菌株可显示适合性（fitness)的损失，这使细菌生长速率降 至不适合用于工业蛋白质生产的水平。此外，上述基因组突变的任何突变可以以不可预测 的有害方式顺式和/或反式地影响其它基因，从而改变菌株的表型、适合性和蛋白质特征 谱。此外，严重突变的细胞的使用通常不适合用于产生用于商业用途特别是治疗学的重组 蛋白，因为这样的菌株通常具有有缺陷的代谢途径，从而在基本培养基或化学成分确定的 培养基中可能生长不良或根本不生长。
[0112] 在一个实施方案中，根据本发明的细胞与野生型细菌细胞是同基因的，除突变的 spr基因和相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰外。仅对细胞的基因组产生最 少的突变来引入突变。细胞不具有可对细胞的生长和/或表达目标蛋白的能力具有有害作 用的任何其它突变。因此，本发明的一种或多种重组宿主细胞相较于包含其它的针对基因 组序列的基因工程突变的细胞可显示增加的蛋白质表达和/或改善的生长特征。本发明提 供的细胞相较于包含其它的针对细胞基因组的破坏的细胞也更适合用于产生治疗性蛋白。
[0113] 在优选实施方案中，细胞与野生型大肠杆菌细胞例如菌株W3110是同基因的，除 突变的spr基因和相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰外。
[0114] 本发明的细胞可通过包含编码目标蛋白的多核苷酸而与野生型细胞进一步不同。 编码目标蛋白的多核苷酸序列可以是外源的或内源的。编码目标蛋白的多核苷酸可包含在 被转化入细胞和/或整合入宿主细胞的基因组的适当表达载体内。在其中编码目标蛋白的 多核苷酸被插入宿主的基因组的实施方案中，本发明的细胞还将因插入的编码目标蛋白的 多核苷酸序列而与野生型细胞不同。优选地，多核苷酸在细胞中存在于表达载体中，从而对 宿主细胞的基因组导致最小的破坏。
[0115] Spr蛋白是大肠杆菌膜结合周质蛋白酶。
[0116] Spr蛋白的野生型氨基酸序列示于SEQ ID NO: 21 (具有位于N末端信号序列）和 SEQ ID NO: 22 (不具有26个氨基酸的信号序列）（根据UniProt登录号P0AFV4)中。本发 明中spr蛋白序列的氨基酸编号包括信号序列。因此，spr蛋白的氨基酸1是SEQ ID N0:21 中显示的第1个氨基酸（Met)。
[0117] 被突变的spr基因优选为细胞的染色体spr基因。
[0118] 突变的spr基因编码能够抑制还包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白。 具有突变的Tsp基因的细胞可具有良好的细胞生长速率但这些细胞的一个缺陷是它们倾 向于裂解，特别在高细胞密度下。因此，包含突变的Tsp基因的细胞的表型为倾向于裂解， 特别在高细胞密度下。具有突变的Tsp基因的细胞还在低同渗容摩下显示热敏性生长。然 而，本发明的细胞具有的spr突变，当被引入具有降低的Tsp活性的细胞时，抑制降低的Tsp 表型，从而细胞显示减少的裂解，特别在高细胞密度下。细胞的生长表型可在摇瓶或高细胞 密度发酵技术过程中由本领域技术人员来容易地测量。可根据由具有spr突变体和具有降 低的Tsp活性的细胞相较于具有Tsp突变体和野生型spr的细胞而显示的增加的生长速率 和/或重组蛋白产量（特别是周质中的）判断细胞裂解表型的抑制。
[0119] 根据本发明的细胞包含编码spr蛋白的突变spr基因，所述spr蛋白在选自N31、 R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、 G147和H157的一个或多个氨基酸上具有突变，优选选自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、 H145、G147和H157的一个或多个氨基酸上的突变。在该实施方案中，spr蛋白优选不具有 任何其它突变。
[0120] 上述氨基酸的一个或多个的突变可以是针对编码氨基酸的核苷酸的1、2或3个核 苷酸的任何适当的错义突变。突变将氨基酸残基改变成导致能够抑制包含突变的Tsp基因 的细胞的表型的突变的spr蛋白的任何适当的氨基酸。错义突变可将氨基酸改变成相较于 野生型氨基酸尺寸不同和/或具有不同化学性质的氨基酸。
[0121] 在一个实施方案中，突变spr基因编码具有选自 C94A, S95F, V98E, Yl 15F, D133A, V13? 或 G, H145A, G147C 和 H157A 的一个或多个突变的 spr 蛋白。
[0122] 在一个实施方案中，突变是针对C94、H145和H157的氨基酸残基的催化三联体的 1、2 或 3 个氨基酸的（Solution NMR Structure of the NlpC/P60Domain of Lipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717)〇
[0123] 因此，突变的spr基因可包含：针对C94的突变；或针对H145的突变；或针对H157 的突变；或针对C94和H145的突变；或针对C94和H157的突变；或针对H145和H157的突 变；或针对C94、H145和H157的突变。
[0124] 在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它突变。
[0125] C94、H145和H157的1、2或3个可被突变成导致能够抑制包含突变的Tsp基因 的细胞的表型的spr蛋白的任何适当的氨基酸。例如，C94、H145和H157的1、2或3个可 被突变成小的氨基酸例如Gly或Ala。因此，spr蛋白可具有突变C94A、H145A和H157A的 1、2或3个。在一个实施方案中，spr基因包含错义突变C94A，已发现其产生能够抑制包含 突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白。在另一个实施方案中，spr基因包含错义突变 H145A，已发现其产生能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白。
[0126] 本文中的置换突变体的名称由字母后跟数字后跟字母组成。第一个字母表示野生 型蛋白中的氨基酸。数字是指在其上产生氨基酸置换的氨基酸位置，第二个字母表示用于 替代野生型氨基酸的氨基酸。在一个实施方案中，突变spr蛋白在选自N31、R62、I70、Q73、 S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和 G147 的一个或多个氨基 酸上包含突变，优选选自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一个或多个氨基酸上的突 变。在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它突变。因此，突变的spr基因可包含： 针对N31的突变；或针对R62的突变；或针对170的突变；或针对Q73的突变；或针对S95 的突变；或针对V98的突变；或针对Q99的突变；或针对RlOO的突变；或针对L108的突变； 或针对Y115的突变；或针对D133的突变；或针对V135的突变；或针对L136的突变；或针 对G140的突变；或针对R144的突变；或针对G147的突变。
[0127] 在一个实施方案中，突变spr蛋白包含针对氨基酸：S95和Y115 ;或N31、Q73、R100 和 G140 ;或 Q73、R100 和 G140 ;或 RlOO 和 G140 ;或 Q73 和 G140 ;或 Q73 和 RlOO ;或 R62、Q99 和R144 ;或Q99和R144的多重突变。
[0128] 可将氨基酸 N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、 G140、R144和G147的一个或多个突变成导致能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的 spr 蛋白的任何适当的氨基酸。例如，N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、 D133、V135、L136、G140和R144的一个或多个可被突变成小的氨基酸例如Gly或Ala。
[0129] 在一个实施方案中，spr蛋白包含下列突变的一个或多个：N31Y、R62C、I70T、 Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C 和G147C。在一个实施方案中，spr蛋白包含下列突变的一个或多个：S95F、V98E、Y115F、 D133A、V13?或V135G和G147C。在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它突变。
[0130] 在一个实施方案中，spr 蛋白具有选自 N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、 R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C 和 G147C 的一个突变。 在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它突变。
[0131] 在其它实施方案中，spr蛋白具有选自S95F和Y115F ;N31Y、Q73R、R100G和G140C ; Q73R、R100G 和 G140C ;R100G 和 G140C ;Q73R 和 G140C ;Q73R 和 R100G ;R62C、Q99P 和 R144C ; 或Q99P和R144C的多重突变。
[0132] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变C94A的spr蛋白。
[0133] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变V103E的spr蛋白。
[0134] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变D133A的spr蛋白。
[0135] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变V135D的spr蛋白。
[0136] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变V135A的spr蛋白。
[0137] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变H145A的spr蛋白。
[0138] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变G147C的spr蛋白。
[0139] 在一个实施方案中，突变的spr基因编码具有突变H157A的spr蛋白。
[0140] 在一个实施方案中，突变spr基因编码具有选自H145A、H157A和D133A的突变的 spr蛋白。
[0141] 在本发明的一个实施方案中，可对spr基因产生任何适当的突变以导致能够抑制 包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白。优选地，spr蛋白可具有下列突变的一个或 多个：N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Yl 15F、D133A、V135D、 V135G、L136P、G140C、R144C、H145A、G147C、H157A 和 W174R。在一个实施方案中，spr 蛋白 不包含突变W174R。优选地，spr基因包含上述一个或多个突变。
[0142] 根据本发明的细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性。表述"相较于野 生型细胞降低的Tsp蛋白活性"意指相较于野生型细胞的Tsp活性，细胞的Tsp活性降低。 可通过任何适当的方法修饰细胞以降低Tsp的活性。
[0143] 在一个实施方案中，降低的Tsp活性来自编码Tsp的内源多核苷酸和/或相关的 调控表达序列的修饰。修饰可减少或终止Tsp基因转录和翻译，或可提供相较于野生型Tsp 蛋白具有降低的蛋白酶活性的表达的Tsp蛋白。
[0144] 在一个实施方案中，相关的调控表达序列被修饰以减少Tsp表达。例如，可突变 Tsp基因的启动子以阻止基因的表达。
[0145] 在优选实施方案中，根据本发明的细胞具有编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋 白的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。
[0146] 优选地染色体Tsp基因被突变。
[0147] 如本文中所用，" Tsp基因"意指编码蛋白酶Tsp (也称为Prc)的基因，所述蛋白酶 Tsp是能够作用于青霉素结合蛋白_3(PBP3)和噬菌体尾蛋白的周质蛋白酶。野生型Tsp基 因的序列示于SEQ ID NO: 1中，野生型Tsp蛋白的序列示于SEQ ID NO:2中。
[0148] 除非另有所指，否则突变的Tsp基因或编码Tsp的突变的Tsp基因是指编码具有 降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。
[0149] 表述"编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因"在本发明的上 下文中意指突变的Tsp基因相较于野生型非突变的Tsp基因不具有完全的蛋白酶活性。
[0150] 优选地，突变的Tsp基因编码具有50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或 更少、10 %或更少或5 %或更少的野生型非突变的Tsp蛋白的蛋白酶活性的Tsp蛋白。更优 选地，突变的Tsp基因编码不具有蛋白酶活性的Tsp蛋白。在该实施方案中，细胞不缺乏染 色体Tsp，即Tsp基因序列未被删除或突变以阻止任何形式的Tsp蛋白的表达。
[0151] 可将任何适当的突变引入Tsp基因以产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白。从革兰 阴性细菌表达的Tsp蛋白的蛋白酶活性可由本领域技术人员通过本领域的任何适当方法， 例如Keiler等人（Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease*THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 第 270 卷，吣.48，188脱（^〇6。611*61'1，？？.28864 -28868, 1995Kenneth C. Keiler 和 Robert T. Sauer)中描述的方法（其中测试了 Tsp 的蛋白 酶活性）来容易地测试。
[0152] 在Keiler等人（同上）中已报导Tsp具有包含残基S430、D441和K455的活性 部位，并且残基G375、G376、E433和T452对于维持Tsp的结构是非常重要的。Keiler等 人（同上）报导了如下发现：突变的 Tsp 基因 S430A、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、 G376A、E433A和T452A不具有可检测的蛋白酶活性。还报导了突变的Tsp基因 S430C显示 约5-10%的野生型活性。因此，产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白的Tsp突变可包含针对 残基S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452的一个或多个突变，例如错义突变。优选 地，产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白的Tsp突变可包含针对活性部位残基S430、D441和 K455的1、2或全部3个的突变，例如错义突变。
[0153] 因此，突变的Tsp基因可包含：针对S430的突变；或针对D441的突变；或针对 K455的突变；或针对S430和D441的突变；或针对S430和K455的突变；或针对D441和K455 的突变；或针对S430、D441和K455的突变。
[0154] S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452的一个或多个可被突变成导致具有降 低的蛋白酶活性的蛋白的任何适当的氨基酸。适当的突变的实例为S430A、S430C、D441A、 K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A和T452A。突变的Tsp基因可包含针对活性部位 残基的1、2或3个突变，例如基因可包含：S430A或S430C ;和/或D441A ;和/或K455A或 K455H 或 K455R。
[0155] 优选地，Tsp基因具有点突变S430A或S430C。
[0156] 表述"敲除突变的Tsp基因"在本发明的上下文中意指基因包含一个或多个突变， 其阻止由野生型基因编码的Tsp蛋白的表达以提供缺乏Tsp蛋白的细胞。敲除基因可被部 分或完全转录但不被翻译成编码的蛋白质。可以以任何适当的方式，例如通过一个或多个 缺失突变、插入突变、点突变、错义突变、无义突变和移码突变来突变敲除突变的Tsp基因， 以使蛋白质不表达。例如，可通过将外来DNA序列例如抗生素抗性标记插入基因编码序列 来敲除基因。
[0157] 在优选实施方案中，不通过将外来DNA序列例如抗生素抗性标记插入基因编码序 列来突变Tsp基因。在该实施方案中，Tsp基因可包含针对基因起始密码子的突变和/或一 个或多个位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的终止密码子，从而阻止Tsp蛋 白表达。针对起始密码子的突变可以是起始密码子的1、2或全部3个核苷酸的错义突变。 可选择地或另外地，起始密码子可通过插入或缺失移码突变来进行突变。Tsp基因在编码 序列的5'末端上包含两个ATG密码子，ATG密码子的一个或两个可通过错义突变来进行突 变。可在第二ATG密码子（密码子3)上将Tsp基因突变成TCG。Tsp基因可以可选择地或 另外地包含一个或多个位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的终止密码子。优 选地，敲除突变的Tsp基因包含针对起始密码子的错义突变和一个或多个插入的终止密码 子。在优选实施方案中，Tsp基因被突变来从第5密码子删除"T"，从而产生在密码子11和 16上导致终止密码子的移码。在优选实施方案中，Tsp基因被突变来插入Ase I限制性位 点以在密码子21上产生第3个框内终止密码子。
[0158] 在优选实施方案中，敲除突变的Tsp基因具有SEQ ID NO:3的DNA序列，其包括起 始密码子上游的6个核苷酸ATGAAT。在一个实施方案中，突变的Tsp基因具有SEQ ID NO: 3 的核苷酸7至2048的DNA序列。
[0159] 在本发明中，细胞还具有一个或多个能够表达或过表达一种或多种能够促进蛋白 质折叠的蛋白的基因。实例包括蛋白例如FkpA，Skp，SurA，PPiA和PPiD。
[0160] 在一个实施方案中，用于促进蛋白质折叠的蛋白为FkpA、Skp或其组合。
[0161] 在一个实施方案中，用于促进蛋白质折叠的蛋白选自FkpA，或FkpA与Skp的组合。
[0162] FkpA是肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶，其具有Swiss-Prot编号P45523。
[0163] Skp是伴侣蛋白，其具有Swiss-Prot编号P0AEU7。
[0164] 视情况而定，用于促进蛋白质折叠的蛋白可由细胞基因组中或例如在质粒或所述 质粒的组合上被瞬时转染入其中的基因编码。
[0165] 在一个实施方案中，重组革兰阴性细菌细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸。
[0166] 在本发明的一个实施方案中，重组革兰阴性细菌细胞还包含编码具有伴侣蛋白活 性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因和/或突变的ptr基因，其中突变 的Ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或为敲除突变的ptr基因，和/ 或突变的OmpT基因，其中突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白或为敲 除突变的OmpT基因。
[0167] 优选地在该实施方案中，除上述突变外，细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基 因的。
[0168] 如本文中所用，"DegP"意指编码DegP蛋白（也称为HtrA)的基因，所述蛋白 具有作为伴侣蛋白和蛋白酶的双重功能（Families of serine peptidases ;Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994 ;244:19-61)。非突变的 DegP 基因的序列不于 SEQ ID NO:7中，非突变的DegP蛋白的序列示于SEQ ID N0:8中。
[0169] 在低温下，DegP用作伴侣蛋白，在高温下DegP偏向于用作蛋白酶（A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell,第 97 卷，Issue 3, Pages339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M和The proteolytic activity of the HtrA(DegP)protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J 等人 Microbiology 2008，154,3649-3658)〇
[0170] 在其中细胞包含DegP突变的实施方案中，细胞中的DegP突变提供了编码具有伴 侣蛋白活性但不具有完全蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因。
[0171] 表述"具有伴侣蛋白活性"在本发明的上下文中意指突变的DegP蛋白相较于野生 型非突变的DegP蛋白具有相同或大体上相同的伴侣蛋白活性。优选地，突变的DegP基因 编码具有50%或更高，60%或更高，70%或更高，80%或更高，90%或更高，或95%或更高 的野生型非突变的DegP蛋白的伴侣蛋白活性的DegP蛋白。更优选，突变的DegP基因编码 具有与野生型DegP相同的伴侣蛋白活性的DegP蛋白。
[0172] 表述"具有降低的蛋白酶活性"在本发明的上下文中意指突变的DegP蛋白相较于 野生型非突变的DegP蛋白不具有完全蛋白酶活性。优选地，突变的DegP基因编码具有50 % 或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少、10%或更少或5%或更少的野生型非突变的 DegP蛋白的蛋白酶活性的DegP蛋白。更优选地，突变的DegP基因编码不具有蛋白酶活性 的DegP蛋白。细胞不缺乏染色体DegP，即DegP基因序列未被删除或突变以阻止任何形式 的DegP蛋白的表达。
[0173] 任何适当的突变可被引入DegP基因，以产生具有伴侣蛋白活性和降低的蛋白 酶活性的蛋白。从革兰阴性细菌表达的DegP蛋白的蛋白酶和伴侣蛋白活性可由本领域 技术人员通过任何适当的方法，例如Spiess等人（A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, 第 97 卷，Issue 3，Pages 339 _ 347.Spiess C，Beil A，Ehrmann M)中描述的方法（其 中在DegP的天然底物MalS上测试DegP的蛋白酶和伴侣蛋白活性）以及还有The proteolytic activity of the HtrA(DegP)protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J 等人 Microbiology 2008, 154, 3649-3658 中描述的方法 来容易地测试。
[0174] DegP是丝氨酸蛋白酶，并且具有由氨基酸残基Hisl05、Aspl35和Ser210 的催化三联体组成的活性中心（Families of serine peptidases, Methods Enzymol.，1994,244:19_61Rawlings N和Barrett A)。产生具有伴侣蛋白活性和降低的蛋 白酶活性的蛋白的DegP突变可包含针对Hisl05、Aspl35和Ser210的1、2或3个的突变， 例如错义突变。
[0175] 因此，突变的DegP基因可包含：针对Hisl05的突变；或针对Aspl35的突变；或针 对Ser210的突变；或针对Hisl05和Aspl35的突变；或针对Hisl05和Ser210的突变；或 针对Aspl35和Ser210的突变；或针对Hisl05、Aspl35和Ser210的突变。
[0176] Hisl05、Aspl35和Ser210的1、2或3个可被突变成导致具有伴侣蛋白活性和降低 的蛋白酶活性的蛋白的任何适当的氨基酸。例如，Hisl05、Aspl35和Ser210的1、2或3个可 被突变成小的氨基酸例如Gly或Ala。其它适当的突变是将Hisl05、Aspl35和Ser210的1、 2或3个改变成具有相反性质的氨基酸，例如将Asp 135突变成Lys或Arg，将极性Hi s 105突 变成非极性氨基酸例如Gly，Ala，Val或Leu，以及将小的亲水性Ser210突变成大的或疏水 性残基例如Val，Leu, Phe或Tyr。优选地，DegP基因包含点突变S210A，如图Ilc中显示的， 已发现其产生具有伴侣蛋白活性但不具有蛋白酶活性的蛋白（A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell,第 97 卷，Issue 3, Pages339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M)〇
[0177] DegP 具有 2 个 PDZ 结构域，PDZl (残基 260-358)和 PDZ2 (残基 359-448)，所 述结构域介导蛋白质间相互作用（A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein.Cell,第 97 卷，Issue 3, Pages339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M)。在本发明的一个实施方案中，DegP 基因被突变来删除roz 1结构域和/或roz2结构域。roz 1和roz2的删除导致DegP蛋 白的蛋白酶活性的完全丢失和相较于野生型DegP蛋白降低的伴侣蛋白活性，然而rozi 或Η)Ζ2的缺失导致5%的蛋白酶活性和与野生型DegP蛋白相似的伴侣蛋白活性（A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell,第 97 卷，Issue 3, Pages339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) 〇
[0178] 突变的DegP基因还可包含沉默的非天然存在的限制性位点例如Ase I以帮助鉴 定和筛选方法，例如如图7C中显示的。
[0179] 包含点突变S210A和Ase I限制性标记位点的突变的DegP基因的优选序列提供 于SEQ ID N0:9中，编码的蛋白质序列示于SEQ ID NO: 10中。
[0180] 在其中细胞包含编码具有伴侣蛋白活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变 的DegP基因的本发明的实施方案中，本发明提供的一种或多种细胞相对于其中DegP基因 已被突变来敲除DegP从而阻止DegP表达（例如染色体缺陷DegP)的突变的细胞，可提供 增加的来自细胞的正确折叠的蛋白质的产率。在包含敲除突变的DegP基因从而阻止DegP 表达的细胞中，DegP的伴侣蛋白活性完全丢失，然而在根据本发明的细胞中，DegP的伴侣 蛋白活性得到保持，同时完全蛋白酶活性丢失。在这些实施方案中，根据本发明的一种或多 种细胞具有更低的蛋白酶活性，从而阻止蛋白质的蛋白水解，同时维持伴侣蛋白活性以允 许蛋白质在宿主细胞中正确折萱和运输。
[0181] 在这些实施方案中，根据本发明的一种或多种细胞相较于具有突变敲除DegP基 因从而阻止DegP表达的细胞具有增强的细胞生长。不希望受理论束缚，因为DegP蛋白酶 保留伴侣蛋白活性，这可增强细胞加工所有蛋白质的能力，所述能力需要伴侣蛋白活性，而 可能显示增强的细胞生长。因此，细胞生长和繁殖所必需的正确折叠的蛋白质的产量在本 发明的一种或多种细胞中相较于具有DegP敲除突变的细胞增加，从而改善调节生长的细 胞途径。此外，已知的DegP蛋白酶缺陷株通常是温度敏感性的并且通常在高于约28°C的温 度不生长。然而，根据本发明的细胞不是温度敏感性的，并且可在28°C或更高的温度生长， 包括约30°C至约37°C的温度，其通常用于蛋白质从细菌的工业规模生产。
[0182] 在本发明的一个实施方案中，细胞具有突变的ptr基因。如本文中所用，"ptr基 因"意指编码蛋白酶ΠΙ(降解高分子量蛋白的蛋白酶）的基因。非突变的Ptr基因的序列 示于SEQ ID Ν0:4中，非突变的蛋白酶III蛋白的序列示于SEQ ID ΝΟ:5中。
[0183] 除非另有所指，否则突变的ptr基因或编码蛋白酶III的突变的ptr基因，是指编 码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白的突变的Ptr基因或敲除突变的ptr基因。
[0184] 表述"编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白的突变的ptr基因"在本发明 的上下文中意指突变的Ptr基因相较于野生型非突变的ptr基因不具有完全蛋白酶活性。
[0185] 优选地，突变的ptr基因编码具有50 %或更少、40 %或更少、30 %或更少、20 %或 更少、10%或更少或5%或更少的野生型非突变的蛋白酶III蛋白的蛋白酶活性的蛋白酶 III。更优选，突变的Ptr基因编码不具有蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白。在该实施方案中， 细胞不缺乏染色体ptr，即ptr基因序列未被删除或突变以阻止任何形式的蛋白酶III蛋白 的表达。
[0186] 可将任何适当的突变引入ptr基因以产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋 白。从革兰阴性细菌表达的蛋白酶III蛋白的蛋白酶活性可由本领域技术人员通过本领域 的任何适当方法来容易地测试。
[0187] 表述"敲除突变的ptr基因"在本发明的上下文中意指基因包含一个或多个突变， 从而使得由基因编码的蛋白不表达，以提供缺乏由敲除突变的基因编码的蛋白质的细胞。 敲除基因可被部分或完全转录但不翻译成编码的蛋白质。可以以任何适当的方式，例如通 过一个或多个缺失突变、插入突变、点突变、错义突变、无义突变和移码突变来对敲除突变 的ptr基因进行突变，以使蛋白质不表达。例如，可通过外来DNA序列例如抗生素抗性标记 至基因编码序列的插入来敲除基因。
[0188] 在优选实施方案中，不通过外来DNA序列例如抗生素抗性标记至基因编码序列的 插入来突变基因。优选地，蛋白酶ΠΙ基因包含针对基因起始密码子的突变和/或位于基 因起始密码子下游和基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子，从而阻止蛋白酶III 蛋白表达。
[0189] 针对靶敲除基因起始密码子的突变使得起始密码子的功能丢失，从而确保靶基因 在编码序列的起始部分不包含适当的起始密码子。针对起始密码子的突变可以是起始密码 子的1、2或全部3个核苷酸的错义突变。可选择地或另外地，起始密码子可通过插入或缺 失移码突变来进行突变。
[0190] 在优选实施方案中，ptr基因被突变来将ATG起始密码子改变成ATT。
[0191] 敲除突变的ptr基因可以可选择地或另外地包含位于基因起始密码子下游和基 因终止密码子上游的一个或多个终止密码子。优选地，敲除突变的Ptr基因包含针对起始 密码子的错义突变和一个或多个插入的终止密码子。
[0192] 一个或多个插入的终止密码子优选为框内终止密码子。然而，一个或多个插入的 终止密码子可以可选择地或另外地为框外终止密码子。可能需要一个或多个框外终止密码 子来终止其中通过插入或缺失移码突变将框外起始密码子改变成框内起始密码子的翻译。 可通过任何适当的突变包括无义点突变和移码突变来引入一个或多个终止密码子。优选通 过移码突变和/或插入突变，优选通过用包含终止密码子的序列替代基因序列的区段来引 入一个或多个终止密码子。例如，可插入Ase I限制性位点，其包含终止密码子TAA。
[0193] 在优选实施方案中，通过插入Ase I限制性位点来突变ptr基因以插入框内终止 密码子，如图7A中显示。在优选实施方案中，敲除突变的ptr基因具有SEQ ID NO:6的DNA 序列。
[0194] 上述敲除突变是有利的，因为它们引起最小的对靶敲除基因位点的上游或下游的 染色体DNA的破坏或对所述DNA无破坏，并且不需要外来DNA例如抗生素抗性标记的插入 和保留，所述破坏或外来DNA的插入和保留可影响细胞用于表达目标蛋白，特别是治疗性 蛋白的适合性。因此，根据本发明的一种或多种细胞，相较于其中已通过外来DNA至基因编 码序列的插入来敲除蛋白酶基因的细胞，可显示改善的生长特征和/或蛋白质表达。
[0195] 在一个实施方案中，根据本发明的细胞具有突变的OmpT基因。如本文中所用， "OmpT基因"意指编码蛋白酶OmpT(外膜蛋白酶T)的基因，所述蛋白酶是外膜蛋白酶。野 生型非突变的OmpT基因的序列为SWISS-PROT P09169。
[0196] 除非另有所指，否则突变的OmpT基因或编码OmpT的突变的OmpT基因是指编码具 有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白的突变的OmpT基因，或敲除突变的OmpT基因。
[0197] 表述"编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白的突变的OmpT基因"在本发明的 上下文中意指突变的OmpT基因相较于野生型非突变的OmpT基因不具有完全蛋白酶活性。 突变的OmpT基因可编码具有50 %或更少、40 %或更少、30 %或更少、20 %或更少、10 %或更 少，或5 %或更少的野生型非突变的OmpT蛋白的蛋白酶活性的OmpT蛋白。突变的OmpT基因 可编码不具有蛋白酶活性的OmpT蛋白。在该实施方案中，细胞不缺乏染色体OmpT，即OmpT 基因序列未被删除或突变来阻止任何形式的OmpT蛋白的表达。
[0198] 可将任何适当的突变引入OmpT基因以产生具有降低的蛋白酶活性的蛋 白。从革兰阴性细菌表达的OmpT蛋白的蛋白酶活性可由本领域技术人员通过本领 域中的任何适当方法，例如Kramer等人（Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site,FEBS Letters 505(2001)426-430)和 Dekker 等人（Substrate Specitificity of the Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed Peptide Libraries，Biochemistry 2001，40, 1694-1701)中描述的方法来容易地测试D
[0199] OmpT 在 Kramer 等人（Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT FEBS Letters 2000468,220-224)中已有报导，该文献公开了：丙氨酸对丝氨酸、组蛋白和酸性残基的置 换导致降低至约1/10的活性（对于Glu27、Asp97、Asp208或HislOl的置换）、降低至约 1/500的活性（对于Ser99的置换）和降低至约1/10000的活性（对于Asp83, Asp85, Asp210 或His212 的置换）DVandeputte_Rutten等人（Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site,The EMBO Journal 2001，第 20 卷 Nol8 5033-5039)报道 OmpT 具有包含 Asp83-Asp85 对和 His212_Asp210对的活性部位D此外，Kramer等人（Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpTj Eur. J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752)公开了环 L4 中的突变 D208A，D210A、H212A、H212N、 H212Q、G216K/K217G、K217T和R218L全都导致酶促活性的部分或实际上完全丢失。
[0200] 因此，产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白的OmpT突变可包含针对残基E27、D43、 D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218 和 E250 的一个或多个的突变，例如错义突变。
[0201] E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、 K217、R218和E250的一个或多个可被突变成导致具有降低的蛋白酶活性的蛋白的任何适 当的氨基酸。例如，E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、 H212G216、K217、R218和E250的一个或多个可被突变成丙氨酸。适当的突变的实例为E27A、 D43A、D83A、D85A、D97A、S99A、HlOlA E111A、E136A、E193A、D206A、D208A、D210A、H212A、 H212N、H212Q、G216K、K217G、K217T、R218L 和 E250A。在一个实施方案中，突变的 OmpT 基因 包含D210A和H212A突变。包含D210A和H212A突变的适当的突变的OmpT序列示于SEQ ID NO:23 中。
[0202] 表述"敲除突变的OmpT基因"在本发明的上下文中意指基因包含一个或多个突 变，从而使得由基因编码的蛋白质不表达，以提供缺乏由敲除突变的基因编码的蛋白质的 细胞。敲除基因可被部分或完全转录但不翻译成编码的蛋白质。可以以任何适当的方式， 例如通过一个或多个缺失突变、插入突变、点突变、错义突变、无义突变和移码突变来对敲 除突变的OmpT基因进行突变，以使蛋白质不表达。例如，可通过外来DNA序列例如抗生素 抗性标记至基因编码序列的插入来敲除基因。
[0203] 在一个实施方案中，OmpT基因包含针对基因起始密码子的突变和/或位于基因起 始密码子的下游和基因终止密码子的上游的一个或多个终止密码子，从而阻止OmpT蛋白 表达。针对起始密码子的突变可以是起始密码子的1、2或全部3个核苷酸的错义突变。适 当的突变的敲除OmpT序列示于SEQ ID NO: 24中。可选择地或另外地起始密码子可通过插 入或缺失移码突变来进行突变。
[0204] 在一个实施方案中，根据本发明的革兰阴性细菌细胞不具有敲除突变的ompT基 因，例如缺乏染色体ompT。
[0205] 在一个实施方案中，根据本发明的革兰阴性细菌细胞不具有敲除突变的degP基 因，例如缺乏染色体degP。在一个实施方案中，根据本发明的革兰阴性细菌细胞不具有突变 的degP基因。
[0206] 在一个实施方案中，根据本发明的革兰阴性细菌细胞不具有敲除突变的ptr基 因，例如缺乏染色体Ptr。
[0207] 许多基因工程突变包括敲除突变牵涉抗生素抗性标记的使用，所述标记使得能够 选择和鉴定成功突变的细胞。然而，如上所述，使用抗生素抗性标记存在许多不利方面。
[0208] 在本发明的其它实施方案中，细胞不包含抗生素抗性标记并且克服使用抗生素抗 性标记的上述不利方面，其中突变的Tsp基因、突变的spr基因和任选地突变的DegP基因 和/或突变的Ptr基因和/或突变的OmpT基因被突变以包含一个或多个限制性标记位点。 限制性位点被基因工程化入基因，并且是非天然存在的。限制性标记位点是有利的，因为它 们允许筛选和鉴定正确修饰的细胞，所述修饰细胞包含所需要的染色体突变。已被修饰来 具有一个或多个突变的蛋白酶基因的细胞可使用寡核苷酸对（该寡核苷酸对被设计来扩 增包含非天然存在的限制性标记位点的基因组DNA的区域），通过来自细胞裂解物的基因 组DNA的PCR来进行分析。随后可在利用能够在非天然存在的限制性标记位点上消化DNA 的适当的限制性内切酶温育之前和之后，通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的DNA。在用限制性 内切酶温育后DNA片段的存在确认了细胞已被成功地修饰来具有一个或多个突变的基因。 [0209] 在其中细胞拥有具有SEQ ID NO: 6的DNA序列的敲除突变的ptr基因的实施方案 中，SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18中显示的寡核苷酸引物可用于扩增来自转化细胞的基 因组DNA的包含非天然存在的Ase I限制性位点的DNA的区域。随后可用Ase I限制性内 切酶温育扩增的基因组DNA，并通过凝胶电泳对其进行分析以确认突变的ptr基因在基因 组DNA中的存在。
[0210] 在其中细胞包含具有SEQ ID NO: 3的DNA序列或SEQ ID NO: 3的核苷酸7至2048 的敲除突变的Tsp基因的实施方案中，SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16中显示的寡核苷酸 引物序列可用于扩增来自转化细胞的基因组DNA的包含非天然存在的Ase I限制性位点的 DNA的区域。随后用Ase I限制性内切酶温育扩增的基因组DNA，并利用凝胶电泳对其进行 分析以确认突变的Tsp基因在基因组DNA中的存在。
[0211] 在其中细胞包含具有SEQ ID NO: 9的DNA序列的突变的DegP基因的实施方案中， 可将SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20中显示的寡核苷酸引物序列用于扩增来自转化细胞的 基因组DNA的包含非天然存在的Ase I限制性位点的DNA的区域。随后用Ase I限制性内 切酶温育扩增的基因组DNA，并通过凝胶电泳对其进行分析以确认突变的DegP基因在基因 组DNA中的存在。
[0212] 可通过任何适当的突变，包括一个或多个缺失突变、插入突变、点突变、错义突变、 无义突变和移码突变来引入一个或多个限制性位点。可通过起始密码子的突变和/或引入 一个或多个终止密码子的突变来引入限制性位点，如上文中描述的。该实施方案是有利的， 因为限制性标记位点是引入的敲除突变的直接和独特的标记。
[0213] 可插入包含框内终止密码子的限制性标记位点例如Ase I限制性位点。这是特别 有利的，因为插入的限制性位点用作限制性标记位点和终止密码子以阻止基因编码序列的 完全转录。例如，在其中通过引入Ase I位点来将终止密码子引入ptr基因的实施方案中， 这也产生了限制性位点，如图7A中显示的。例如，在其中通过引入Ase I位点来将终止密 码子在密码子21上引入Tsp基因的实施方案中，这也产生限制性位点，如图7B中显示的。
[0214] 可通过针对起始密码子的突变和任选地一个或多个其它点突变来插入限制性标 记位点。在该实施方案中，限制性标记位点优选为EcoRI限制性位点。这是特别有利的，因 为针对起始密码子的突变还产生限制性标记位点。例如，在其中Ptr基因的起始密码子被 改变成ATT的实施方案中，这产生了 EcoR I标记位点，如图Ila中显示的。例如，在其中将 Tsp基因的起始密码子（密码子3)从ATG变成TCG的实施方案（如图Ib中显示的）中，进 一步的密码子2从AAC至AAT的点突变和密码子3从ATG至TCG的突变产生了 EcoR I限 制性标记位点，如图7B中显示的。
[0215] 在其中细胞具有突变的OmpT基因的本发明的实施方案中，可通过任何适当的突 变，包括通过一个或多个缺失突变、插入突变、点突变、错义突变、无义突变和移码突变来引 入一个或多个限制性位点。例如，在其中OmpT基因包含突变D210A和H212A的实施方案中， 这些突变引入可用作选择标记的沉默HindIII限制性位点。
[0216] 在DegP基因或spr基因中，可使用沉默密码子变化引入标记限制性位点。例如， Ase I位点可用作沉默限制性标记位点，其中如图7C中显示的，对于突变的DegP基因，TAA 终止密码子在框外。
[0217] 在本发明的实施方案中，其中ptr基因和/或Tsp基因被突变来编码具有降低的 蛋白酶活性的蛋白酶III或Tsp，可使用沉默密码子变化来引入一个或多个标记限制性位 点。
[0218] 根据本发明的重组革兰阴性细菌细胞可通过任何适当的方法来产生。本领域技术 人员知道可用于使用突变的基因序列替代染色体基因序列的适当技术。可使用允许通过同 源重组整合至宿主染色体内的适当的载体。
[0219] 适当的基因替代法描述于例如Hamilton等人（New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli,Hamilton C. M.等 人，Journal of Bacteriology Sept.1989，第 171 卷，No. 9p 4617-4622) ,Skorupski 等人(Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K 和 Taylor R.K. , Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel 等人（A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J. A. K.W.等人，Mol Gen Genet 1987, 207:294-301) ,Blomfield 等 人(Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSClOlreplicon, Blomfield I. C.等人，Molecular Microbiology 1991,5(6),1447-1457)和 Ried 等人（An nptl-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis, Ried J.L.和 Collmer A. ,Gene 57(1987)239-246)中。 使得能够进行同源重组/替代的适当的质粒为pK03质粒（Link等人，1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237) 〇
[0220] 成功突变的菌株可使用本领域公知的方法，包括菌落PCR DNA测序和菌落PCR限 制性内切酶图谱法来鉴定。
[0221] 在其中细胞包含两个或更多个突变的染色体基因的实施方案中，可将突变的基因 在相同或不同的载体上引入革兰阴性细菌。
[0222] 在一个实施方案中，根据本发明的革兰阴性细菌细胞不具有敲除突变的ompT基 因，例如缺乏染色体ompT。
[0223] 在一个实施方案中，根据本公开内容的细胞仅包含3个表征突变：突变的spr、减 少的Tsp以及FkpA、Skp或FkpA与Skp的组合的表达。
[0224] 在一个实施方案中，根据公开内容的细胞系由突变的Tsp基因和突变的spr基因 以及FkpA基因组成。
[0225] 在一个实施方案中，根据公开内容的细胞系由突变的Tsp基因和突变的spr基因 以及Skp基因组成。
[0226] 在一个实施方案中，根据公开内容的细胞系由突变的Tsp基因和突变的spr基因 以及FkpA基因和Skp基因组成。
[0227] 在一个实施方案中，将能够表达或过表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白 例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD的基因例如在表达载体上瞬时转化入细胞，所述载体任 选地包含编码抗体或其结合片段的多核苷酸序列。
[0228] 在一个实施方案中，将编码抗体的多核苷酸序列和编码FkpA和/或Skp的多核苷 酸插入分开的表达载体。
[0229] 为了产生包含重链和轻链的产物，可用两个载体转化细胞系，第一载体编码轻链 多肽，第二载体编码重链多肽。或者，可使用单个载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽 的序列。
[0230] 或者，将编码抗体的多核苷酸序列和编码FkpA和/或Skp的多核苷酸插入一个载 体。优选地，载体包含编码抗体的轻链和重链多肽的序列。
[0231] 本发明还提供了包含编码FkpA和/或Skp和对于人FcRn是特异性的抗体或其抗 原结合片段的重组多核苷酸的表达载体。表达载体是包含编码FkpA和/或Skp的多核苷 酸序列和编码抗体的多核苷酸序列的多顺反子载体。
[0232] 多顺反子载体可通过有利的克隆法来产生，所述方法允许多核苷酸序列至载体内 的重复连续克隆。方法使用一对限制性位点的相容性粘性末端，例如Ase I和Nde I限 制性位点的"AT"末端。可将包含编码序列和具有相容性粘性末端的多核苷酸序列，例如 AseI-NdeI片段，克隆入载体的限制性位点例如Nde I内。多核苷酸序列的插入破坏5'限 制性位点但产生新的3'限制性位点，例如Ndel，随后可将其用于插入包含相容性粘性末端 的另外的多核苷酸序列。随后可重复该方法以插入另外的序列。插入载体的每一个多核苷 酸序列包含位于终止密码子3'端的非编码序列，所述非编码序列可包含用于筛选的Ssp I 位点、Shine Dalgarno核糖体结合序列、富含A的间隔子和编码起始密码子的NdeI位点。
[0233] 包含编码抗体的轻链（LC)、抗体的重链（HC)的多核苷酸序列、FkpA多核苷酸序列 和其它多核苷酸序列的载体的产生的图示显示于图7d中。
[0234] 根据本发明的细胞优选包含如上定义的表达载体。
[0235] 在其中细胞还表达如下的一种或多种其它的蛋白质：一种或多种能够促进蛋白质 折叠的蛋白，例如skp、SurA、PPiA和PPiD ;和任选地一种或多种能够促进蛋白质分泌或转 运的蛋白例如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY和Lep的实施方案中，可从一个 或多个插入与编码FkpA的多核苷酸和/或编码抗体的多核苷酸序列相同的载体内的多核 苷酸表达一种或种其它蛋白质。或者，可将一个或多个多核苷酸插入分开的载体。
[0236] 可通过将一个或多个如上定义的表达盒插入适当的载体来产生表达载体。或者， 可在表达载体中包含用于指导多核苷酸序列表达的调控表达序列，从而可仅需多核苷酸的 编码区来完成表达载体。
[0237] 适当地将编码FkpA和/或Skp的多核苷酸和/或编码抗体的多核苷酸插入可复 制载体，通常地自主复制表达载体，以在细胞的适当启动子的控制下在细胞中表达。用于该 目的许多载体在本领域是已知的，适当的载体的选择可取决于核酸的大小和特别地细胞类 型。
[0238] 可用于与根据本发明的多核苷酸一起转化宿主细胞的表达载体的实例包括：
[0239] ?质粒，例如 pBR322 或 pACYC184,和 / 或
[0240] ?病毒载体例如细菌噬菌体
[0241] ?转座遗传元件例如转座子
[0242] 这样的表达载体通常包含DNA复制的质粒起始点、抗生素选择标记、通过多克隆 位点分开的启动子和转录终止子（表达盒）和编码核糖体结合位点的DNA序列。
[0243] 用于本发明的启动子可直接连接于相关多核苷酸，或可选择地位于适当的位置 中，例如位于载体中，以便当相关多肽被插入时，相关启动子可作用于其。在一个实施方案 中，启动子位于其所作用的多核苷酸的编码部分之前，例如相关启动子位于多核苷酸的每 一个编码部分之前。如本文中所用，"……之前"意欲指启动子位于相对于编码多核苷酸部 分的5'末端。
[0244] 启动子对于宿主细胞可以是内源的或外源的。适当的启动子包括lac、tac、trp、 phoA、Ipp、Arab、tet 和 T7。
[0245] 使用的一个或多个启动子可以是诱导型启动子。在其中编码FkpA和/或Skp的 多核苷酸和编码抗体的多核苷酸被插入一个载体的实施方案中，编码FkpA和抗体的核苷 酸序列可处于单个启动子或分开的启动子的控制之下。在其中编码FkpA和/或Skp和抗 体的核苷酸序列处于分开的启动子的控制之下的实施方案中，启动子可以是独立的诱导型 启动子。
[0246] 用于细菌系统的启动子通常还包含可操作地连接于编码目标多肽的DNA的 Shine-Dalgamo (S. D.)序列。可通过限制性内切酶消化从细菌来源的DNA取出启动子，将其 插入包含期望的DNA的载体。
[0247] 表达载体优选还包含用于产生抗体或其抗原结合片段的双顺反子信使，如 W003/048208或W02007/039714(将其内容通过引用并入本文）中描述的。优选地，上游顺 反子包含编码抗体的轻链的DNA，下游顺反子包含编码对应的重链的DNA，双顺反子基因间 序列（IGS)优选包含选自 IGS1(SEQ ID N0:23)、IGS2(SEQ ID N0:24)、IGS3(SEQ ID N0:25) 和 IGS4(SEQ ID N0:26)的序列。
[0248] 终止子对于宿主细胞可以是内源的或外源的。适当的终止子是rrnB。
[0249] 其它适当的转录调控子包括启动子和终止子以及蛋白质靶向法可见于 "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli"Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Septl996, p 512-538 中。
[0250] 插入表达载体的FkpA多核苷酸优选包含编码FkpA信号序列和FkpA编码序列的 核酸。载体优选地包含使得载体能够在一个或多个选择的宿主细胞中复制，优选地独立于 宿主染色体复制的核酸序列。对于各种细菌，这样的序列是公知的。
[0251] 在一个实施方案中，FkpA和/或Skp和/或目标蛋白在N末端和/或C末端包含 组氨酸-标记。
[0252] 抗体分子可通过适当的信号序列从细胞分泌或被靶向周质。或者，抗体分子可在 细胞的细胞质内积累。优选地，抗体分子被靶向周质。
[0253] 编码抗体的多核苷酸可表达为与另一种多肽，优选信号序列的融合蛋白或在成熟 多肽的N末端上具有特定切割位点的其它多肽。选择的异源信号序列应当是被宿主细胞识 别和加工的信号序列。对于不识别和加工天然或真核多肽信号序列的原核宿主细胞，利用 原核信号序列替换信号序列。适当的信号序列包括OmpA、PhoA、LamB、PelB、DsbA和DsbC。 在其中细胞包含编码抗体的重链的多核苷酸序列和编码抗体的轻链的多核苷酸序列的实 施方案中，每一个多核苷酸可包含信号序列例如OmpA。
[0254] 包含一种或多种上文所列组件的适当的载体的构建使用标准连接技术。对分 离的质粒或DNA片段以期望的形式进行切割、裁剪、和再连接以产生需要的质粒。可籍 以构建载体的一般方法、转染法和培养法对于本领域技术人员来说是公知的。在这方 面，参考 "Current Protocols in Molecular Biology"，1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing0
[0255] 分子生物学的标准技术可用于制备编码抗体的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技 术完全或部分地合成期望的DNA序列。适当时，可使用定点诱变和聚合酶链式反应（PCR) 技术。
[0256] 本文中针对多核苷酸描述的本发明的实施方案同样地用于本发明的可选择的实 施方案，例如包含本文中使用的组分的载体、表达盒和/或宿主细胞，只要相关方面可用于 所述可选择的实施方案。
[0257] 根据本发明的细胞还可包含编码目标蛋白的多核苷酸序列。编码目标蛋白的多核 苷酸序列可以是外源的或内源的。编码目标蛋白的多核苷酸序列可被整合入宿主的染色体 或可非整合地存在于载体，通常质粒中。
[0258] 在一个实施方案中，根据本发明的细胞表达目标蛋白。"目标蛋白"在本说明书的 上下文中意欲指用于表达的多肽，通常重组多肽。然而，目标蛋白可以是从宿主细胞的内源 基因表达的内源蛋白。
[0259] 如本文中所用，"重组多肽"是指使用重组DNA技术构建或产生的蛋白。目标蛋白 可以是从外源载体表达的，与内源蛋白或其突变形式（例如具有减弱的生物活性）相同的 外源序列或其片段。或者，目标蛋白可以是通常不由宿主细胞表达的异源蛋白。
[0260] 目标蛋白可以是任何适当的蛋白，包括治疗性、预防性或诊断性蛋白。
[0261] 本领域技术人员通过使用本领域公知的方法，例如蛋白G HPLC、圆二色性、NMR、 X射线晶体学和表位亲和力测量法，能容易地测试分泌的蛋白以判断蛋白质是否被正确折 叠。
[0262] 在一个实施方案中，目标蛋白用于疾病或障碍包括免疫障碍和/或自身免疫疾病 的治疗。
[0263] 在一个实施方案中，自身免疫疾病选自急性播散性脑脊髓炎（ADEM)、急性坏死 性出血性白质脑炎、阿狄森病、丙种球蛋白缺乏血症、斑秃、淀粉样变性、ANCA相关性脉管 炎、强直性脊柱炎、抗-GBM/抗-TBM肾炎、抗磷脂综合征（APS)、自身免疫性血管性水肿、 自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性家族性自主神经异常、自身免疫性肝炎、自身免 疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺乏症、自身免疫性内耳病（AIED)、自身免疫性心肌炎、自 身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜（ATP)、自身免 疫性甲状腺病、自身免疫性荨麻瘆、轴突和神经元神经病、巴洛病、贝赫切特病（Behcet' s disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman病、乳糜泻、美洲锥虫病（Chagas disease)、 慢性疲劳综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓 炎（CRMO)、变应性肉芽肿性血管炎（Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性 粘膜类天疱疮、克罗恩病、Cogans综合征、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病 毒性心肌炎、CREST病、特发性混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱瘆样皮炎、皮肌 炎、德维克病（视神经脊髓炎）、扩张型心肌病、盘状狼疮、Dressier综合征、子宫内膜异 位症、嗜酸性血管中心性纤维变性、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、 伊文思综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎（颞动脉炎）、肾小球肾炎、肺出 血性肾炎综合征、肉芽肿性血管炎（GPA)参见韦格纳氏病和格雷夫斯病、格-巴二氏综 合征、Hashimoto脑炎、Hashimoto甲状腺炎、溶血性贫血、亨诺-许兰氏紫癜、妊娠疱瘆、 低丙球蛋白血症、特发性低补体血肾小管间质性肾炎（Idiopathic hypocomplementemic tubulointestitial nephritis)、特发性血小板减少性紫癜（ITP)、IgA肾病、IgG4相关疾 病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、炎性主动脉瘤、炎性假瘤、包涵体肌炎、胰岛 素依赖性糖尿病（1型）、间质性膀胱炎、少年关节炎、青少年糖尿病。川畸综合征、Kuttner 肿瘤、朗-伊二氏综合征、白细胞分裂性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性 IgA疾病（LAD)、狼疮（SLE)、莱姆病、慢性、纵隔纤维变性、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、 米库利兹综合征、混合性结缔组织病（MCTD)、莫伦溃疡、穆-哈二氏病、多灶性纤维硬化、 多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎（Devic氏）、中性粒细胞减少、 眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、奥蒙德病（腹膜后纤维化）、复发性风湿病、PANDAS(与链球 菌相关的儿童自身免疫性神经精神性障碍）、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症多发性神经 病（Paraproteinemic polyneuropathy)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH)、帕-罗二氏 综合征、Parsonnage-Turner综合征、睫状体扁平部炎（周边葡萄膜炎）、寻常天疱疮、主动 脉周围炎、动脉周围炎、周围神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多 发性动脉炎、I、II和III型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗 塞后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管 炎、银肩病、银肩病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、单纯红细胞再生障碍、雷诺现 象、反射性交感神经营养障碍、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤 维化（奥蒙德病）、风湿热、风湿性关节炎、里德耳甲状腺炎、结节病、施密特综合征、巩膜 炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎（SBE)、 Susac综合征、交感性眼炎、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫 癜（TTP)、托-亨二氏综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病（UCTD)、葡 萄膜炎、血管炎、水疱大疱性皮肤病、白癜风、Waldenstrom巨球蛋白血症、温暖性特发性溶 血性贫血和韦格纳氏肉芽肿（现在称作肉芽肿性血管炎（GPA))。
[0264] 在一个实施方案中，神经障碍选自慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP)、 格-巴二氏综合征、副蛋白血症多发性神经病、视神经脊髓炎（NMO、NMO谱群障碍或NMO谱 群疾病）和重症肌无力。
[0265] 在一个实施方案中，免疫学血液学障碍选自特发性血小板减少性紫癜（ITP)、血栓 性血小板减少性紫癜（TTP)、温暖性特发性溶血性贫血、肺出血肾炎综合征和因抗-HLA抗 体引起的移植供体不匹配。
[0266] 在一个实施方案中，疾病选自重症肌无力、视神经脊髓炎、CIDP、格-巴二氏综合 征、副蛋白血症多发性神经病、顽固性癫痫、ITP/TTP、溶血性贫血、肺出血肾炎综合征、ABO 不匹配、狼疮肾炎、肾血管炎、硬皮病、纤维化肺泡炎、扩张型心肌病、格雷夫斯病、1型糖尿 病、自身免疫性糖尿病、天疱疮、硬皮病、狼疮、ANCA脉管炎、皮肌炎、干燥综合征和风湿性关 节炎。
[0267] 在一个实施方案中，皮肤科障碍选自大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、ANCA相关性脉 管炎和扩张型心肌病。
[0268] 在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段可用于与同种异体器官或组织 移植或某些新生儿病况相关的同种免疫疾病的预防或治疗。
[0269] 蛋白质可以是蛋白水解敏感性多肽，即在天然状态或在分泌过程中易于被切割， 对切割易感，或被一种或多种革兰阴性细菌例如大肠杆菌蛋白酶切割的蛋白质。在一个实 施方案中，目标蛋白对选自DegP、蛋白酶III和Tsp的蛋白酶是蛋白水解敏感性的。在一 个实施方案中，目标蛋白对蛋白酶Tsp是蛋白水解敏感性的。在一个实施方案中，目标蛋白 对蛋白酶DegP和蛋白酶III是蛋白水解敏感性的。在一个实施方案中，目标蛋白对蛋白 酶DegP和Tsp是蛋白水解敏感性的。在一个实施方案中，目标蛋白对蛋白酶Tsp和蛋白酶 III是蛋白水解敏感性的。在一个实施方案中，目标蛋白对蛋白酶DegP、蛋白酶III和Tsp 是蛋白水解敏感性的。
[0270] 优选地蛋白为真核生物多肽。
[0271] 根据本发明的细胞表达的目标蛋白可以例如是免疫原、包含两种异源蛋白的融合 蛋白或抗体。用作目标蛋白的抗体包括单克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体、人源化抗体、 完全人抗体或嵌合抗体。抗体可以来自任意种类，但优选来源于单克隆抗体、人抗体或人源 化片段。抗体可来源于免疫球蛋白分子的任何种类（例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚 类，以及可获自任何物种包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、骆马、山羊或人。抗 体片段的部分可获自超过一个物种，例如抗体片段可以是嵌合的。在一个实例中，恒定区来 自一个物种并且可变区来自另一个物种。
[0272] 抗体可以是具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段例如VH、VL、VHH、Fab、 修饰的Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv、scFv片段，或双特异性抗体例如Fab-dAb或Fab-Fv，如 W02009/040562 和 TO2010/035012 中描述的。
[0273] 在一个实施方案中，蛋白是Fab'。
[0274] 抗体可以特异于任何靶抗原。抗原可以是细胞结合的蛋白，例如细胞例如细菌细 胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目 标抗原还可以是任何医学相关蛋白例如在疾病或感染过程中被上调的那些蛋白，例如受体 和/或它们的对应配体。细胞表面蛋白的具体实例包括粘附分子，例如整联蛋白例如β? 整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P选择蛋白或L-选择蛋白、⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、 CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、 CD69、CD134 (0X40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、CSFl 或 CSFl-受体、DPCRl、DPCRl、 dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、 LTK、MAL2、MRP2、结合素样 2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、 DTD、癌胚抗原（CEA)、人乳脂球蛋白（HMFG1和2)，MHC I类和MHC II类抗原、KDR和VEGF， 以及适当时其受体。
[0275] 可溶性抗原包括白细胞介素例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、 IL-13、IL-14、IL-16或IL-17,例如IL17A和/或IL17F，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或 巨细胞病毒抗原、免疫球蛋白例如IgE、干扰素例如干扰素 α、干扰素 β或干扰素 γ、肿瘤 坏死因子TNF(以前称为肿瘤坏死因子-α )、肿瘤坏死因子-β、集落刺激因子例如G-CSF 或GM-CSF，以及血小板衍生生长因子例如TOGF- α和TOGF- β，和适当时其受体。其它抗原 包括细菌细胞表面抗原、细菌毒素、病毒例如流感病毒、EBV、HepA、B和C、生物恐怖剂、放射 性核素和重金属以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
[0276] 在一个实施方案中，抗原为FcRn。
[0277] 用于本公开内容的抗体可使用本领域已知的任何适当的方法来获得。FcRn多肽/ 蛋白包括融合蛋白和其突变体，包括（重组地或天然地）表达多肽的细胞（例如活化T细 胞）可用于产生特异性识别FcRn的抗体。多肽可以是'成熟'多肽或其生物活性片段或衍 生物。人蛋白以编号P55899注册于Swiss-Prot中。在一个实施方案中，免疫原是FcRna 链或其片段。
[0278] 用于免疫宿主的多肽可通过本领域公知的方法从包含表达系统的遗传工程宿主 细胞来制备，或可从天然生物来源回收它们。在本申请中，术语"多肽"包括肽、多肽和蛋白 质。除非另有所指，否则这些术语可互换使用。FcRn多肽在一些情况下可以为更大的蛋白 质例如融合蛋白的部分，例如融合至亲和标记。
[0279] 可使用公知的常规方案（参见例如Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed·)，第 4卷，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，England, 1986)，通过 将多肽给动物，优选非人动物施用来获得针对FcRn多肽产生的抗体，其中动物的免疫是必 需的。可免疫许多温血动物，例如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和 大鼠通常是最适当的。
[0280] 在一个实施方案中，抗体可用于功能性改变目标抗原的活性。例如，抗体可直接或 间接中和、拮抗或激动所述抗原的活性，或仅阻断正常配体对其的结合。
[0281] 本发明还提供了包含突变的Tsp基因、编码突变的spr的突变spr基因、能够表达 或过表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因以及编码特异于FcRn的抗体或其 抗原结合片段的多核苷酸序列的重组革兰阴性细菌细胞，其中突变的Tsp基因编码具有降 低的蛋白酶活性的Tsp蛋白或为敲除突变的Tsp基因。
[0282] 各种抗-FcRn抗体和片段示于序列36至74中。
[0283] 在一个实施方案中，重链包含独立地选自SEQ ID N0:36、37和38的1、2或3个 CDR0
[0284] 在一个实施方案中，轻链包含独立地选自SEQ ID N0:39、40和41的1、2或3个 CDR0
[0285] 在一个实施方案中，抗体重链包含SEQ ID N0:36所示的⑶R-Hl的序列、SEQ ID N0:37所示的CDR-H2的序列和SEQ ID N0:38所示的CDRH3的序列。
[0286] 在一个实施方案中，抗体轻链包含SEQ ID N0:39所示的CDR-Ll的序列、SEQ ID N0:40所示的CDR-L2的序列和SEQ ID N0:41所示的CDRL3的序列。
[0287] 在一个实施方案中，抗体重链包含SEQ ID N0:36所示的⑶R-Hl的序列、SEQ ID NO:37所示的CDR-H2的序列、SEQ ID NO:38所示的CDRH3的序列、SEQ ID NO:39所示的 CDR-Ll的序列、SEQ ID N0:40所示的CDR-L2的序列和SEQ ID N0:41所示的CDRL3的序 列。
[0288] 在一个实施方案中，细胞表达具有本文中公开的序列的抗体分子。
[0289] 抗体分子包括抗体及其结合片段。
[0290] 适当地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体构架区以及一个或多个本文中 特别提供的CDR的可变结构域。因此，在一个实施方案中提供了结合人FcRn的人源化抗 体，其中可变结构域包含人受体构架区和非人供体CDR。在一个实例中，轻链可变结构域包 含SEQ ID N0:50所示的序列，重链可变结构域包含SEQ ID N0:58所示的序列。在一个实 例中，轻链包含SEQ ID NO:54所示的序列，重链包含SEQ ID NO:62所示的序列。
[0291] 表达后，可以例如通过缀合于另一个实体例如效应分子来进一步加工抗体片段。
[0292] 如本文中所用，术语效应分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素（例如细菌或植物 来源的酶促活性毒素及其片段，例如篦麻毒素及其片段）生物活性蛋白例如酶、其它抗体 或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段、放射性核 素、特别是放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团例如荧光化合 物或可通过NMR或ESR光谱学检测的化合物。可通过任何适当的方法将效应分子连接 于抗体或其片段，例如抗体片段可被修饰来连接至少一种效应分子，如W005/003171或 W005/003170(将其内容通过引用并入本文）中描述的。TO05/003171或TO05/003170还描 述了适当的效应分子。
[0293] 在一个实施方案中，如需要，可将抗体或其片段例如Fab进行PEG化，以产生具有 期望的性质（例如与完整抗体相似）的产物。例如，抗体可以是PEG化的抗-TNF-a Fab'， 如TO01/094585中描述的，优选地重链的C末端上的半胱氨酸残基之一连接于赖氨酰-马 来酰亚胺-衍生基团，其中赖氨酰残基的两个氨基的每一个共价连接于具有约20, OOODa的 分子量的甲氧基聚（乙二醇）残基，以便甲氧基聚（乙二醇）残基的总的平均分子量为约 40, OOODa，更优选赖氨酰-马来酰亚胺-衍生基团为[1-[[ [2-[[3-(2, 5-二氧-1-吡咯烷 基）-1_氧丙基]氨基]乙基]氨基]-羰基]-1，5-戊二基]双（亚氨基羰基）。
[0294] 在一个实施方案中，根据本公开内容的Fab或Fab'缀合于人血清白蛋白分子或淀 粉分子。
[0295] 细胞还可包含其它的编码一种或多种其它目标蛋白的多核苷酸序列。
[0296] 在一个实施方案中，已知在野生型中在纯化过程中与目标重组蛋白共 纯化的一种或多种大肠杆菌宿主蛋白被选择用于遗传修饰，如Humphreys等人 "Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab' fragments: changing the pi of the chromosomalIy encoded PhoS/PstS protein"，Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118 和 W004/035792(将 其内容通过引用并入本文）描述的。通过改变选择的大肠杆菌蛋白的物理性质以便它们不 再与重组抗体共纯化，这样的修饰宿主蛋白的使用改进了用于在大肠杆菌中产生的目标蛋 白，特别是抗体的纯化方法。优选地，被改变的大肠杆菌蛋白选自磷酸盐结合蛋白（PhoS/ PstS)、二肽结合蛋白（DppA)、麦芽糖结合蛋白（MBP)和硫氧还蛋白的一种或多种。
[0297] 在一个实施方案中，通过氨基酸标记至C末端或N末端的添加来改变污染性宿主 蛋白的物理性质。在优选实施方案中，被改变的物理性质是等电点，氨基酸标记是连接于C 末端的聚天冬氨酸标记。在一个实施方案中，通过添加所述标记改变的大肠杆菌蛋白是二 肽结合蛋白（DppA)、麦芽糖结合蛋白（MBP)、硫氧还蛋白和磷酸盐结合蛋白（PhoS/PstS)。 在一个具体实施方案中，通过添加包含包含6个天冬氨酸残基的聚天冬氨酸标记（polyD) 至C末端，使大肠杆菌磷酸盐结合蛋白（PhoS/PstS)的pi从7. 2降至5. 1。
[0298] 还优选的是单独地或与N或C末端标记的添加组合地修饰污染性大肠杆菌蛋白的 特定残基以改变其物理性质的。这样的变化可包括插入或缺失以改变蛋白的大小或氨基酸 置换以改变Pi或疏水性。在一个实施方案中，这些残基位于蛋白的表面。在优选实施方案 中，改变PhoS蛋白的表面残基以降低蛋白的pi。优选地，避开已表明在磷酸盐结合中非常 重要的残基（Bass，US5, 304, 472)以维持功能性PhoS蛋白。优选地，靶向远远伸出蛋白质 表面或存在于大群碱性残基中或附近的赖氨酸残基。在一个实施方案中，PhoS蛋白具有连 接于C末端的六聚天冬氨酸标记，同时分子的相对末端上的表面残基被靶向用于置换。优 选地，选择的赖氨酸残基被谷氨酸或天冬氨酸置换以赋予比当将中性残基改变成酸性残基 时更大的潜在Pl变化。本文中的置换突变体的命名由字母后跟数字后跟字母组成。第一 个字母表示野生型蛋白中的氨基酸。数字是指在其上进行氨基酸置换的氨基酸位置，第二 个字母表示用于替代野生型氨基酸的氨基酸。在本发明的PhoS的优选突变中，赖氨酸残基 (K)275、107、109、110、262、265、266、309、313作为单个突变或组合突变被谷氨酸（E)或谷 氨酰胺（Q)置换，此外赖氨酸（K) 318可以作为单个或组合突变被天冬氨酸（D)置换。优选 地单个突变为Κ262Ε、Κ265Ε和Κ266Ε。优选地，组合突变为Κ265/266Ε和Κ110/265/266Ε。 更优选，将所有突变与在C末端上连接的聚天冬氨酸（polyD)以及任选地还与K318D置换 组合。在优选实施方案中，突变导致至少Pl降低2个单位。优选地，本发明的突变使PhoS 的pi从7. 2降至约4与约5. 5之间。在本发明的一个实施方案中，通过使用突变polyD K318D、polyD Κ265/266Ε 和 polyD Κ110/265/266Ε 使大肠杆菌的 PhoS 蛋白的 pi 从 7. 2 分 别降至约4. 9,约4. 8和约4. 5。
[0299] 编码目标蛋白的多核苷酸可表达为与另一种多肽，优选信号序列的融合蛋白或在 成熟多肽的N末端上具有特定切割位点的其它多肽。选择的异源信号序列应当是被宿主细 胞识别和加工的信号序列。对于不识别和加工天然或真核多肽信号序列的原核宿主细胞， 用原核信号序列替换信号序列。适当的信号序列包括0mpA、PhoA、LamB、PelB、DsbA*DsbC。
[0300] 包含一种或多种上文所列组分的适当的载体的构建使用标准连接技术。以期望的 形式切割、裁剪和再连接分离的质粒或DNA片段，以产生需要的质粒。
[0301] 在一个实施方案中，将表达盒用于本发明以携带编码目标蛋白的多核苷酸，所述 表达盒通常包含编码一种或多种目标蛋白的一个或多个蛋白质编码序列和一个或多个调 控表达序列。一个或多个调控表达序列可包括启动子。一个或多个调控表达序列还可包括 3'非翻译区例如终止序列。在下文中更详细地描述适当的启动子。
[0302] 在一个实施方案中，根据本发明的细胞包含载体例如质粒。载体优选包含如上定 义的一个或多个表达盒。
[0303] 在其中目标蛋白是包含重链和轻链的抗体的实施方案中，可用两个载体来转染细 胞系，第一载体编码轻链多肽，第二载体编码重链多肽。或者，可使用单个载体，载体包括编 码轻链和重链多肽的序列。
[0304] 用于本发明的载体可通过将上文中定义的表达盒插入适当的载体来产生。或者， 可在载体中包含用于指导编码目标蛋白的多核苷酸序列表达的调控表达序列，从而可仅需 要多核苷酸的编码区来完成载体。
[0305] 可用于与根据本发明的多核苷酸一起转化宿主细胞的载体的实例包括质粒例如 PBR322或pACYC184,和/或病毒载体例如细菌噬菌体、转座遗传元件例如转座子。
[0306] 可获得许多形式的表达载体。这样的载体通常包含DNA复制的质粒起始点、抗生 素选择标记、通过多克隆位点分隔的启动子和转录终止子（表达盒）和编码核糖体结合位 点的DNA序列。
[0307] 用于本发明的启动子可直接连接于相关多核苷酸或可选择地位于适当的位置，例 如位于载体中，以便当插入相关多肽时，相关启动子可对作用于其。在一个实施方案中，启 动子位于其所作用的多核苷酸的编码部分之前，例如在多核苷酸的编码部分之前的每一个 相关启动子。如本文中所用，"……之前"意欲指启动子相对于编码多核苷酸部分位于5'末 端。
[0308] 启动子对于宿主细胞可以是内源性的或外源性的。适当的启动子包括lac、tac、 trp、phoA、Ipp、Arab、tet 和 T7〇
[0309] 使用的一个或多个启动子可以是诱导型启动子。
[0310] 用于细菌系统的表达单元通常还包含可操作地连接于编码目标多肽的DNA的 Shine-Dalgarno (S.D.)核糖体序列。
[0311] 表达载体优选地还包含用于产生抗体或其抗原结合片段的双顺反子信使，如WO 03/048208或W02007/039714(将其内容通过引用并入本文）中描述的。优选地，上游顺反 子包含编码抗体的轻链的DNA，下游顺反子包含编码对应的重链的DNA，双顺反子基因间序 列（IGS)优选地包含选自 IGS1(SEQ ID N0:38)、IGS2(SEQ ID N0:39)、IGS3(SEQ ID N0:40) 和 IGS4(SEQ ID N0:41)的序列。
[0312] 终止子可对于宿主细胞可以是内源性的或外源性的。适当的终止子是rrnB。
[0313] 其它适当的转录调控因子包括启动子和终止了以及蛋白质靶向法可见于 "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli"Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Septl996, p 512-538 中。
[0314] 抗体分子可通过适当的信号序列从细胞分泌或被靶向周质。或者，抗体分子可在 细胞的细胞质中积累。优选地抗体分子被靶向周质。
[0315] 本文中针对多核苷酸描述的本发明的实施方案同样地用于本发明的可选择的实 施方案，例如包含本文中使用的组分的载体、表达盒和/或宿主细胞，只要相关方面可用于 所述实施方案。
[0316] 本发明还提供了用于产生目标重组蛋白的方法，包括在重组革兰阴性细菌细胞中 表达目标重组蛋白，如在上文中在本发明的第一或第二方面中描述的。
[0317] 优选地用于本发明的方法的革兰阴性细菌细胞和目标蛋白在上文中进行了详细 描述。
[0318] 当编码目标蛋白的多核苷酸是外源性多核苷酸时，可使用本领域已知的任何适当 方法将多核苷酸整合入宿主细胞。通常地，将多核苷酸作为被转化入细胞的表达载体的部 分进行整合。因此，在一个方面，根据本发明的细胞包含含有编码目标蛋白的多核苷酸的表 达盒。
[0319] 可使用标准技术，例如使用氯化铷、PEG或电穿孔将多核苷酸序列转化进入细胞。
[0320] 根据本发明的方法还可使用选择系统来帮助选择已用编码目标蛋白的多核苷酸 成功转化的稳定细胞。选择系统通常使用编码选择标记的多核苷酸序列的共转化。在一个 实施方案中，每一个转化入细胞的多核苷酸还包含编码一个或多个选择标记的多核苷酸序 列。因此，编码目标蛋白的多核苷酸和一个或多个编码标记的多核苷酸的转化一起进行，并 且选择系统可用于选择产生期望的蛋白的那些细胞。
[0321] 能够表达一个或多个标记的细胞因整合在其中的选择系统的多肽/基因或多肽 组分赋予的性质（例如抗生素抗性）而能够在某些人为施加的条件（例如毒素或抗生素的 添加）下存活/生长/繁殖。不能表达一个或多个标记的那些细胞不能在人为施加的条件 下存活/生长/繁殖。可按需要选择更强烈的或不太强烈的人为施加的条件。
[0322] 可将任何适当的选择系统用于本发明。通常地，选择系统可基于在载体中包含一 个或多个提供针对已知抗生素的抗性的基因，例如四环素、氯霉素、卡那霉素或氨苄青霉素 抗性基因。可将在相关抗生素存在的情况下生长的细胞选择为表达提供针对抗生素的抗性 的基因和期望的蛋白。
[0323] 在一个实施方案中，根据本发明的方法还包括在培养基中培养转化细胞，从而表 达目标蛋白的步骤。
[0324] 可在本发明中使用诱导型表达系统或组成型启动子来表达目标蛋白。适当的诱导 型表达系统和组成型启动子在本领域中是公知的。
[0325] 任何适当的培养基可用于培养转化细胞。培养基可被改造来适用于特定的选择系 统，例如培养基可包含抗生素，以仅允许已被成功地转化的那些细胞在培养基中生长。
[0326] 可按需要将从培养基获得的细胞经历进一步筛选和/或纯化。方法还可按需要包 括一个或多个提取和纯化目标蛋白的步骤。
[0327] 可从菌株，包括从细胞质、周质或上清液回收多肽。
[0328] 在一个实施方案中，从周质分离抗体。
[0329] 在一个实施方案中，诱导后补料速率在5至7. 5g/h的范围内，例如约7g/h。
[0330] 用于纯化蛋白质的具体方法取决于蛋白质的类型。适当的方法包括在免疫亲和柱 或离子交换柱上进行的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC ;疏水相互作用层析；在硅土上进行 的层析；在离子交换树脂例如S-SEPHAROSE和DEAE上进行的层析；层析聚焦；硫酸铵沉淀； 和凝胶过滤。
[0331] 可利用常规抗体纯化法例如蛋白A-Sepharose、蛋白G层析、蛋白L层析、嗜硫、混 合模式树脂、His-标记、FLAG标记、轻基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、亲和层析、硫酸按、乙 醇或PEG分级分离/沉淀、离子交换膜、膨胀床吸附层析（EBA)或模拟移动床层析，将抗体 适当地与培养基和/或细胞质提取物和/或周质提取物分离。
[0332] 方法还可包括进一步的测量目标蛋白的表达的量和选择具有高表达水平的目标 蛋白的细胞的步骤。
[0333] 方法还包括一个或多个其它下游加工步骤例如目标蛋白例如抗体或抗体片段的 PEG 化。
[0334] 可在适当的容器例如生物反应器中组合地进行本文中描述的一个或多个方法步 骤。
[0335] 根据本公开内容的抗体和片段可用于治疗或预防。
[0336] 当技术上适当时可组合本发明的实施方案。实施方案在本文中描述为包含某些特 征/成分。公开内容还扩展至由所述特征/成分组成或基本上由其组成的单独的实施方案。 将本文中的技术参考资料例如专利和申请通过引用并入本文。
[0337] 仅在下列实施方例中通过举例说明的方式进一步描述本发明，所述实施例参考附 图。 实施例
[0338] 实施例1:细胞系的产生
[0339] TO2011/086136 中给出了 MXE016 和 MXE017 的产生。
[0340] 用于抗-FcRn Fab' 表达和抗-FcRn Fab' 与 FkpA、抗-FcRn Fab' 与 skp 以及 抗-FcRn Fab与FkpA和skp的表达的质粒的产生
[0341] 构建包含抗-FcRn Fab的重链和轻链序列（分别地SEQ ID NO:63和55)的质粒。 使用常规限制性克隆法构建质粒PTTOD 1519. g57Fab'，所述克隆法可见于Sambrook等人 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N. Y.中。质粒 pTTOD 1519. g57Fab'包含下列特性：强tac启动子和lac操纵子序列。质粒在Fab'重链的编码区之后 包含唯一的EcoRI限制性位点，随后是包含强核糖体结合位点的非编码序列和随后唯一的 NdeI限制性位点。
[0342] Fab轻链、重链基因被转录为单个多顺反子信使。将编码来自大肠杆菌OmpA蛋白 的信号肽的DNA融合于轻链和重链基因序列的5'末端，所述信号肽指导多肽至大肠杆菌周 质的转运。使用双重转录终止子rrnB tlt2终止转录。IacIq基因编码组成型表达的Lac I阻遏蛋白。这阻遏从tac启动子的转录直至通过异乳糖或IPTG的存在诱导去阻遏。使用 的复制起始点为P15A，其维持低拷贝数。质粒包含用于抗生素选择的四环素抗性基因。
[0343] 通过使用EcoRI和NdeI位点将FkpA连接于pTTOD 1519. g57Fab'的Fab'序列的 3'末端来构建质粒pTTOD 1519. g57Fab' FkpA(用于抗-FcRn Fab和FkpA(周质多肽）的 表达载体）（参见图7d)。合成地构建FkpA(SEQ ID N0:30)以除去2个Puv II位点、SfuI 位点、BamHI位点和EcoRI，以便新构建体编码5' EcoRI位点，随后强核糖体结合位点，随后 FkpA的天然起始密码子、信号序列和成熟序列，终止于C末端His标记以及最后的强核糖体 结合位点和之后的非编码NdeI位点。将Ec 0RI-NdeI限制性片段进行限制性内切酶消化， 随后连接入表达载体，以便在单个多顺反子mRNA上编码所有3个多肽：Fab'轻链、Fab'重 链和FkpA。
[0344] 通过使用EcoRI和NdeI位点将skp连接于质粒pTTOD 1519. g57Fab'的Fab'序 列的3'末端来构建质粒pTTOD 1519. g57Fab' Skp (用于抗-FcRn Fab和Skp (周质多肽） 的表达载体）。合成地构建skp (SEQ ID NO: 34)以除去4个Pst I位点和EcoRV位点，以便 新构建体编码5' EcoRI位点，随后强核糖体结合位点，随后Skp的天然起始密码子、信号序 列和成熟序列，终止于C末端His标记以及最后的强核糖体结合位点和之后的非编码NdeI 位点。将Ec0RI-NdeI限制性片段进行限制性内切酶消化，随后连接入表达载体，以便在单 个多顺反子mRNA上编码所有3个多肽：Fab'轻链、Fab'重链和skp。
[0345] 通过使用NdeI位点将skp在FkpA序列的3'末端连接入质粒pTTOD 1519. g57Fab'FkpA 来构建质粒 pTTOD 1519.g57Fab'FkpA Skp(用于抗-FcRn Fab、FkpA 和 Skp(两 者为周质多肽）的表达载体）。合成地构建Skp (SEQ ID NO: 34)以除去4个Pst I位点和 EcoRV位点，以便构建体编码5'Ase I位点，包括skp的天然起始密码子、信号序列和成熟序 列，终止于C末端His标记以及最后非编码NdeI位点。将AseI-NdeI限制性片段进行限制 性内切酶消化，随后连接入表达载体，以便在单个多顺反子mRNA上编码所有4个多肽：Fab' 轻链、Fab'重链、FkpA和Skp。
[0346] pTTOD 1519. g57Fab'、pTTOD 1519. g57Fab' FkpA、pTT0D1519. g57Fab' Skp 和 pTTOD 1519. g57Fab'FkpA skp 在大肠杆菌 W3110、MXE012(大肠杆菌 W31 IOspr H145A)、 MXE016(大肠杆菌 W3110ATsp，spr C94A)和 MXE017(大肠杆菌 W3110ATsp，spr H145A)中 的发酵
[0347] 用实施例 1 中产生的质粒 pTTOD 1519. g57Fab'、pTTOD1519. g57Fab' FkpA、pTTOD 1519. g57Fab'Skp 和 pTTOD 1519. g57Fab'FkpA Skp 转化大肠杆菌菌株 W3110、MXE012、 MXE016和MXE017。使用 Chung C. T等人Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175(1989)中发现的方法进行菌株的转化。通过发 酵测试这些转化菌株的表达。
[0348] 实施例2:伴侣蛋白对Fab'表达的作用：在IL和2. 5L发酵实验中比较Fab'的表 达来测试图1中显示的菌株：
[0349] 生长培养基、接种物和发酵步骤。在接种生产发酵罐之前，通过从1小瓶细胞库制 备接种物和通过数个预培养阶段（培养瓶和反应器）的扩增开始发酵过程。在生产发酵罐 中，以分批和补料分批模式将细胞在成分确定的培养基中生长至高密度。当达到期望的细 胞密度时，通过添加 IPTG诱导Fab'的表达。Fab'表达被靶向至大肠杆菌周质空间，其中 Fab'在整个诱导期的过程中积累。在诱导期中施用碳源补料以控制表达和细胞生长。控制 温度、溶解氧（PO2)和pH以将培养物维持在最佳培养条件中。
[0350] 生物质浓度和生长速率的测量。通过测量600nm处培养物的光密度来测定生物质 浓度。
[0351] 周质提取。通过离心从培养物样品收集细胞。保留（在_20°C )上清液级分以进 行进一步分析。将细胞沉淀级分于提取缓冲液（lOOmMTris-HCl，IOmM EDTA ;pH 7. 4)中重 悬浮至原始培养体积。在于60°C温育约10至12小时后，通过离心澄清提取物，将上清液级 分立即用于分析或贮存（在_20°C )以待分析。
[0352] Fab'定量。通过使用蛋白G HPLC测定周质提取物和培养上清液中的Fab'浓度。 将分析物（大致中性pH, 30°C，0· 2 μ m过滤的）以2ml/min加载至HiTrap Protein-G HP Iml柱（GE-Healthcare或相当的），用20mM磷酸盐，50mM NaCl pH 7. 4洗涤柱子，随后使 用50mM甘氨酸/HCl pH 2. 7的注射液洗脱Fab'。在Agilent 1100或1200HPLC系统上通 过A280测量洗脱的Fab'，通过参照具有已知浓度的纯化的Fab'蛋白的标准曲线来进行定 量。
[0353] 图1显示利用宿主细胞与"伴侣蛋白"的各种组合进行的46个5L规模的发酵的 结果。W3110是野生型大肠杆菌菌株。各种组合是：野生型但无伴侣蛋白、野生型与FkpA和 Skp、W02011/086136 中公开的 MXE016 突变 spr 和 Δ Tsp、MXE016 与 FkpA、MXE016 与 Skp、 MXE016 与 FkpA 和 Skp、W02011/086136 中公开的 MXE017、MXE017 与 FkpA 和 Skp。
[0354] 结果显示 MXE016、MXE016 与 FkpA、MXE016 与 FkpA 和 Skp，以及 MXE017 与 FkpA 和 Skp显示最好水平的表达。
[0355] 实施例3:诱导后补料速率的作用
[0356] 对MXE016和MXE016+FkpA测试3个不同的诱导后补料速率5. 4、6. 0和7. 0g/h的 作用。
[0357] 生长培养基、接种物和发酵步骤。在接种生产发酵罐之前，通过从一小瓶细胞库制 备接种物和通过数个预培养阶段（培养瓶和反应器）的扩增开始发酵过程。在生产发酵罐 中，以分批和补料分批模式将细胞在成分确定的培养基中生长至高密度。当达到期望的细 胞密度时，通过添加 IPTG诱导Fab'表达。Fab'表达被靶向至大肠杆菌周质空间，其中Fab' 在整个诱导期的过程中积累。在接种期中施用碳源补料以控制表达和细胞生长，在该实验 中将补料速率设置为3个单独的设定值（图中显示的）。控制温度、溶解氧（p0 2)和pH以 将培养物维持在最佳培养条件中。
[0358] 图2显示利用不表达伴侣蛋白或表达FkpA的质粒转化的菌株MXE016。该图显示 递增的诱导后补料速率在具有和不具有FkpA的情况下对Fab'的产生和周质中的保留的作 用。数据显示当在不具有FkpA的情况下增加补料速率时，额外产生的Fab'丢失至上清液。 对于FkpA的表达，情况并非这样，其中在更高的补料速率下产生的额外的Fab'保留在周质 内，从而导致更高的滴度。
[0359] 实施例4:产率和细胞活力的分析
[0360] 图3A和B显示在20L规模上对利用不表达伴侣蛋白或表达FkpA的质粒转化的 MXE016的细胞活力和Fab'滴度的作用。图3A显示细胞活力在无 FkpA存在的情况下更低。 3b显示对于MXEO 16+FkpA，Fab'滴度更高并且变化较小。
[0361] 图4显示利用MXEO 16+FkpA产生的更高滴度导致初步Fab产物回收后30 %更多的 Fab'。
[0362] 图5和6显示来自无伴侣蛋白的MXE016和具有FkpA表达的MXE016的初步回收 的样品的SDS-PAGE和抗-his标记western印迹。
[0363] 根据Fab'浓度以每泳道加载1 □ g Fab'来加载样品。凝胶为4-20% Tris-Glycine Novex并且在非还原条件下于125V电泳2小时。利用Sypro Ruby染色对凝胶进行染色，随 后成像。使用Invitrogen iBlot系统将western印迹转移至PVDF膜，随后用1 %酪蛋白溶 液进行封闭。随后用抗-his HRP缀合物抗体（Novagen)探测膜。随后用ECL溶液对印迹 进行显影，使用 Amersham Life Sciences HyperProcesser 进行成像。
[0364] 虽然已参考优选实施方案特别地显示和描述了本发明，但本领域技术人员应理 解，可产生形式和内容的各种变化而不背离由所附权利要求定义的本发明的范围。
【权利要求】
1. 一种重组革兰阴性细菌细胞，其包含： a?编码在选自 D133、H145、H157、N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、 Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸上具有突变的spr蛋白的突变 spr基因和 b.能够表达或过表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白例如FkpA、Skp、SurA、 PPiA和PPiD的基因 其中所述细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性。
2. 权利要求1的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自D133A、H145A、H157A、 N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、V135D、V135G、L136P、 G140C、R144C和G147C的一个或多个突变的spr蛋白。
3. 权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自S95F、V98E、Y115F、D133A、 V13?、V135G和G147C的一个或多个突变的spr蛋白。
4. 权利要求3的细胞，其中所述突变spr基因编码具有突变C94和H145A例如C94的 spr蛋白。
5. 权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自D133A、H145A和H157A的 突变的spr蛋白。
6. 权利要求1的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自C94A的突变的spr蛋白。
7. 任何前述权利要求的细胞，其中将所述突变spr基因整合入细胞的基因组。
8. 任何前述权利要求的细胞，其中将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因例如在质 粒上瞬时转染入细胞。
9. 权利要求1至7的任一项的细胞，其中将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因整 合进入细胞基因组。
10. 任何前述权利要求的细胞，其中所述能够促进蛋白质折叠的蛋白为FkpA、Skp或 FkpA与Skp的组合，特别是FkpA。
11. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞还包含下列突变的基因的一个或多个： a. 编码具有伴侣蛋白活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因； b. 突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶 III蛋白或为敲除突变的ptr基因；和 c. 突变的OmpT基因，其中所述突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋 白或为敲除突变的OmpT基因。
12. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp 蛋白的突变的Tsp基因，或为敲除突变的Tsp基因。
13. 权利要求12的细胞，其中所述细胞的基因组，除突变的spr基因和突变的Tsp基因 夕卜，与野生型细菌细胞是同基因的。
14. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞不包含编码DsbC的基因。
15. -种重组革兰阴性细菌细胞，其相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，并且 具有编码能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白的突变spr基因，和适合 用于表达能够促进蛋白质折叠的蛋白的编码FkpA、Skp或FkpA与Skp的组合，特别是FkpA 的基因，其中除相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰和突变的spr基因外，所述 细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的。
16. 权利要求15的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自N31Y、R62C、I70T、Q73R、 C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、 H145A、G147C、H157A和W174R的一个或多个突变的spr蛋白。
17. 权利要求15的细胞，其中所述突变spr基因编码具有一个或多个权利要求1至6 的任一项中定义的突变的spr蛋白。
18. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞具有敲除突变的Tsp基因，所述基因包含 针对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的一 个或多个终止密码子。
19. 权利要求18的细胞，其中所述敲除突变的Tsp基因包含通过针对基因起始密码子 的错义突变产生的限制性标记位点和任选地一个或多个其它点突变。
20. 权利要求19的细胞，其中所述敲除突变的Tsp基因包含SEQ ID NO:3。
21. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌，例如其中所述大肠杆菌是菌 株 K12 或 W3110。
22. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞包含编码目标蛋白的多核苷酸序列。
23. 权利要求21的细胞，其中所述目标蛋白为抗体或其抗原结合片段。
24. 权利要求22的细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段特异于FcRn。
25. -种重组革兰阴性细菌细胞，其相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性并且 包含编码突变spr蛋白的突变spr基因，以及编码适合用于表达能够促进蛋白质折叠的蛋 白的基因的基因和编码特异于FcRn的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。
26. 权利要求25的细胞，其中所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的 突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。
27. -种用于产生目标蛋白的方法，包括在对于表达目标重组蛋白是有效的条件下于 培养基中培养权利要求1至26的任一项中定义的重组革兰阴性细菌细胞，和从重组革兰阴 性细菌细胞的周质和/或培养基回收目标重组蛋白。
28. 权利要求27的方法，其中所述方法还包括从细胞回收目标蛋白。
29. 权利要求28的方法，其中从周质和/或上清液回收目标蛋白。
【文档编号】C12N15/70GK104487454SQ201380025191
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2012年5月14日
【发明者】P·J·巴塞特, D·P·哈姆费雷斯, P·M·帕特尔 申请人:Ucb医药有限公司