一种大规模深层发酵生产高抗癌成分蛹虫草菌粉的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药材发酵生产【技术领域】。蛹虫草与冬虫夏草在药理、药性和临床效果上没有根本区别，被作为冬虫夏草的代用品用在癌症的辅助化疗。其主要抗癌成分为虫草素和生物活性多糖。本发明以自有保存的蛹虫草菌种为出发菌株，经一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、发酵罐种子培养，最后放大到1.5吨发酵罐进行生产，发酵50-84h后，发酵液中菌丝体以干重计可达1.53％，干菌粉的虫草素含量达到1.28％，多糖含量可达5.28％(用硫酸-蒽酮法测定)，干菌粉中的铅、总砷含量低于国家限定标准。综合各发酵指标，该工艺具有较好的应用前景。
【专利说明】一种大规模深层发酵生产高抗癌成分蛹虫草菌粉的工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于中药发酵生产领域，具体涉及一种能用于深层发酵生产高抗癌成分蛹虫草菌粉的工艺。
技术背景
[0002]蛹虫草Cordyceps militaris L.Fr Link又名北冬虫夏草、北虫草,属于真菌门Eumycota、子囊菌纲 Ascomycotina、肉座目 Clavicipitales、麦角菌科 Clavicipitaceae、虫草属Cordyceps。蛹虫草与冬虫夏草在生物学方面同科同属,是这一属的代表种。在药物学方面，两者功效也相近，故药典中记载为“北冬虫夏草”。冬虫夏草近代市场售价每公斤数十万元,而蛹虫草价格相对低廉。因此,蛹虫草的生产受到广泛关注。
[0003]肿瘤在我国城市居民中已经超过心血管和脑血管疾病成为第一大死亡原因。研究表明蛹虫草含有多种活性成分，如虫草素、腺苷、多糖、虫草酸、SOD等活性成分。相关抗肿瘤活性的研究认为虫草素和虫草多糖是抗肿瘤的主要物质。虫草素对Lewis肺癌细胞、黑色素B16细胞、白血病HL-60细胞等多种肿瘤细胞具有较好抑制作用。Jagger曾推测有3种可能的有关机制:首先，其具有一个游离的羟基，该羟基可以渗入到癌细胞DNA中发生作用；其次，抑制核苷或核苷酸磷酸化生成二磷酸盐和三磷酸盐的衍生物，从而抑制肿瘤细胞核酸的合成；最后，可能阻断次黄嘌呤核苷酸胺化成鸟甘酸。肿瘤生长繁殖过程中需要大量腺苷，而虫草素与腺苷的结构非常相似，与腺苷竞争核苷磷酸酶，阻止mRNA的合成。此外，虫草素还可以增强环磷酰胺的抗癌作用。研究也表明蛹虫草多糖对肿瘤Hela细胞具有较强的抑制作用， 当作用时间为72h时，抑制率可达到74.98%。虫草多糖的抗肿瘤作用并非来自于直接杀伤癌细胞，而是刺激其非特异性防御机能。
[0004]随着蛹虫草的功能被人们广泛的认识和接受，固体栽培蛹虫草已远远不能满足人们的需求，并且其生产周期长、占地多、生产效率低，易受病虫害的威胁。液体发酵技术是在抗生素工业发展起来后才运用到药用真菌发酵中的，其优点不仅在于可以进行工业化连续生产、规模大、产量高、发酵周期短、生产效率高，更突出的在于药用真菌在液体发酵过程中，由于培养基和培养条件的可控制性，能够使真菌基因的表达向特定需要的物质方面积累性表达，往往能较野生和人工栽培的真菌有效活性成分高好几倍且具有食品安全性。因此，液体发酵技术应用于蛹虫草菌粉生产上是一种最为有效的手段。目前蛹虫草液体发酵虽有一些专利，如专利号CN101554121B和专利号CN102630490B，它们仅仅集中在虫草素含量的研究上。然本专利将公开报道一种高抗癌成分蛹虫草菌粉的生产方法，其不仅具有较高的虫草素含量，也具有较高多糖含量。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种用于生产高抗癌成分蛹虫草菌粉的工艺，并要求该工艺所生产的菌粉具有可靠的食用安全和较高的生产得率。
[0006]本发明是通过如下技术方案实现的:[0007]蛹虫草种子培养基配方为:玉米粉10_20g/L，葡萄糖10_20g/L，豆柏粉5_15g/L，酵母膏 5-10g/L，KH2P04l-3g/L，MgSO4.7Η200.5-1.5g/L，豆油 0.5-1.5g/L，泡敌 0.5-lg/L，其余为饮用安全水，pH值为5.0-6.5 (用食品级NaOH调节pH)。
[0008]蛹虫草1.5吨发酵罐的培养基配方为:桑蚕蛹粉末5-10g/L，玉米粉10_20g/L，葡萄糖 20-40g/L，豆柏粉 10-20g/L, KH2P04l_3g/L，MgSO4.7Η200.5-lg/L，豆油 0.5-1.5g/L，泡敌0.5-lg/L,其余为饮用安全水，pH值为5.0-7.0 (用食品级NaOH调节pH)。
[0009]具体发酵生产工艺为:
[0010](I) 一级摇瓶种子的培养:
[0011]将蛹虫草斜面菌种接种于装有一级种子培养基的三角瓶中，放入25~28°C恒温摇床，以转速120~180rpm/min培养56~96h ；
[0012](2) 二级摇瓶种子的培养:
[0013]将一级摇瓶种子接种到装有二级种子培养基的三角瓶中，并置于25~28°C恒温摇床，以转速120~180rpm/min培养56~96h ；
[0014](3)种子罐生产:
[0015]将装有培养基的200L搅拌式发酵罐灭菌冷却后，调节pH值到5.0~6.5，将适量的二级摇瓶种子接入种子发酵罐中，保持培养温度为25~28°C，搅拌速度为50~150rpm/min(2h 转 5-10min)，通气量为 I: 0.8V/V.min ~I: 1.5V/V.π?η，罐压 0.03 ~0.06MPa，经40~50h培养，此时菌体湿重为20-30g/100mL发酵液；
[0016](4) 1.5吨发酵罐生产:
[0017]将800L发酵培养基装入发酵罐，灭菌冷却后，调节pH值到6.0~7.0，将种子罐的种子移入发酵培养罐中，保持培养温度为25~28°C，搅拌速度为50~150rpm/min，通气量为 1: 0.5V/V.min ~1: L 5V/V.min,罐压 0.03 ~0.06MPa,经 60 ~85h 培养结束发酵(要求此时发酵液变得粘稠，培养基PH降到3.8~4.8，发酵液中湿菌丝达到40g/100mL发酵液以上)。
[0018](5)菌粉的加工:
[0019]将发酵液经板框过滤放置12_24h后，在60-85 °C的烘箱条件下，将湿菌体烘
6-12h，将烘干的菌粉用粉碎机进行粉碎，即为蛹虫草菌粉。
[0020]本发明的优点:一是发酵菌粉具有较高的虫草素含量，含量达1.28%;二是发酵菌粉具有高的胞内多糖含量(硫酸-蒽酮法测定)，多糖含量达5.28% ;二是本工艺原料安全，菌粉经铅、总砷含量检测完全符合国家限定标准；三是生产菌粉得率达1.54%，发酵周期较短，发酵培养基成本较低，三因素导致整体成本不高。
具体实施方案
[0021]虫草素含量的测定参考《蛹虫草中虫草素含量的测定高效液相色谱法DB32/T1275-2008))
[0022]菌粉多糖的提取及多糖含量测定参考《中华人民共和国药典2005版》。
[0023]菌粉重金属中的铅、总砷的测定和限定标准参照《食用菌卫生标准GB7096-2003》。 [0024]实例1:
[0025]蛹虫草种子培养基配方为:玉米粉10_20g/L，葡萄糖10_20g/L，豆柏粉5_15g/L，酵母膏 5-10g/L，KH2P04l-3g/L，MgSO4.7Η200.5-1.5g/L，豆油 0.5-1.5g/L，泡敌 0.5-lg/L，其余为饮用安全水，pH值为5.0-6.5 (用食品级NaOH调节pH)。
[0026]优选配方为:玉米粉20g/L，葡萄糖20g/L，豆柏粉5g/L，酵母膏5g/L，KH2P043g/L,MgSO4.7H201.5g/L，豆油lg/L，泡敌0.5g/L，其余为饮用安全水，pH值为5.1 (用食品级NaOH调节pH)。
[0027]蛹虫草1.5吨发酵罐的培养基配方为:桑蚕蛹粉末5-10g/L，玉米粉10_20g/L，葡萄糖 20-40g/L，豆柏粉 10-20g/L, KH2P04l_3g/L，MgSO4.7Η200.5-lg/L，豆油 0.5-1.5g/L，泡敌0.5-lg/L,其余为饮用安全水，pH值为5.0-7.0 (用食品级NaOH调节pH)。
[0028]优选配方为:桑蚕蛹粉末5g/L，玉米粉10g/L，葡萄糖30g/L，豆柏粉15g/L，KH2PO41 g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，豆油 lg/L,泡敌 0.5g/L，其余为饮用安全水，pH 值为
6.73 (用食品级NaOH调节pH)。
[0029]具体发酵生产工艺为:
[0030]本实施例全部培养基采用较优配方，以自有保存的蛹虫草菌种为出发菌株进行发酵，具体包括以下步骤:(I)将蛹虫草斜面菌种接种于装有200ml —级种子培养基的500ml三角瓶中，放入25°C恒温摇床，在转速150rpm/min下培养84h ；⑵将一级摇瓶种子以5%的接种量接种到装有400mL 二级种子培养基的IL三角瓶中，并置于25°C恒温摇床，以转速150rpm/min培养84h ； (3)将装有120L种子培养基在200L搅拌式发酵罐灭菌冷却后，调节pH值到5.1，将800mL 二级摇瓶种子接入种子发酵罐中，保持培养温度为25°C，搅拌速度为 100rpm/min(2h 搅拌 5min)，通气量为 I: 1.11V/V.min，罐压 0.4MPa，经 48h 培养，菌体湿重为22.9g/100mL发酵液；(4)将1500L发酵培养基装入发酵罐，灭菌冷却后，调节pH值到6.73，将种子罐的种子移入发酵培养罐中，保持培养温度为25°C，搅拌速度为IOOrpm/min(2h搅拌5min)，通气量为I: 0.72V/V.π?η，罐压0.04MPa，经84h培养后结束发酵，此时菌体湿重为40.63g/100mL发酵液(此时pH4.13)。(5)菌粉的加工:将发酵液经板框过滤放置24h后，湿菌体在85°C的烘箱中烘12h，将烘干的菌粉用机器进行粉碎，即为蛹虫草菌粉。菌粉虫草素含量为1.28%，多糖含量为5.28%。菌粉生产得率1.53%。铅、总砷含量分别0.26ppm和0.32ppm,远远低于国家限定标准(铅< 2ppm,总砷< Ippm)。
[0031]需要注意的是:以上所述，仅是本发明的一个较佳实例，但明显本发明不限于以上实例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员可以很容易对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均应认为本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种可大规模深层发酵生产高抗癌成分蛹虫草菌粉的工艺，其特征包括如下步骤: (1)一级摇瓶种子的培养:将蛹虫草斜面菌种接种于装有种子培养基的三角瓶中，放入25°C~28°C恒温摇床，在120~180rpm/min的转速下培养56~96h ； (2)二级摇瓶种子的扩大培养:将一级摇瓶种子接种到装有种子培养基的三角瓶中，置于25°C~28°C恒温摇床，在120~180rpm/min的转速下培养56~96h ； (3)种子罐的再扩大培养:将装有种子培养基的200L搅拌式发酵罐灭菌冷却后，调节pH值到5.0~6.5，将适量二级摇瓶种子接入种子罐中，保持培养温度为25~28°C，搅拌速度为 50 ~150rpm/min (2h 揽拌 5-lOmin)，通气量为 1: 0.8V/V.min ~1.5V/V.min,罐压0.03~0.06MPa,经40~50h培养，此时菌体湿重为20_30g/100mL发酵液； (4)1.5吨发酵罐生产:将800L发酵培养基装入发酵罐，灭菌冷却后，调节pH值到6.0~7.0，将种子罐的种子移入发酵罐中，保持培养温度为25~28°C，搅拌速度为50~150rpm/min(2h 搅拌 5-10min)，通气量为 .1:0.5V/V.min ~1: 1.5V/V.min，罐压 0.03 ~0.06MPa，经60~85h培养结束发酵(要求此时发酵液变得粘稠，培养基pH降到3.8~4.8，发酵液中湿菌丝达到40g/100mL发酵液以上)； (5)发酵菌粉的制备:将发酵液经板框过滤放置12-24h后，将湿菌体放置在.60℃ -85°C的烘箱条件下烘6-12h，将烘干的菌粉用机器进行粉碎，即为蛹虫草菌粉。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述一级、二级摇瓶种子的培养基和一级发酵罐种子培养基配方为:玉米粉10-20g/L，葡萄糖10-20g/L，豆柏粉5-15g/L，酵母膏.5-10g/L, KH2P04l-3g/L, MgSO4.7Η200.5-1.5g/L，豆油 0.5-1.5g/L，泡敌 0.5-lg/L，其余为饮用安全水，pH值为5.0-7.0 (用食品级NaOH调节pH)。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述的发酵罐培养基配方为:桑蚕蛹粉末 5-10g/L,玉米粉 10-20g/L,葡萄糖 20-40g/L,豆柏粉 10_20g/L，KH2P04l_3g/L，MgSO4.7Η200.5-lg/L，豆油 0.5-1.5g/L，泡敌 0.5_lg/L，其余为饮用安全水，pH 值为.5.0-7.0 (用食品级NaOH调节pH)。
【文档编号】C12R1/645GK103897990SQ201410154964
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】曾化伟, 乔洁, 廖祥儒, 蔡宇杰, 王立臣 申请人:曾化伟