一种染色体整合的人疱疹病毒6型的pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒，包括DNA提取剂、PCR试剂管成分、阴性对照和阳性对照；本发明弥补了国内CI-HHV-6检测的空白，通过本试剂盒检测样品DNA于178bp处有无特异性扩增条带，便可判断样品细胞内是否感染染色体整合人疱疹病毒6型，操作简单，灵敏度高，特异性强。
【专利说明】—种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因检测技术，特别是一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]人抱疫病毒6型(Human Herpesvirus 6,以下简称HHV-6),是一类嗜人淋巴细胞的双链DNA病毒，于1986年由美国癌症中心的Salahuddin等首先从淋巴增生及AIDS病人的外周血单个核细胞中分离得到，属于β疱疹病毒亚科。HHV-6在体内可感染多种细胞，但最敏感的是外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的 CD4+T细胞。HHV-6在人群中普遍感染，血清HHV-6 IgG抗体阳性检出率很高。原发感染大都在婴儿期，是引起婴幼儿急疫(exanthem subitum, ES)的病原，随后潜伏并持续存在于宿主体内，不引起临床症状。当人体受到各种非特异性刺激、机体抵抗力减弱、免疫功能低下时，容易发生HHV-6的再激活或外源性再感染。临床研究表明HHV-6与多发性硬化症(MS)等中枢神经系统疾病相关；它是骨髓移植、器官移植等免疫抑制患者中的主要致病性病原，也是引起严重移植物被排斥的重要病因；HHV-6在HIV感染后发展成AIDS过程中起促进作用；此外，HHV-6也是一肿瘤相关病毒，其DR7基因具有转化能力，发现其与人类多种肿瘤如淋巴瘤、白血病、口腔癌等有关。
[0003]HHV-6与其他疱疹病毒一样，病毒颗粒呈球形，有包膜，平均直径约为150纳米 (nm)。基因组为线状双链DNA。其核衣壳与包膜之间为基质蛋白组成的皮层(Tegument)，它是人类疱疹病毒家族中唯一可以整合到人类染色体末端的病毒，在此情况下HHV-6的完整基因组可以整合到人类染色体的端粒末端，称为染色体整合的人疱疹病毒6型(Chromosomally integrated HHV-6,以下简称C1-HHV-6)。国外研究表明，健康人群中HHV-6的整合率为1%左右，在脑炎患者中整合率为3%，并且整合的HHV-6可以游离下来，引起HHV-6的再激活。因此检测人群中C1-HHV-6的发生率，以及C1-HHV-6与HHV-6相关疾病的发生是否有相关性显得尤为重要。
[0004]在感染C1-HHV-6个体中，每个有核细胞都稳定整合一份HHV-6完整基因组，并以50%的概率稳定传给后代。在人群中，潜伏感染的非染色体整合形式的HHV-6病毒在全血中含量很低，通常利用巣式PCR在人外周血中检测HHV-6 DNA，但巣式PCR检测灵敏度极高，极易受空气中微量的气溶胶的污染，导致检测结果假阳性；C1-HHV-6可通过染色体荧光原位杂交(fluorescence in I situ hybridization，FISH)检测,但FISH技术首先需要培养人外周血细胞，制备人类中期染色体，合成HHV-6特异性荧光探针，并进行杂交后洗脱，检测周期长，假阳性高；另外C1-HHV-6也可通过荧光定量PCR (以下简称Q-PCR)检测，但Q-PCR检测需要特异的引物、探针和Q-PCR酶，并且需要专门的荧光定量PCR仪，检测成本比较高，不利于大规模人群普查重复使用。
[0005]
【发明内容】
[0006]针对目前Cl-HHV-6检测存在的不足，提供一种操作简单，灵敏度高，可用于C1-HHV-6快速诊断与流行病学调查的试剂盒，本发明是这样实现的:
一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括:
A)DNA提取剂:红细胞裂解液、Proteinase K溶液、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、体积比为75%乙醇、TE缓冲液；其中，所述红细胞裂解液配方为139.6 mmol/L NH4C1溶液中加入16.96 mmol/L Tris-HCl ;DNA抽提液为体积比为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇；TE缓冲液配方为10mmol/L Tris-HCl溶液中加入lmmol/L EDTA ；
B)PCR 试剂管成分:2XTaq Master Mix 15 μ UddH2O 11 μ 1、1.0 μ I 浓度为 10 μ M 的引物SEQ ID N0.1以及L 0μ I浓度为10 μ M的引物SEQ ID N0.2 ；
其中 SEQ ID N0.1:5’ -GTTGACGGTGGAAGCCTTTTTA -3’ ；
SEQ ID N0.2:5’- TTTAGCGGGGACCATGTAGTTG -3’ ；
C)阴性对照:已灭菌的双蒸水；
D)阳性对照:人疱疹病毒6型标准株GSDNA。
[0007]本发明弥补了国内C1-HHV-6检测的空白，在涉及C1-HHV-6特异性引物的基础上研制成的简单、快速检测C1-HHV-6的试剂盒，通过本试剂盒检测样品DNA于178bp处有无特异性扩增条带，便可判断样品细胞内是否存在染色体整合人疱疹病毒6型，2小时即可出结果，操作简单，灵敏度高，特异性强。`【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为25-36号样品PCR检测电泳图。
[0009]图2为380-392号样品PCR检测电泳图。
[0010]图3为467-480号样品PCR检测电泳图。
[0011]图4为HHV-6 U22标准品的PCR电泳图。
[0012]图5为PMD19T-U22重组质粒的双酶切鉴定电泳图。
[0013]图6为Q-PCR标准曲线。
[0014]图7为467-480号样品Q-PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0015]实施例1人外周血C1-HHV-6检测
(1)样品DNA提取:红细胞裂解液、ProteinaseK溶液(南京凯基生物科技发展有限公司)、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、体积比为75%乙醇、TE缓冲液；其中，所述红细胞裂解液配方为139.6 mmol/L NH4C1溶液中加入16.96 mmol/L Tris-HCl ;DNA抽提液为体积比为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液；TE缓冲液配方为lOmmol/L Tris-HCl溶液中加入lmmol/L EDTA0 ;
(2)PCR试剂管成分:2XTaqMaster Mix 15 μ l,ddH20 11 μ 1，1.0 μ I 浓度为 10 μ M 的引物 SEQ ID N0.1，1.0μ I 浓度为 10 μ M 的引物 SEQ ID N0.2 ；
SEQ ID N0.1:5’ -GTTGACGGTGGAAGCCTTTTTA -3’ ；
SEQ ID N0.2:5’ -TTTAGCGGGGACCATGTAGTTG -3’。[0016](3)阴性对照:已灭菌的双蒸水；
(4)阳性对照:HHV-6标准株GS DNA ；
按照以下的程序进行检测:
(1)样品DNA提取:收集500份人外周血，各取Iml血液样品加入2ml的红细胞裂解液，颠倒混匀，10，000 rpm离心I min,吸去上清,在沉淀中加入20 μ I Proteinase K溶液，55°C水浴Ih ;加等体积的DNA抽提液，颠倒混匀后12000rpm离心lOmin，再加入等体积DNA抽提液，12000rpm离心IOmin后再加入1/10体积2.5 mM NaAc和2倍体积无水乙醇,颠倒混匀，一20°C沉淀过夜。4°C，12000rpm离心lOmin，弃上清，加体积比为75%乙醇Iml/管，4°C，12000rpm离心lOmin，弃上清，室温晾干，沉淀即为DNA，加100 μ I TE溶解，获得与500份人外周血对应的DNA提取液，它们的编号分别为1-500 ；
(2)PCR扩增，在PCR试剂管内加入DNA提取液2.0 μ 1，置于PCR仪中(美国PE公司MJ-PTC-100)进行扩增:94°C预变性 5 min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 45s,循环 30 次，72°C延伸8 min ;同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照中在PCR试剂管内加入HHV-6标准株GS DNA (香港大学吴文翰教授赠予)，阴性对照中在PCR试剂管内加入灭菌的ddH202 μ I ；
(3)PCR扩增产物分析，取8μ I的扩增产物，置于浓度为1%的琼脂糖凝胶溶液中，100V下电泳20min后在体积比为5%的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观测结果。
[0017]图1、图2、图3分别对应500份样品中出现特异性条带样品的检测电泳图，其中M泳道为DNA标准值，P泳道为阳性对照，N泳道为阴性对照，其中，28、36、392、479号泳道在178bp处有特异性扩增条带，则认为该四个泳道对应的样品细胞内存在染色体整合人疱疹病毒6型。
[0018]实施例2 Q-PCR法对467-480号样品进行染色体整合人疱疹病毒6型检测对照 实施例涉及的引物序列:
SEQ ID N0.3:5’- CGCTCGGAAAGGAAACATTA - 3’
SEQ ID N0.4 -.5' ~ AAGTGGAACTGCTTGGTGGC - 3’
引物序列构建参考“人类疱疹病毒6A对神经细胞的嗜性及细胞周期的影响”郭丹丹等，南京医科大学学报，2011年7月。
[0019](I)重组标准质粒PMD19T-U22的构建
以HHV-6标准株GS DNA为模板(香港大学吴文翰教授赠予)以SEQ ID N0.3和SEQID N0.4为引物，进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物。
[0020]PCR反应体系:2XTaq Master Mix (北京百泰克生物技术有限公司生产)15 μ 1，1.0 μ I 浓度为 10 μ M 的 SEQ ID N0.3，1.0 μ I 浓度为 10 μ M 的 SEQ ID N0.4，样品DNA2.0 μ 1，ddH20 11 μ I。
[0021]PCR 反应条件:94°C预变性 5 min ；94°C 45s，55°C 45s，72°C 45s,循环 30 次，72°C 延伸 8 min。
[0022]对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，称取0.5 g琼脂糖于烧瓶中，加入50 ml TAE,微波炉中加热至完全溶解，冷却至60°C时加入EB 2.5 μ 1，混匀，充槽，室温冷却30min后，加10 μ I PCR产物进行电泳。如图4所示，HHV-6 DNA中U22基因在194bp中存在特异性扩增条带，其中I泳道是HHV-6 U22 PCR片段，M泳道是DNA标准品D2000，参照胶回收试剂盒(Agarose GeL DNA Extraction Kit ver.3, 0, TaKaRa)回收目的片段。
[0023]U22基因片段与克隆载体pMD19_T (购自TaKaRa)连接，连接反应体系:2Xligation buffer 5.0 μ 1，pMD19_T 载体 0.5yl，U22 PCR 产物 2μ1，ddH20 2.5 μ I。16°C连接30min，连接产物转化DH5a感受态细菌(购自TIANGEN公司)。转化的质粒在DH5 a中大量扩增，提取质粒DNA，溶于100 μ ITE中用于后续实验。带有U22基因的克隆载体命名为PMD19T-U22。对连接产物pMD19T_U22进行双酶切鉴定。双酶切鉴定体系:10XK Buffer2.0μ l，pMD19T -U22，5.0μ l，EcoR I 1.0μ I, Hind III 1.0μ I, ddH20 11μ1，37? 酶切2h后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图5所示，其中M泳道是DNA标准品DL5000，I泳道是PMD19T-U22双酶切结果，从电泳结果可见大、小2条带，分别符合酶切后质粒载体PMD19T (2692bp)和目的片断U22的长度(194bp)，说明U22基因片断已连接到pMD19_T载体上，重组标准质粒pMD19T-U22构建成功。
[0024]其中EcoR I 和 Hind III购自 TaKaRa 公司。
[0025](2)建立Q-PCR标准曲线
用分光光度计测定PMD19T-U22重组质粒的浓度，根据质粒的分子量与质粒浓度，计算拷贝数，制得标准品，换算公式:
质粒拷贝浓度(copy/μ I ):C=(质粒浓度X6.02X 1023 )/质粒分子量(MW)。
[0026]将标准品按10倍梯度稀释成KT1 - 10_6，以浓度梯度标准品为模板，以SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.4为引物分别进行Q-PCR扩增，建立反映Ct值与质粒浓度对应关系的定量标准曲线；同时以灭菌水代替DNA模版，进行阴性对照。
[0027]Q-PCR反应体系:
SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μ I ；
0.8 μ I 浓度为 10 μ M 的 SEQ ID N0.3 ；
0.8 μ I 浓度为 10 μ M 的 SEQ ID N0.4 ；
标准品DNA模板2.0 μ I ;
6.4 μ I 的 ddH20 ；
Q-PCR 扩增程序:Stage 1:预变性 95°C 30s ；Stage 2:循环反应:95°C 5s，60°C 34s，40 个循环；Stage 3 溶解曲线 95°C 15s, 60°C 60s, 95°C 15s。
[0028]读取Ct值，进行记录分析，以起始浓度拷贝数的log值为横坐标，以Ct值为纵坐标，y=-3.0783x+50.387，R2=0.9965，绘制标准曲线，如图6所示。
[0029](3)对实施例1中467-480号样品用Q-PCR方法检测，与实施例1进行对照
A)样品DNA提取，取实施例1中467-480号样品的DNA提取液；
B)以SEQID N0.3和SEQ ID N0.4为引物，进行Q-PCR检测:
Q-PCR反应体系:
SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μ I,
0.8 μ I 浓度为 10 μ M 的 SEQ ID N0.3，
0.8 μ I 浓度为 10 μ M 的 SEQ ID N0.4，
样品 DNA2.0μ I,
6.4 μ I 的 ddH20 ；
Q-PCR扩增程序:Stage 1:预变性 95°C 30s ;Stage 2:循环反应:95°C 5s,60°C34s，40 个循环；Stage 3 溶解曲线 95°C 15s, 60°C 60s, 95°C 15s。
[0030] 467-480号样品Q-PCR反应结果如图7所示，测得479号样品HHV-6全血拷贝数为5.3 X 106/ml，鉴于每毫升人全血中总细胞的数目大约在5 X IO6至I X IO7之间，C1-HHV-6的个体每个细胞中都含有一份HHV-6基因组，则其对应的样品细胞内存在染色体整合人疱疹病毒6型，与实施 例1中的检测结果一致。
【权利要求】
1.一种染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括: A)DNA提取剂:红细胞裂解液、ProteinaseK溶液、DNA抽提液、NaAc、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液； B)PCR 试剂管成分:2XTaq Master Mix 15 μ UddH2O 11 μ 1、1.0 μ I 浓度为 10 μ M 的引物SEQ ID N0.1以及L 0μ I浓度为10 μ M的引物SEQ ID N0.2 ； C)阴性对照:已灭菌的双蒸水； D)阳性对照:人疱疹病毒6型标准株GSDNA。
2.根据权利要求1所述的染色体整合的人疱疹病毒6型的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA抽提液为苯酚、氯`仿和异戊醇以体积比25:24:1混合而成。
【文档编号】C12Q1/70GK103757136SQ201410028660
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】周锋, 李凌云, 冯东举, 王芳, 姚堃, 陈云, 刘英霞 申请人:南京医科大学