肝硬化microRNA分子标志物组合及其用途

肝硬化microRNA分子标志物组合及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种肝硬化转归microRNA分子标志物，序列号1-13，及其在制备肝硬化个体化用药诊断试剂中的用途。肝硬化患者microRNA分子标志物在血浆/血清中的含量与健康对照血浆/血清中含量相比，存在显著差异，能够有效区分肝硬化患者和健康对照人群，在肝硬化患者用药过程中，当肝硬化转归microRNA分子标志物调整到正常水平，可辅助指导停止用药。本发明还提供了一种指导肝硬化个体化用药的诊断试剂盒。使用本发明的肝硬化转归microRNA分子标志物，指导肝硬化患者的个体化用药，具有操作简单，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。
【专利说明】肝硬化microRNA分子标志物组合及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及肝硬化个体化用药诊断领域，具体来说涉及一组肝硬化microRNA分 子标志物组合，其对肝硬化患者进行诊断和/或预后评估的用途以及含有其特异引物的试 剂盒。其可应用于对肝硬化患者进行诊断和/或预后评估，指导患者科学用药和停药，既减 少患者用药痛苦，也减少医疗资源的浪费。

【背景技术】
[0002] microRNA(miRNA)是近年来的研究热点，它是一种广泛存在于真核生物中的单链 小分子RNA，不具编码功能，但它能够结合于基因序列的侧翼区域阻遏或抑制靶mRNA的翻 译，具有高度的保守性、时序性和组织特异性，目前在肿瘤、血液病、病毒感染等多种疾病的 临床诊断、治疗及预后评价等领域发挥了重要作用。
[0003] 肝炎后肝硬化可由乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、丙型肝炎病毒所致慢性肝炎演 变而成。其预后与病毒复制状态、肝功能状态和有无严重合并症密切相关。代偿性肝硬化 病人如果年龄小，病毒复制停止或低复制状态，抗HBe阳性，肝功能尚好，白蛋白不低，血胆 红素近正常及门脉高压不高者，病情可能稳定，甚至长期代偿，一生无症状。一旦发生失代 偿症状，5年存活率低于50%。失代偿的肝硬化，若不积极治疗，半年存活率不及半数。主 要死因为慢性肝功能衰竭、合并症及肝癌。
[0004] 影响肝硬化转归的因素很多，包括（1)性别、年龄；（2)肝功能与预后肝脏体积大 比偏小者预后好；（3)合并症，包括门脉高压、腹水、肝性脑病、感染、肝肾综合征等；(4)病 毒感染的状态和炎症活动反应；（5)肝炎病理改变与预后。但目前尚没有指标检测肝硬化 的转归，指导临床用药。
[0005] 近年来的研究表明，乙型肝炎病毒感染、慢性乙型肝炎、肝硬化和miRNA密切相 关，miRNA可以通过作用于病毒本身或作用于免疫系统从而影响治疗过程，因此对肝硬化用 药的诊断也可能有相应的作用。与肝硬化相关的miRNA种类较多且作用不一，已有研究表 明在乙型肝炎病毒感染后，患者体内miRNA表达谱会发生变化，其中一些特异性miRNA已发 表相关专利。虽然已在该领域进行了一些研究，但是肝硬化患者用药后的miRNA表达变化 目前还没有研究，在临床和研究中，需寻找可有效判断肝硬化用药后疗效、指导临床停药的 miRNA标志物。


【发明内容】

[0006] 本发明的一个方面提供了一种肝硬化转归microRNA分子标志物组合，其包括一 种以上选自以下的 microRNA 核酸分子：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10, SEQ ID N0：1USEQ ID N0：12,SEQ ID NO ：13〇
[0007] 优选地，所述的一种以上为2-13种、更优选3-10种、进一步优选3-8种，最优选4 种。
[0008] 优选地，所述的肝硬化转归microRNA分子标志物组合含有SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQIDN0:1(^PSEQIDN0:11。
[0009] 本发明提供了一组新的肝硬化转归相关的miRNA作为肝硬化转归的分子标志物， 由一组miRNA组成，其序列如下所示SEQ ID N0 :1至序列号13中的一种以上。
[0010]

【权利要求】
1. 一种肝硬化转归microRNA分子标志物组合，其包括一种以上选自以下的microRNA 核酸分子：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID DO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13,优选地，所述的一种以上为2-13种、更优选3-10种、进一步优选3-8 种，最优选4种。
2. 根据权利要求1所述的肝硬化转归microRNA分子标志物组合，其含有SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :10 和 SEQ ID NO: 11。
3. 根据权利要求1所述的肝硬化转归microRNA分子标志物组合在制备肝硬化个体化 用药诊断试剂中的用途，所述的肝硬化转归microRNA分子标志物组合优选含有SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :10 和 SEQ ID NO: 11。
4. 根据权利要求3所述用途，其中，所述诊断试剂通过检测被试者血浆/血清中肝硬化 转归microRNA分子标志物组合的含量，并与健康对照人群平均水平相比较来判断是否停 止用药。
5. 根据权利要求3所述用途，其中，使用定量PCR的方法来检测被试者血浆中肝硬化转 归microRNA分子标志物组合的含量。
6. -种指导肝硬化个体化用药的诊断试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述肝硬 化microRNA分子标志物组合的特异性正向引物组合，优选含有SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11的组合的特异性正向引物。
7. 根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于所述的特异性正向引物包括一种以 上选自以下序列的引物组合：SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO ：18, SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：2USEQ ID N0：22,SEQ ID NO： 23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0:26，优选含有SEQIDN0 :16、SEQIDN0:17、 SEQ ID NO :23 和 SEQ ID NO :24。
8. 根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其进一步包括： (1)血浆/血清总RNA提取试剂，⑵RNA加 polyA试剂，(3) RT-PCR 试剂，(4) 定量PCR试剂；其中，定量PCR试剂中包括权利要求1所述肝硬化转归microRNA分子标志物组合的特 异性正向引物其中，所述血浆总RNA提取试剂中包括序列为SEQ ID NO :27的外部控制序 列-1 (External Control-Ι)，其中，所述RNA加 polyA试剂中包括序列为SEQ ID NO :28的 外部控制序列-2 (External Control-2)，其中，所述RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID NO: 29的反转录引物（RT-Primer)。
9. 根据权利要求8所述诊断试剂盒，其中，所述定量PCR试剂中包括序列分别为SEQ ID NO :30和31的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
【文档编号】C12Q1/68GK104232638SQ201410155061
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】李宁, 李启靖, 张永宏, 张卫红, 石佳, 李鹏, 魏颖颖 申请人:首都医科大学附属北京佑安医院, 北京旷博生物技术有限公司