建立iPS的方法

建立iPS的方法
【专利摘要】本发明涉及一种建立iPS的方法，该方法包括如下步骤：利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法培养8天，将episomal的三个质粒用lonza的Human?CD34+Cell?Kit电转到单核细胞中，之后用vitrinectin处理的板子上培养，利用E6培养基培养12-15天后会看到克隆，20天左右将单克隆调到用vitrinectin处理的板子上用E8培养基培养，传代到10后鉴定。本发明建立在无插入的episomal技术上，无FBS，无feeder甚至是无动物源的iPS诱导和培养技术。
【专利说明】建立iPS的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种建立iPS细胞的方法，特别涉及一种在无插入的基础上建立了无FBS,无Feeder无动物源的人iPS的方法。
【背景技术】
[0002]2006年，日本科学家Yamanaka的研究组将4种转录因子(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc)导入小鼠皮肤成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导性多能性干细胞”(induced pluripotent stem cells, iPS 细胞)[1]。2007 年,Yamanaka 博士 [2]和美国Thomson博士研究组[3]分别用特定的因子诱导人类成纤维细胞，也使之成为了 iPS细胞。iPS细胞的分离培养成功是干细胞研究乃至生命科学领域的里程碑，它首次证明:可以用已知的几种因子在体外逆转已经分化的细胞，使之成为全新的具有发育全能性的细胞，这项技术避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题。
[0003]尽管近年来iPS技术不断取得发展，各种改良技术时有出现。然而重编程效率低下一直都是科学家们头疼的问题，成为了 iPS临床转化的重要障碍之一。经典的利用病毒为载体将转录因子导入分化细胞的方法，很可能导致外源基因插入细胞的基因组中，引起插入突变，存在很大的弊端，iPS细胞的致瘤性影响其在再生医学和临床细胞治疗中的应用[4]。转录因子c-Myc本身就是一种原癌基因。解析体细胞重编程过程中的分子调控机制，开发出高效安全的iPS技术成为了近年来干细胞领域研究人员的热点。
[0004]供体细胞类型影响iPS细胞的形成效率和安全性。2008年，Yamanaka博士的研究组尝试利用小鼠胃和肝的细胞诱导iPS细胞，发现由胃和肝细胞产生的iPS细胞的成瘤性明显低于皮肤成纤维细胞来源的iPS细胞[5]。采集皮肤细胞重编程为iPS细胞需要六七十天时间，而从血液采集细胞制备iPS细胞只需3周左右，而且人外周血细胞来源丰富，采集方法便利，创伤性小，安全性好。人外周血细胞是当前最理想的供体细胞之一，具有安全、方便、数量多等优势[6]。
[0005]使用病毒载体转染外源基因制备iPS细胞不仅操作过程复杂、对实验室设备和管理要求严格，而且细胞有可能引发肿瘤的形成，这就阻碍了 iPS细胞技术的普及和在临床应用的推广。当前应用基因非整合方法建立iPS细胞主要有以下几个方面I)腺病毒载体，2)质粒或者minicircle DNA，3)蛋白直接导入，但是这三种方法重建效率均非常低，难以满足基础实验需要和临床应用研究。仙台病毒m及改良mRNA方法M建立非整合iPS细胞的效率很高，但是费用相当高，不适用于大规模临床治疗的开展。Episomal Vectors是目前最高效最经济的基因非整合建立iPS细胞的方法[9]。
[0006]2013年5月张孝兵教授[1°]应用改良的表达0ct4/Sox2/Klf4/c_Myc的EV成功地将人外周血单个核细胞重编程为iPS细胞，重编程效率显著高于以往实验报导。
[0007]虽然我们利用印isomal技术可以获得没有外源基因插入的iPS技术。解决了因为外源基因的插入，诱导基因组不稳定和成瘤性的危险，大大促进了 iPS技术临床应用的可能性。但在体外培养细胞Feeder细胞以及处理板子的metrigel都是鼠源的和牛源的FBS，这些可能会造成免疫和异源病毒或蛋白造成的疾病的产生，增加疾病治疗的风险，而且增加了 IPS的使用成本，不适合广泛的、大规模的临床应用，研究在无插入外源基因建立IPS的技术基础上，无添加FBS'Feeder建立IPS的方法，具有重要的临床价值。在发明中，我们在无插入的基础上建立了无FBS，无Feeder无动物源的iPS建立技术。使iPS技术更符合临床应用的需求。
[0008][I] Takahashi K，Yamanaka S.1nduction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006; 126:663—76.[0009][2]Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.1nduction of pluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell.2007;131:861—72.[0010][3] Yu Jj Vodyanik MAj Smuga—Otto K，et al.1nduced pluripotent stem celllines derived from human somatic cells.Science.2007;318:1917—20.[0011][4]Okita Kj Yamakawa T，Matsumura Y，et al.An efficient nonviral method togenerate integration-free human-1nduced pluripotent stem cells from cord bloodand peripheral blood cells.Stem Cells.2013;31:458—66.[0012][5]Aoi T，Yae Kj Nakagawa M，et al.Generation of pluripotent stem cellsfrom adult mouse liver and stomach cells.Science.2008;321:699-702.[0013][6] Loh YHj Agarwal S，Park IHj et al.Generation of induced pluripotentstem cells from human blood.Blood.2009;113:5476—9.[0014][7]Seki T，Yuasa S，Fukuda K.Generation of induced pluripotent stem cellsfrom a small amount of human peripheral blood using a combination of activatedT cells and Sendai virus.Nat Protoc.2012;7:718-28.[0015][8] Lin T，Ambasudhan R，Yuan X，et al.A chemical platform for improvedinduction of human iPSCs.Nat Methods.2009;6:805-8.[0016][9] Yu J，Hu K，Smuga—Otto K，et al.Human induced pluripotent stem cellsfree of vector and transgene sequences.Science.2009;324:797-801.[0017][10] Su RJj Bay I ink DJ，Neises A，et al.Efficient Generation ofIntegration-Free iPS Cells from Human Adult Peripheral Blood Using BCL—XLTogether with Yamanaka Factors.PLoS One.2013;8:e64496.
【发明内容】

[0018]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种没有基因插入，没有FBS，没有Feeder的利用外周血细胞建立人iPS的方法。
[0019]本发明采用的技术方案为:
[0020]一种建立iPS的方法(没有基因插入，没有FBS，没有Feeder的利用外周血细胞建立iPS的方法)，包括如下步骤:
[0021]利用ficoll分离外周血单核细胞,红系培养方法(无血清)培养8天,将episomal的三个质粒:pEV SFFV-OS (OS), pEV SFFV-MK (MK), pEV SFFV-B (B)用 1nza 的Amaxa? HumanCD34+Cell Nucleofector? Kit电转到单核细胞中，之后用vitrinectin (人源蛋白)处理的板子上培养，利用E6培养基(invitrogen)培养12-15天后会看到克隆，20天左右将单克隆调到用vitrinectin处理的板子上用E8培养基(invitrogen)培养,传代到10后鉴定。
[0022]优选的，所述的红系培养方法所使用的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分=SCF终浓度100ng/ml，IL-3终浓度10ng/ml，EPO终浓度2U/ml，IGF-1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度I μ Μ，转铁蛋白终浓度100 μ g/ml。
[0023]其中Serum free medium (SFM)组成为:
[0024]
【权利要求】
1.一种建立iPS的方法，其特征在于:包括如下步骤:利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法(无血清)培养8天，将印isomal的三个质粒:pEV SFFV-OS (OS)，pEVSFFV-MK(MK), pEV SFFV-B(B)电转到单核细胞中，之后用vitrinectin (人源蛋白)处理的板子上培养，利用E6培养基培养12-15天后会看到克隆，20天左右将单克隆调到用vitrinectin处理的板子上用E8培养基培养，传代到10后鉴定。
2.根据权利要求1所述建立iPS的方法，其特征在于:所述的红系培养方法所使用的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分:SCF终浓度100ng/ml，IL-3终浓度10ng/ml，EPO终浓度2U/ml，IGF-1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度I μ Μ，转铁蛋白终浓度 100 μ g/mlo 其中 Serum free medium (SFM)组成为:
IMDM (Invitrogen, cat.n0.21056023)50%
Ham’ s F-12 (Mediatech, cat.n0.10-080-CV)50%Bovine serum albumin (BSA) (Sigma, A9418)5 mg/mlAscorbic acid (Sigma, cat, n0.A8960)50 ug/ml1-Thioglycerol， 98% (Sigma, cat.n0.M6145)200 U M
L-Glutamine (Invitrogen, cat.n0.21051024)100XITS-X (Invitrogen, cat.n0.51500-056)100X
synthetic lipids (Inv`itrogen, cat.n0.11905031) 100Xo
3.根据权利要求1或2所述建立iPS的方法，其特征在于:包括如下步骤: 利用ficoll分离外周血单核细胞,红系培养方法(无血清)培养8天,利用Amaxa细胞核转染仪(Amaxa Nucleofector?)进行细胞核转染，单个核细胞培养8天后，计数，IxlO6细胞加入100 μ I配置好的电转缓冲液(包含不同组合质粒如5ug pEV SFFV-OS (OS)+2.5ugpEV SFFV-MK (MK) +2.5ug pEV SFFV-B (B))，混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U-008转染程序进行电转。将电转后细胞种到预先人源蛋白处理的6孔板的一个孔中，应用红系诱导培养基培养I天，加等量的hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养I天后半数换液，只加hESC培养基E6+bFGF100ng/ml，之后隔一天完全换成hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养液，并隔天换液；在调单克隆之前在低氧培养条件下培养，所述的低氧培养条件为5%02，5%C02，90%N2 ； 并在培养基中加入0.25mM NaB提高重编程效率，第10天停止，第12-15天开始可见克隆开始形成，第20天左右克隆逐渐成熟，通过机械传代方法，在显微镜下分离克隆，切成3,4块后吸出，转入hESC培养基E8培养系统,一周后可用化学方法消化再传代，一直传10代，形成稳定的iPS细胞系。
【文档编号】C12N5/10GK103756969SQ201410008450
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】程涛, 李彦欣, 刘淑萍, 许静, 顾海慧, 袁卫平, 张孝兵 申请人:中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）