含硫酸化化合物的干细胞增殖用培养基的制作方法
【专利摘要】本发明提供含成纤维细胞生长因子(FGF)的干细胞增殖用培养基，其特征在于，以在FGF存在下起到促进干细胞增殖的作用的浓度含硫酸化化合物或其药学上可接受的盐；使用含FGF的干细胞增殖用培养基的干细胞的培养方法，其特征在于，以在FGF存在下起到促进干细胞增殖的作用的浓度，向培养基中添加硫酸化化合物或其药学上可接受的盐。
【专利说明】含硫酸化化合物的干细胞增殖用培养基 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及使用含成纤维细胞生长因子的干细胞增殖用培养基、所述培养基的干 细胞的培养方法等。 【【背景技术】】
[0002] 以往、干细胞（胚胎干细胞、人工多能性干细胞等）的培养一直使用含有血清的培 养基进行。例如，胎牛血清（FBS)等作为对于细胞增殖重要的添加物而在细胞培养中广泛 使用。但是，将培养后的干细胞以医疗目的使用时，异种来源成分有成为血液媒介病原菌的 感染源或异种抗原的可能性。另外，也有由于血清的批间差而在培养结果上发生偏差的可 能性。因此，在近年，使用化学组成明了的培养基（chemically defined medium)培养干细 胞成为主流，无血清培养基的开发被推进。
[0003] 成纤维细胞生长因子（FGF)是促进成纤维细胞或内皮细胞的增殖的分子量 16, 000?20, 000的蛋白质。在FGF中包括：碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、酸性成纤 维细胞生长因子（aFGF)、角质细胞生长因子（KGF)等，在人及小鼠中各自已知20种以上的 FGF。FGF为了稳定进行干细胞的培养而一般地被添加到培养基中，在无血清培养基中也是 重要性高的成分之一。但是已知，FGF不仅与其他成分相比价格高，在培养基中的稳定性也 低，从而伴随在细胞培养中要求高频度的培养基更换的要因。
[0004] 至今被报告，硫酸化多糖类有保护FGF免于分解、变性、失活等的作用。
[0005] 在专利文献1中公开，角叉菜胶使bFGF稳定化。在所述文献的实施例中记 载，肝素、硫酸葡聚糖、角叉菜胶等的含硫酸化多糖类的保护剂保护5倍量（w/w)的 bFGF(180ii g/200iil)免于由胰蛋白酶的水解（实施例1)及由热的变性（实施例3)。还 公开，在免于由胰蛋白酶的水解的保护中，相对于所述保护剂的bFGF的重量比有是5?7 以下的必要（实施例2)。
[0006] 在专利文献2中公开了使FGF或其突变蛋白和硫酸化葡聚糖在水性介质中接触作 为特征的FGF或其突变蛋白的稳定化方法等。在所述文献的实施例中公开，由硫酸化葡聚 糖的添加，在水性介质中FGF的活性被保持稳定。
[0007] 另外，在非专利文献1中记载，肝素或己糖醛酰己糖氨基聚糖硫酸（HHS-4)保护 bFGF免于失活，增强其生理活性，还记载，所述效果仅在使高浓度的肝素（20 yg/ml)或 HHS-4 (200 ii g/ml)与细胞接触时见到，对于肝素而言，以高浓度（也依赖于bFGF的浓度，但 例如IOu g/ml以上）则见到被看作是毒性的细胞增殖抑制。
[0008] 在另外专利文献3中公开，葡聚糖多硫酸、肝素等的多硫酸化多糖类或其有生物 学活性的分子片段显示发挥含多分化能细胞的前体细胞的保护、生存率改善及分化调节的 功能，与多硫酸化多糖类或其有生物学活性的分子片段一同含前体细胞的组合物。据记载， 所述组合物中的多硫酸化多糖类的浓度是500ng/ml?lOmg/ml的范围。据记载,在所述组 合物中可再含FGF，但对多硫酸化多糖类的上述功能和FGF的关系则完全无公开。
[0009] 在另外专利文献4中记载，葡萄糖的聚合物等的由糖质构成的高分子促进人间质 干细胞的增殖，但公开由糖质构成的高分子的有效浓度是2. 5mg/ml?lOOmg/ml的范围。
[0010] 另一方面，多糖以外的高分子有机化合物的硫酸化物是否均有保护FGF免于分 解、变性、失活等的作用，或者是否在细胞培养中给细胞的增殖造成影响则完全不知。
[0011] 【现有技术文献】
[0012] 【专利文献】
[0013] 专利文献1:国际公开第92/13526号单行本
[0014] 专利文献2:特开平02-138223号公报
[0015] 专利文献3:国际公开第2009/070842号单行本
[0016] 专利文献4:国际公开第2011/108993号单行本
[0017] 【非专利文献】
[0018] 非专利文献 1:J. Cell. Physiol.、1986、128、475-484 【
【发明内容】
】
[0019]【发明要解决的技术课题】
[0020] 本发明旨在提供在含FGF的干细胞增殖用培养基中促进干细胞的增殖的手段。再 者，本发明旨在提供使用含FGF的干细胞增殖用培养基的干细胞的培养方法等。
[0021] 【解决课题的技术方案】
[0022] 本发明人为达成上述目的进行锐意探讨的结果发现，硫酸化化合物可抑制干细胞 增殖用培养基中的FGF的蛋白质量降低，及在FGF的存在下促进干细胞的增殖。为了发挥 在FGF存在下的干细胞的增殖促进效果而详细地探讨必要的硫酸化化合物的浓度时，意外 发现，在FGF的蛋白质量降低的抑制效果低的浓度范围将硫酸化化合物添加到培养基中时 也存在确认在FGF存在下的显著的干细胞的增殖促进效果的化合物。本发明人基于这些见 解重复再研究的结果，完成本发明。
[0023] SP，本发明如下。
[0024] [1]含成纤维细胞生长因子（FGF)的干细胞增殖用培养基，其特征在于，以在FGF 存在下起到促进干细胞增殖的作用的浓度含硫酸化化合物或其药学上可接受的盐，其中， 在硫酸化化合物是硫酸化多糖时的硫酸化化合物的含量是250ng/ml以下。
[0025] [2] [1]所述的培养基，其中硫酸化化合物是硫酸化糖类，其中，在硫酸化糖类是硫 酸化多糖时的硫酸化糖类的含量是250ng/ml以下。
[0026] [3] [2]所述的培养基，其中所述硫酸化糖类是选自下列的至少一种：
[0027] (I)含1个或2个以上的从下述通式（a)所示的化合物衍生的构成单元、且含1个 或2个以上的硫酸基的化合物：
[0028]【化学式1】
[0029]
【权利要求】
1. 含成纤维细胞生长因子（FGF)的干细胞增殖用培养基，其特征在于，以在FGF存在下 起到促进干细胞增殖的作用的浓度含硫酸化化合物或其药学上可接受的盐，其中，在硫酸 化化合物是硫酸化多糖时的硫酸化化合物的含量是250ng/ml以下。
2. 权利要求1所述的培养基，其中硫酸化化合物是硫酸化糖类，其中，在硫酸化糖类是 硫酸化多糖时的硫酸化糖类的含量是250ng/ml以下。
3. 权利要求2所述的培养基，其中所述硫酸化糖类是选自下列的至少一种： (I) 含1个或2个以上的从下述通式（a)所示的化合物衍生的构成单元、且含1个或2 个以上的硫酸基的化合物： 【化学式1】 式中，
na 是 1、2 或 3， Rla及R3a相同或不同，且各是任选具有取代基的官能团， na个R2a各自独立地是任选具有取代基的官能团、 (II) 下述通式（b)所示的化合物： 【化学式2】 式中，
nb是3?100的整数， nb个Rlb各自独立地是任选具有取代基的官能团， 含1个或2个以上的硫酸基、及 (III) 下述通式（c)所示的化合物： 【化学式3】
式中， nc 是 1、2 或 3， 俨?俨相同或不同，且各是任选具有取代基的官能团， nc个R5c;各自独立地是任选具有取代基的官能团， 含1个或2个以上的硫酸基。
4. 权利要求2或3所述的培养基，其中硫酸化糖类是选自下列的至少一种：硫酸化单 糖、硫酸化二糖、硫酸化多糖、硫酸化糖醇及硫酸化环多醇。
5. 权利要求2?4中任一项所述的培养基，其中在硫酸化糖类中的硫的含量是5重 量％以上。
6. 权利要求2?5中任一项所述的培养基，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受 的盐是选自下列的至少一种：硫酸葡聚糖Na、纤维素 S03Na、黄原胶S03Na、果胶S03Na、墨角 藻聚糖、藻酸S03Na、菊粉S03Na、麦芽七糖S03Na、水苏糖S0 3Na、麦芽三糖S03Na、麦芽糖醇 S03Na、蔗糖8S03K、葡萄糖S03Na、肌-6肌醇S0 3K、a -环糊精S03Na、甘露糖醇S03Na、木糖醇 SO3Na及赤藓糖醇S03Na。
7. 权利要求6所述的培养基，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受的盐是选自下列 的至少一种：硫酸葡聚糖Na、墨角藻聚糖、黄原胶S03Na、果胶S03Na、麦芽七糖S0 3Na、麦芽三 糖S03Na、麦芽糖醇SO3Na及蔗糖8S03K。
8. 权利要求2?7中任一项所述的培养基，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受的 盐是平均分子量2, 500?7, 500的硫酸葡聚糖Na。
9. 权利要求2?7中任一项所述的培养基，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受的 盐是鹿糖8S03K。
10. 权利要求9所述的培养基，其中所述蔗糖8S03K的含量是25pg/ml?10 i! g/ml。
11. 权利要求1所述的培养基，其中硫酸化化合物是硫酸化聚合物，但是，硫酸化糖类 除外。
12. 权利要求11所述的培养基，其中所述硫酸化聚合物是下述通式（I)所示的、且含1 个或2个以上的磺基的化合物： 【化学式4】 式中，
A是聚合物构成单元， n是1?1500的整数， R1是任选具有取代基的官能团。
13. 权利要求11或12所述的培养基，其中在硫酸化聚合物中的硫的含量是5重量％以 上。
14. 权利要求11?13中任一项所述的培养基，其中硫酸化聚合物是选自下列的至少一 种：含有磺基的聚乙烯基醇、含有磺基的聚乙烯基胺、含有磺基的聚烯丙基胺、含有磺基的 聚乙烯亚胺、含有磺基的a-聚赖氨酸、含有磺基的a-聚谷氨酸甲酯/ a-5-羟基正缬氨 酸（2/8)共聚物、a-聚谷氨酸-Y-牛磺酸、含有磺基的三丝氨酸、含有磺基的丝氨酸、含 有磺基的分支型聚甘油及其衍生物、以及聚乙烯磺酸。
15. 权利要求14所述的培养基，其中含有磺基的分支型聚甘油的衍生物或其药学上可 接受的盐是分支型聚甘油-单甲基四乙二醇_S03Na、分支型聚甘油-2-糠基-SO3Na或分支 型聚甘油-异丙基氧基-S03Na。
16. 权利要求1所述的培养基，其中硫酸化化合物是利用二异氰酸酯化合物形成的糖 类的交联聚合物的硫酸化物。
17. 权利要求16所述的培养基，其中利用二异氰酸酯化合物形成的糖类的交联聚合物 的硫酸化物或其药学上可接受的盐是麦芽三糖-六亚甲基二异氰酸酯SO3Na或葡聚糖-六 亚甲基二异氰酸酯S03Na。
18. 权利要求1所述的培养基，其中硫酸化化合物是糖内酯的硫酸化物。
19. 权利要求18所述的培养基，其中糖内酯的硫酸化物或其药学上可接受的盐是葡萄 糖酸内酯-SO3Na。
20. 权利要求1所述的培养基，其中硫酸化化合物是有机酸的硫酸化物。
21. 权利要求20所述的培养基，其中有机酸的硫酸化物或其药学上可接受的盐是酒石 酸-SO3Na。
22. 权利要求1?21中任一项所述的培养基，其中成纤维细胞生长因子是碱性成纤维 细胞生长因子。
23. 权利要求1?22中任一项所述的培养基，其中所述干细胞是间质干细胞、胚胎干细 胞或人工多能性干细胞。
24. 使用含FGF的干细胞增殖用培养基的干细胞的培养方法，其特征在于，以在FGF存 在下起到促进干细胞增殖的作用的浓度，向培养基中添加硫酸化化合物或其药学上可接受 的盐，其中，在硫酸化化合物是硫酸化多糖时的硫酸化化合物的含量是250ng/ml以下。
25. 权利要求24所述的方法，其中硫酸化化合物是硫酸化糖类，其中，在硫酸化糖类是 硫酸化多糖时的硫酸化糖类的含量是250ng/ml以下。
26. 权利要求25所述的方法，其中所述硫酸化糖类是选自下列的至少一种： (I) 含1个或2个以上的从下述通式（a)所示的化合物衍生的构成单元、且含1个或2 个以上的硫酸基的化合物：
【化学式5】 式中， na 是 1、2 或 3， Rla及R3a相同或不同，且各是任选具有取代基的官能团， na个R2a各自独立地是任选具有取代基的官能团、 (II) 下述通式（b)所示的化合物： 【化学式6】 式中，
nb是3?100的整数， nb个Rlb各自独立地是任选具有取代基的官能团， 含1个或2个以上的硫酸基、及 (III)下述通式（c)所示的化合物： 【化学式7】 式中，
nc 是 1、2 或 3， 俨?俨相同或不同，且各是任选具有取代基的官能团， nc个R5c;各自独立地是任选具有取代基的官能团， 含1个或2个以上的硫酸基。
27. 权利要求25或26所述的方法，其中硫酸化糖类是选自下列的至少一种：硫酸化单 糖、硫酸化二糖、硫酸化多糖、硫酸化糖醇及硫酸化环多醇。
28. 权利要求25?27中任一项所述的方法，其中在硫酸化糖类中的硫的含量是5重 量％以上。
29. 权利要求25?28中任一项所述的方法，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受 的盐是选自下列的至少一种：硫酸葡聚糖Na、纤维素 S03Na、黄原胶S03Na、果胶S03Na、墨角 藻聚糖、藻酸S03Na、菊粉S03Na、麦芽七糖S03Na、水苏糖S0 3Na、麦芽三糖S03Na、麦芽糖醇 S03Na、蔗糖8S03K、葡萄糖S03Na、肌-6肌醇S0 3K、a -环糊精S03Na、甘露糖醇S03Na、木糖醇 SO3Na及赤藓糖醇S03Na。
30. 权利要求29所述的方法，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受的盐是选自下列 的至少一种：硫酸葡聚糖Na、墨角藻聚糖、黄原胶S03Na、果胶S03Na、麦芽七糖S0 3Na、麦芽三 糖S03Na、麦芽糖醇SO3Na及蔗糖8S03K。
31. 权利要求25?30中任一项所述的方法，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受的 盐是平均分子量2, 500?7, 500的硫酸葡聚糖Na。
32. 权利要求25?30中任一项所述的方法，其中所述硫酸化糖类或其药学上可接受的 盐是鹿糖8S03K。
33. 权利要求32所述的方法，其中所述蔗糖8S03K的含量是25pg/ml?10 ii g/ml。
34. 权利要求24所述的方法，其中硫酸化化合物是硫酸化聚合物，但是，硫酸化糖类除 外。
35. 权利要求34所述的方法，其中所述硫酸化聚合物是下述通式（I)所示的、且含1个 或2个以上的磺基的化合物：
【化学式8】 式中， A是聚合物构成单元， n是1?1500的整数， R1是任选具有取代基的官能团。
36. 权利要求34或35所述的方法，其中在硫酸化聚合物中的硫的含量是5重量％以 上。
37. 权利要求34?36中任一项所述的方法，其中硫酸化聚合物是选自下列的至少一 种：含有磺基的聚乙烯基醇、含有磺基的聚乙烯基胺、含有磺基的聚烯丙基胺、含有磺基的 聚乙烯亚胺、含有磺基的a-聚赖氨酸、含有磺基的a-聚谷氨酸甲酯/ a-5-羟基正缬氨 酸（2/8)共聚物、a-聚谷氨酸-Y-牛磺酸、含有磺基的三丝氨酸、含有磺基的丝氨酸、含 有磺基的分支型聚甘油及其衍生物、以及聚乙烯磺酸。
38. 权利要求37所述的方法，其中含有磺基的分支型聚甘油的衍生物或其药学上可接 受的盐是分支型聚甘油-单甲基四乙二醇_S03Na、分支型聚甘油-2-糠基-SO3Na或分支型 聚甘油-异丙基氧基_S03Na。
39. 权利要求24所述的方法，其中硫酸化化合物是利用二异氰酸酯化合物形成的糖类 的交联聚合物的硫酸化物。
40. 权利要求39所述的方法，其中利用二异氰酸酯化合物形成的糖类的交联聚合物的 硫酸化物或其药学上可接受的盐是麦芽三糖-六亚甲基二异氰酸酯SO3Na或葡聚糖-六亚 甲基二异氰酸酯S03Na。
41. 权利要求24所述的方法，其中硫酸化化合物是糖内酯的硫酸化物。
42. 权利要求41所述的方法，其中糖内酯的硫酸化物或其药学上可接受的盐是葡萄糖 酸内酯-SO3Na。
43. 权利要求24所述的方法，其中硫酸化化合物是有机酸的硫酸化物。
44. 权利要求43所述的方法，其中有机酸的硫酸化物或其药学上可接受的盐是酒石 酸-SO3Na。
45. 权利要求24?44中任一项所述的方法，其中成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细 胞生长因子。
46. 权利要求24?45中任一项所述的方法，其中所述干细胞是间质干细胞、胚胎干细 胞或人工多能性干细胞。
47. 硫酸化化合物或其药学上可接受的盐，其选自：木糖醇S03Na、麦芽三糖-六亚甲基 二异氰酸酯SO3Na及葡萄糖酸内酯-S03Na。
48. 硫酸化化合物或其药学上可接受的盐，其选自：a-聚谷氨酸甲酯/a-5-羟基正缬 氨酸（5-S03Na) (2/8)共聚物、三丝氨酸-SO3Na及分支型聚甘油-异丙基氧基-S03Na。
【文档编号】C12N5/10GK104334714SQ201380025206
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2012年3月30日
【发明者】栗山阳子, 杉本尚, 北泽学, 冈元训, 千山将, 原田育惠, 大桥贤 申请人:味之素株式会社