一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测土壤中重金属潜在遗传毒性的方法，它是经过1.土壤的消解；2.微藻细胞的制备；3.铺胶；4.裂解；5.电泳；6.中和；7.染色；8.DNA损伤程度分析和统计用Origin7.5软件进行ANOVA分析等步骤。彗星图像分析采用CASP软件，在评价参数中，尾动量（olive?tail?moment，OTM）同时反映了彗星中DNA含量和彗尾形状特征，是定量化DNA损伤程度的常用指标。本发明方法是一种有效的测试方法，可以评级土壤中重金属的遗传毒性。
【专利说明】一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境健康遗传毒理学领域，具体涉及一种检测土壤中重金属潜在遗传毒性的方法。
【背景技术】
[0002]土壤是人类生存与发展的重要自然资源和整个陆地生态系统赖以存在的基础，又是重要的环境要素之一。“健康”的土壤对于农业可持续发展和人类的生存非常重要。但是，随着我国经济的高速发展，土壤污染的问题日益严重，严重的土壤污染特别是重金属污染已经成为目前包含城市土壤在内的许多土壤的一个共同特性，据估计我国已经有10万km2 土壤被污染，而且我国土壤污染重金属中As、Cd、Cr、Hg和Pb等高毒性重金属污染严重。有研究表明重金属对生物具有较强诱变性。因此，对土壤中有害重金属污染物进行调查并对其遗传毒性的研究已迫在眉睫，甚至有人提出土壤中是否含有遗传毒性物质，应是评价土壤的主要指标。所以建立一种有效的测试方法评价土壤中重金属的遗传毒性是环境监测的一项重要工作。
[0003]对各种环境因子遗传毒性效应的生物检测在毒理学研究中已占有十分重要的地位，它们在环境污染监测及环境保护中发挥了积极的作用。大量的遗传学分析方法被用于识别生殖细胞诱变剂、体细胞诱变剂、潜在的致癌剂，以及与人类健康相关的各种各样的遗传改变，所涉及的方法已经超过200种。根据遗传毒性效应检测方法所涉及的终端指标范围，可以把它们划分为三大类。第一类检测基因突 变；第二类检测染色体畸变，包括染色体结构和/或数目的异常改变；第三类测定DNA损伤的标志如DNA损伤修复的激发、DNA加合物的形成、姐妹染色单体交换、体细胞重组及DNA键断裂等。基因突变的检测主要有正向和反向两类。正向突变改变野生型基因，使得有关基因失活而表现出可检测的表型变异。相反，回复突变是通过突变使原突变子中失活的基因功能恢复，从而表现野生型表型。染色体畸变一般包括染色体结构和数目的改变，染色体结构改变包括染色体断裂、倒位、异位和重复等。检测染色体畸变通常采用细胞遗传学技术。用于检测染色体结构异常的体系一般是高等生物，尤其是哺乳动物体内及体外系统。近年来，由于分子生物学的发展和技术的进步，使遗传毒理学领域里产生了许多新的基因毒性测试方法。尽管基因突变检测额度“金标准”是直接DNA测序，而且自动DNA测序能力也有长足的进展，但测序仍然是一个比较繁琐、费用高、需要昂贵设备的工作，不适合大范围筛查基因组中DNA突变。
[0004]DNA是生物体内的遗传物质，它的稳定对于生物体的正常繁殖和生长是至关重要的。然而环境中各种理化及生物因子一如电离辐射、各种氧化剂、细菌等都可能引起DNA损伤。单细胞凝胶电泳(singe cell gel electrophoresis assay,简称SCGE,又名彗星试验,comet assay)是一个广泛用于真核生物单细胞DNA单链、双链、碱基不稳定点和修复延迟位点的量化检测手段，该方法简便、快捷、灵敏，每109Da可检出0.1个断裂等特点而得到了广泛应用。与经典的染色体畸变、微核、SCE相比，SCGE可以用于活细胞DNA检测，也能用于死亡细胞的DNA分析，使SCGE不仅可以研究低剂量下的生物效应，也可以用于研究高剂量下的生物效应；同时SCGE又可提供DNA修复能力的信息，这使得SCGE非常适合用于评价受试物的遗传效应。
[0005]单细胞凝胶电泳技术是由Ostling于1984年首创,其后又由Singh和Olive分别加以改进，形成目前的碱性和中性裂解两类方法。该技术尽管原理、方法简单，其操作过程却十分困难。在制作胶的过程中，一般要在磨毛载玻片上滴加凝胶2— 3层，每次用盖玻片盖压，在揭取盖玻片时，极易损坏胶板。在其后的裂解、电泳、洗涤过程中，凝胶长时间浸泡、冲洗，即使极轻的振荡，也可能将胶板冲动漂起，胶板的损伤常至实验失败。
[0006]从理论上讲SCGE技术适合于一切真核细胞,样品细胞需要量小，细胞可以是培养的细胞系或细胞组织分离的细胞，目前已经用过的细胞有人体淋巴细胞、表皮细胞、血细胞、成纤维细胞、睾丸细胞、肿瘤细胞、动物肝脏细胞、植物的根细胞和叶片细胞及酵母细胞等。但是有关藻类的彗星实验国内外都鲜有报道。藻类是生态环境的重要组成部分，将藻类用于SCGE，拓展SCGE的研究对象。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测土壤中重金属潜在遗传毒性的方法，具体的说就是提供一种利用微藻DNA损伤检测土壤中重金属污染物的潜在遗传毒性的方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0009]一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法，包括如下步骤:
[0010]步骤1.土样的前处理:采集土壤样品，风干后，过直径为2mm的土筛，去除植物残体、石块等后，用玛瑙研钵研磨，全部通过80目筛。土壤经消解后，用Iml硝酸温热溶解残渣，然后将溶液转移至50ml容量瓶中，定容，摇匀，保存备用；
[0011]步骤2.细胞制备:将微藻细胞接种到步骤(1)得到的土壤金属提取液中进行染毒，将去离子水染毒的微藻细胞作为对照；将上述染过毒的微藻细胞分别经离心去除液体部分，用PBS重新悬浮细胞，得到细胞悬液，离心纯化备用；
[0012]步骤3.铺胶:
[0013]步骤3a.以l%g/mL的正常熔点琼脂糖(NMA) PBS溶液(l%g/mL即IOOmLPBS中加Alg NMA，以下定义相同)300--500 μ L在磨砂载玻片上打底，再刮去，这样可以使第一层胶更容易固定住载玻片上；
[0014]步骤3b.制备第一层胶:将60—120 μ L0.7%g/mL的正常熔点琼脂糖(NMA) PBS溶液滴在步骤3a得到的磨砂载玻片上，迅速盖上盖玻片，4°C固化5-10min ；
[0015]步骤3c.制备第二层胶:向步骤2处理得到的细胞中加入0.7%g/mL的低熔点琼脂糖(LMA)PBS溶液，重悬藻泥，吹打均匀成细胞悬液，调整细胞浓度I X IO5--1 X IO6个细胞/mL。然后取出第一层胶已凝的玻片，轻拔移除盖，取50-120 μ L加到第一层胶上，盖上盖玻片，4°C 固化 30-40min ；
[0016]步骤3d.制备第三层胶:第二层凝固后，取50—120 μ Ll%g/mL的正常熔点琼脂糖(NMA)的PBS溶液铺第三层胶，盖上盖玻片后，放入冰箱使其凝固；
[0017]步骤4.裂解:将步骤3d制备好的载玻片去掉盖玻片，浸入4°C碱性裂解液(2.5mol/LNa0H, 1.0mmol/L Na2-EDTA,0.01%SDS (w/v)，pH=10，用前加入 l%TritonX_100 和10%DMS0)，裂解 10min-2h ；[0018]步骤5.电泳:取出裂解后的载玻片，放入电泳槽，向槽中缓慢注入碱性电泳液(pH=13.0),静置20min后开始电泳，电流200—300mA,电压18—25V，电泳时间20min ；
[0019]步骤6.中和:用pH7.5,0.4mmol/L Tris-HCl缓冲液浸没载玻片，漂洗每次5min，中和3次；
[0020]步骤7.染色:胶上滴加50μ g/mL的溴化乙锭(EB) 30 μ L，加盖盖玻片，24h内镜检；
[0021]步骤8.DNA损伤程度分析:用荧光显微镜在绿光激发下观察，拍照，获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的参数:尾矩(TM)和尾动量(0ΤΜ)，用其评价土壤中重金属潜在的遗传毒性。
[0022]步骤9.实验至少设3个平行，取其平均值；统计用0rigin7.5软件进行ANOVA分析，将实验组和对照组进行显著性t检验，以p〈0.05作为显著性依据。
[0023]彗星图像分析采用CASP软件,在评价参数中，尾动量(olive tail moment, OTM)同时反映了彗星中DNA含量和彗尾形状特征，是定量化DNA损伤程度的常用指标。另外，提供尾矩(TM)参数作为参考指标，以便较全面反映DNA损伤情况。每张载玻片至少分析50个细胞。
[0024]上述的方法，步骤I中，所述的消解操作过程如下:
[0025]称取0.2000g过80目的风干土样于30ml聚四氟乙烯坩埚中，加5ml HCl低温加热，使样品初步分解，待蒸发至2-3ml时，取下稍冷，然后加入5ml硝酸(工艺超纯)，3ml氢氟酸、3ml高氯酸，加盖后于电热板上中温加热I小时左右(注意温度不要太高，以免溶液冒出)，然后开盖，继续加热除硅，并经常摇动坩埚以达到良好的飞硅效果，当加热至冒浓厚高氯酸白烟时，加盖，使黑色有机碳化物充分分解，待坩埚上的黑色有机物消失后，开盖驱赶白烟并蒸至内容物呈粘稠状，视消解情况可再加入2ml硝酸、2ml氢氟酸、2ml高氯酸重复上述过程，当白烟再次基本冒尽且内容物呈粘稠状时，取下稍冷，用水冲洗坩埚盖和内壁。
[0026]上述的方法，步骤2和步骤3中，所述的微藻细胞为纤细裸藻细胞。
[0027]上述的方法，步骤3a优选的是以l%g/mL的正常熔点琼脂糖350 μ L在磨砂载玻片上打底。
[0028]上述的方法，步骤3b优选的是将100 μ L0.7%g/mL的正常熔点琼脂糖滴在步骤3a预制得到的载玻片上。
[0029]上述的方法，步骤3c中，优选的是取75 μ L细胞悬液滴加到第一层胶上。
[0030]上述的方法，步骤3d中，优选的是在第二层胶上滴加100 μ Ll%g/mL的正常熔点琼脂糖。
[0031]上述的方法，步骤4中，优选的是裂解时间为20min。
[0032]上述的方法，步骤5中，优选的是电泳电流为200mA，电压为20V，电泳时间为20mino
[0033]有益效果:本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0034](I) 土壤及水系中沉积物重金属污染，会影响与之相关的生态系统，伴随着吸收、吸附、浸出等物理化学生物过程，重金属会迁移至植被和水体环境中，从而进入食物链，造成人类和动物受到危害，严重的甚至会影响周边的生态和环境经济发展。快速、准确的测定复杂环境介质(土壤和沉积物)需要涉及到样品前处理和仪器分析方法。样品前处理是将土壤进行消解，使金属溶解在水中，仪器分析现在常用的手段是电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)。然而仪器分析费用昂贵且只能确定土壤样品中重金属的含量。本发明将土壤消解的溶液用于对藻的遗传毒性试验，可以快速的判断土壤中是否存在遗传毒性物质。
[0035](2)先消解土样，得到的溶液用于给纤细裸藻染毒，应用纤细裸藻的彗星实验，对土壤中重金属的遗传毒性进行研究，建立一种有效的测试方法，评级土壤中重金属的遗传毒性。土壤是人类生存与发展的重要自然资源和整个陆地生态系统赖以存在的基础，又是重要的环境要素之一。“健康”的土壤对于农业可持续发展和人类的生存非常重要。但是，随着我国经济的高速发展，土壤污染的问题日益严重，严重的土壤污染特别是重金属污染已经成为目前包含城市土壤在内的许多土壤的一个共同特性，据估计我国已经有10万km2土壤被污染，而且我国土壤污染重金属中As、Cd、Cr、Hg和Pb等高毒性重金属污染严重。因此，开展土壤中重金属对遗传毒性评价，这是对土壤管理、保障人民健康、保护人口资源以及社会经济与环境的协调发展都具有重大意义的。
[0036](3)采用了特殊的制胶方法，即第一层刮胶，然后采用传统的“三明治”制胶的方法，在第三层改用熔点较高的正常熔点较NMA制胶，NMA的熔点高不容易脱胶，能够很好保护好胶体，因此基本解决了传统方法胶板易受损的缺点。
[0037](4)藻类是生态环境的重要组成部分，将藻类用于SCGE，拓展SCGE的研究对象。从理论上讲SCGE技术适合于一切真核细胞,样品细胞需要量小,细胞可以是培养的细胞系或体细胞组织分离的细胞，目前已经用过的细胞有人体淋巴细胞、表皮细胞、血细胞、成纤维细胞、睾丸细胞、肿瘤细胞、动物肝脏细胞植物的跟细胞和叶片及酵母细胞等。但是有关藻类的彗星实验国内\外都鲜有报道。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为本发明步骤3舖胶制片的示意图。其中，I为1%NMA，2为0.7%LMA&藻，3为1%的NMA，4为磨砂载玻片。
[0039]图2为去离子水对纤细裸藻DNA无损伤的彗星图像(未受损伤的细胞核一没有彗尾)。
[0040]图3为土壤金属提取液对纤细裸藻DNA损伤的彗星图像(受损伤的细胞核一有很长的彗尾)。
[0041]图4a和图4b为不同土壤提取液对纤细裸藻DNA损伤的影响，其中a为不同土壤提取液对纤细裸藻DNA损伤的尾动量影响，b为不同土壤提取液对纤细裸藻DNA损伤的尾矩影响，*与空白对照相比P〈0.05。
【具体实施方式】:
[0042]根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0043]实施例1:
[0044]I 土样的前处理:[0045]在紫金山采集土样作为清洁土壤对照，在某钢铁厂的两个地方采样编号为某钢I号和某钢2号。采样按国家环境保护局规范方法采集土样，土样的基本理化性质与重金属含量见表1。
[0046]表1 土壤样品基本理化性质与重金属含量
[0047]
【权利要求】
1.一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法，其特征是:它包括如下步骤: 步骤1.土样的前处理:采集土壤样品，风干后，过直径为2_的土筛，去除植物残体、石块等后，用玛瑙研钵研磨，全部通过80目筛。土壤经消解后，用Iml硝酸温热溶解残渣，然后将溶液转移至50ml容量瓶中，定容，摇匀，保存备用； 步骤2.细胞制备:将微藻细胞接种到步骤(1)得到的土壤金属提取液中进行染毒，将去离子水染毒的微藻细胞作为对照；将上述染过毒的微藻细胞分别经离心去除液体部分，用PBS重新悬浮细胞，得到细胞悬液，离心纯化备用； 步骤3.铺胶: 步骤3a.以l%g/mL的正常熔点琼脂糖(NMA) PBS溶液(l%g/mL即IOOmLPBS中加入IgNMA，以下定义相同)300-500 μ L在磨砂载玻片上打底，再刮去，这样可以使第一层胶更容易固定住载玻片上； 步骤3b.制备第一层胶:将60—120 μ L0.7%g/mL的正常熔点琼脂糖(NMA) PBS溶液滴在步骤3a得到的磨砂载玻片上，迅速盖上盖玻片，4°C固化5-10min ； 步骤3c.制备第二层胶:向步骤2处理得到的细胞中加入0.7%g/mL的低熔点琼脂糖(LMA)PBS溶液，重悬藻泥，吹打均匀成细胞悬液，调整细胞浓度I X IO5--1 X IO6个细胞/mL。然后取出第一层胶已凝的玻片，轻拔移除盖，取50-120 μ L加到第一层胶上，盖上盖玻片，4°C 固化 30-40min ； 步骤3d.制备第三层胶:第二层凝固后，取50—120 μ Ll%g/mL的正常熔点琼脂糖(NMA)的PBS溶液铺第三层胶，盖上盖玻片后，放入冰箱使其凝固； 步骤4.裂解:将步骤3d制备好的载玻片去掉盖玻片，浸入4°C碱性裂解液(2.5mol/LNaOH, 1.0mmoI/L Na2-EDTA, 0.01%SDS(w/v)，pH=10，用前加入 l%TritonX_100 和 10%DMS0)，裂解 10min-2h ； 步骤5.电泳:取出裂解后的载玻片，放入电泳槽，向槽中缓慢注入碱性电泳液(pH=13.0),静置20min后开始电泳，电流200—300mA,电压18—25V，电泳时间20min ；步骤6.中和:用pH7.5,0.4mmol/L Tris-HCl缓冲液浸没载玻片，漂洗每次5min，中和3次； 步骤7.染色:胶上滴加50μ g/mL的溴化乙锭(EB) 30 μ L，加盖盖玻片，24h内镜检；步骤8.DNA损伤程度分析:用荧光显微镜在绿光激发下观察，拍照，获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的参数:尾矩(TM)和尾动量(0ΤΜ)，用其评价土壤中重金属潜在的遗传毒性。 步骤9.实验至少设3个平行，取其平均值；统计用0rigin7.5软件进行ANOVA分析，将实验组和对照组进行显著性t检验，以p〈0.05作为显著性依据。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤I中，所述的消解操作过程如下: 称取0.2000g过80目的风干土样于30ml聚四氟乙烯坩埚中，加5ml HCl低温加热，使样品初步分解，待蒸发至2-3ml时，取下稍冷，然后加入5ml硝酸(工艺超纯)，3ml氢氟酸、3ml高氯酸，加盖后于电热板上中温加热I小时左右(注意温度不要太高，以免溶液冒出)，然后开盖，继续加热除硅，并经常摇动坩埚以达到良好的飞硅效果， 当加热至冒浓厚高氯酸白烟时，加盖，使黑色有机碳化物充分分解，待坩埚上的黑色有机物消失后，开盖驱赶白烟并蒸至内容物呈粘稠状，视消解情况可再加入2ml硝酸、2ml氢氟酸、2ml高氯酸重复上述过程，当白烟再次基本冒尽且内容物呈粘稠状时，取下稍冷，用水冲洗坩埚盖和内壁。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤2和步骤3中，所述的微藻细胞为纤细裸藻细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤3&以1°/呢/!^的正常熔点琼脂糖35(^1^在磨砂载玻片上打底。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤3b是将100μ L0.7%g/mL的正常熔点琼脂糖滴在步骤3a预制得到的载玻片上。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤3c中是取75μ L细胞悬液滴加到第一层月父上。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤3d中是在第二层胶上滴加100μ Ll%g/mL的正常熔点琼脂糖。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤4中，裂解时间为20min。
9.根据权利要求1所述的方法， 其特征是:步骤5中，电泳电流为200mA，电压为20V，电泳时间为20min。
【文档编号】C12Q1/68GK103740826SQ201410010581
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】李梅, 崔益斌, 张刘俊, 嵇伏年, 李雅洁 申请人:南京大学