使用醛肟脱水酶从萜肟产生萜腈的方法
【专利摘要】本发明涉及使用肟脱水酶从肟生物催化地产生腈的新方法和具有肟脱水酶活性的新突变体及其在用于生物催化产生腈的方法，如特别地用于从柠檬醛肟、橙花醛肟、香叶醛肟或香茅醛肟产生柠檬醛腈、橙花醛腈、香叶醛腈或香茅腈的方法中的用途；和可用于此的肟脱水酶、其核苷酸序列和包含所述核苷酸序列的表达构建体或微生物。
【专利说明】使用醛肟脱水酶从萜肟产生萜腈的方法
[0001] 本发明涉及使用肟脱水酶从肟以生物催化方式产生腈的新方法和具有肟脱水酶 活性的新突变体及其用于生物催化产生腈的方法，如尤其用于从柠檬醛肟、橙花醛肟、香叶 醛肟或香茅醛肟产生柠檬醛腈、橙花醛腈、香叶醛腈或香茅腈的方法中的用途；和可用于此 的肟脱水酶、其核苷酸序列和包含它们的表达构建体或微生物。
【背景技术】
[0002] 萜类是源自异戊二烯骨架并且尤其在自然界中作为生物中存在的次级物质、尤其 作为植物中的次生物质存在的有机化合物。萜类经常是有香味或芳香的物质，并且可以例 如从植物衍生的精油获得。因此，使用萜类和萜衍生物作为化妆品、身体护理领域产品的成 分或用于清洁产品，例如在香水、护肤液、沐浴露、皂类、洗涤剂或清洁剂中作为香味物质或 芳香物质的混合物。取决于所用的化合物，可以产生多种香韵，例如相应产品的刺激性的、 清新、柑橘样或花香味。
[0003] 由化学工业为相应产品的混合物所提供的相应起始产物经常是萜类或萜衍生物 的腈。例子是具有强烈清新、柑橘样气味的香叶腈或具有玫瑰样芳香的香茅腈。
[0004] 相应的腈作为天然产物分离或从合适前体化学地合成。因此， 申请人:的WO 2006/106141描述了从作为前体的不饱和腈产生饱和腈。EPO 491 127描述了添加不饱和 腈到己烯醇上，获得修饰的腈。在这两种情况下，均使用已经包含腈基团的起始化合物。因 此，需要还可以使用除腈之外的前体的方法。DE 3139358描述了通过肟化学反应为相应的 腈产生香味的方法。在这种方法的情况下，必需的脱水作用要求极端反应条件，尤其是苛性 脱水剂和沸腾温度。
[0005] 因此需要从肟产生腈的替代性方法，尤其在较温和反应条件下发生的方法。另外， 需要用于实施这种方法的合适试剂。
[0006] 发明简沭
[0007] 上文提到的第一个问题由一种用于产生通式I的腈的生物催化方法解决，
[0008]
[0009] 其中
【权利要求】
1. 用于产生通式I的腈的生物催化方法 其中
R代表直链或单次或多重分支的、饱和或单不饱和或多不饱和的、任选地单次或多重取 代的具有4至19个碳原子的脂族烃残基；和 n代表1或2 ; 其中 a) 通式II的肟
其中R和n具有上文给出的含义，其中式II的化合物处于立体异构纯形式或作为立体 异构体的混合物， 在脂族醛肟脱水酶（4. 99. 1. 5)、苯基乙醛肟脱水酶（PAOx) (EC4. 99. 1. 7)或吲哚乙醛 肟脱水酶（4. 99. 1. 6)存在下转化成式I的化合物，其中式I的化合物处于立体异构纯形式 或作为立体异构体的混合物，和 b) 任选地，然后进一步纯化反应产物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中PAOx是来自红球菌属物种（Rhodococcus sp.)、 玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae)或特别地来自芽孢杆菌属物种（Bacillus sp.)的酶。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中PAOx具有根据SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或 与这个序列至少60 %同一的氨基酸序列。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使式II的肟反应，式II中残基R，连 同与之结合的碳原子，衍生自非环状廠残基，选自半廠（C5)、单廠（Cltl)、倍半廠（C 15)、二廠 (c2。)、二倍半萜（C25)、三萜（C3tl)或四萜（C 4tl)残基（特别地被部分或完全氢化），或衍生自 已经缩短1至3个碳原子的相应萜残基。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使式II的肟反应，其中n代表1并且 残基R具有上文给出的含义之一。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使选自柠檬醛肟、橙花醛肟、香叶醛 肟、香茅醛肟和它们的部分或完全氢化的类似物如6, 7-二氢香茅肟的式II化合物转化成 相应的腈。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中式IIa的香茅醛肟
其中式IIa的化合物以立体异构纯形式或作为立体异构混合物如特别地作为R/S和/ 或E/Z混合物使用。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中反应在PAOx、含有PAOx的蛋白质混合 物存在下或在功能性表达PAOx的重组微生物、从其衍生的含有PAOx的细胞匀浆或其含有 PAOx的级分存在下酶促地进行。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中PAOx或功能性表达PAOx的微生物在 反应混合物中以游离形式或以固定化形式存在。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中重组微生物是功能性表达PAOx的细菌菌株， 特别地是大肠杆菌菌株。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中重组微生物携带具有编码PAOx的核酸序列的表 达构建体，所述核酸序列任选地适应于所述微生物的密码子选择。
12. 根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中微生物额外地表达至少一种支持 PAOx功能性表达（正确折叠）的伴侣蛋白。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中重组微生物是除了表达PAOx之外还表达一种或 多种选自GroEL和GroES的伴侣蛋白的细菌菌株。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在作为反应介质的底物中实施反应。
15. 编码PAOx的根据SEQ ID NO:3的核酸序列，其中该核酸序列适应于微生物大肠杆 菌的密码子选择。
16. 表达构建体，其根据权利要求11至14的任一项中定义或包含根据权利要求15所 述的核酸序列。
17. 重组微生物，其根据权利要求8至13的任一项中定义或包含根据权利要求15所述 的核酸序列或根据权利要求16所述的表达构建体。
【文档编号】C12P13/00GK104364387SQ201380024702
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年3月11日 优先权日:2012年3月13日
【发明者】A·皮亚特西, W·塞格尔, K-U·鲍尔代纽斯 申请人:巴斯夫欧洲公司