对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用的制作方法

对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及对绿盲蝽进行RNA干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用，属于生物【技术领域】。一种对绿盲蝽进行RNA干扰的注射方法，其特征在于：注入dsRNA的注射位置为后胸与腹部节间膜的最外侧。首次建立了用于绿盲蝽基因功能研究的RNAi平台；创造性采用注射法对绿盲蝽进行RNAi时的最佳注射位置和特定dsRNA浓度下的最佳注射体积进行确定，检测并记录注射后绿盲蝽表现型的改变。该方法为筛选新的抗虫基因提供新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供新的基因资源进而依此达到发展经济有效，环境友好的新的方法来控制绿盲蝽的危害。
【专利说明】对绿盲蝽进行RNA干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及对绿盲蝽进行RNAi的注射方法以及利用该方法在筛选绿盲蝽生长发育关键基因上的应用。
【背景技术】
[0002]随着Bt棉花的大面积种植，棉铃虫的为害得到了有效地控制，然而绿盲蝽逐渐成为为害我国农业生产，尤其是棉田的重要害虫，发生面积占种植面积的90%左右，严重威胁棉花生产，导致棉花产量损失10%~20%。此外，绿盲蝽在为害棉花的同时，还影响枣、桃、樱桃、苹果和葡萄等农作物的生产。目前，对绿盲蝽的防治措施主要依靠化学防治。然而，长期大量使用农药进行害虫防治不仅会杀伤天敌、降低田间作物的自然调节能力、对自然环境造成污染、破坏生态平衡，而且长此以往，会增加绿盲蝽对化学农药产生抗性的风险。因此，开发一条经济有效、环境友好的绿色防治途径来控制绿盲蝽的危害成为当前迫在眉睫的重要任务之一。
[0003]RNA干扰(RNAi)技术是当今研究基因功能以及健康有效防治害虫的一个重要手段和研究热点。利用注射的方法进行RNAi实验用以筛选昆虫生长发育关键基因，在此基础上发展有效的抗虫转基因作物，可以为害虫防治提供一条新的可行途径。RNAi是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过诱发对同源mRNA的高效特异性降解来干扰目标基因的表达。当与内源性mRNA编码区同源的双链RNA导入细胞时，其被降解成21-23bp长度的小分子 RNA 即 siRNA,RNA 诱导沉默复合体(RNA-1nduced silencing complex, RISC)结合siRNA并将其解旋成单链，引导单链SiRNA根据碱基互补配对原则特异性地结合同源mRNA (靶标)，使mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。
[0004]RNAi是基因功能研究的一个革命性的发现，它极大的扩展了基因研究的思路和方法。从发现至今，RNAi技术在人类医学，基因工程以及农业等各个领域得以应用，并取得了很多突破。在医学方面，此技术已被用于临床疾病治疗，如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在农业害虫防治领域，2007年Baum等人在鞘翅目昆虫西方玉米根虫(WCR)中利用RNAi技术沉默290个基因后，发现其中125个基因有明显致死效果。至今为止，RNAi技术主要在双翅目、膜翅目、同翅目、鞘翅目、等翅目、鳞翅目和直翅目7个目中的15种昆虫中得到成功应用。由于RNAi现象在昆虫纲中是存在的，某些基因RNAi沉默后能够导致昆虫的死亡，所以如果能够利用转基因植物表达出特异的dsRNA，让昆虫在取食过程中摄入，对某些农业害虫的生长发育进行控制，从而能够将这种RNAi介导的转基因植物发展成一种害虫控制的新策略，为有效控制和防治农业害虫提供一条可行的途径和良好的前景。
[0005]然而，由于利用RNAi技术培育转基因植物，周期长，成本高，不能实现从大量基因中筛选功能基因，所以在成功发展转基因植物之前能够寻找既经济又简单快捷的方法筛选鉴定大量基因从而找到候选基因显得尤为重要。[0006]同时，有关半翅目昆虫RNAi实验的报道中，尚未有任何关于绿盲蝽抗虫基因及绿盲蝽RNAi的实验报告。因此，从绿盲蝽的大量基因中筛选鉴定对其生长发育起关键作用并在RNAi后能够影响其生长并导致死亡的基因，可以为接下来利用RNAi发展转基因植物，用以防治当前棉花重要害虫绿盲蝽提供重要的依据和基础，从而降低杀虫药剂使用量以及绿盲蝽抗药性的产生，避免新的生态问题产生，具有重要的经济、生态和社会效益。
[0007]虽然目前已经有关于，但是在技术方案之前，向绿盲蝽导入dsRNA能否引发RNAi效果并产生致死表型不得而知。

【发明内容】

[0008]本发明提供一种对绿盲蝽进行RNAi实验的注射方法，对绿盲蝽进行RNAi实验的注射参数(包括注射位置、注射体积，注射dsRNA总量)进行确定，并挑选了绿盲蝽持家基因β -actin验证绿盲蝽导入dsRNA能否引发RNAi效果并产生致死表型，结果表明导入β-actin基因dsRNA可以导致绿盲蝽生长发育受到严重不利的影响，甚至死亡的结论。该方法为筛选新的抗虫基因提供新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供新的基因资源进而依此达到发展经济有效，环境友好的新的方法来控制绿盲蝽的危害。
[0009]对绿盲蝽进行RNAi实验的注射方法，其特征在于:注射位置为后胸与腹部节间膜的最外侧。
[0010]所述用于注射的dsRNA浓度为10 μ g/ μ 1，注射体积为41.4nl。
[0011]所述绿盲蝽为3L若 虫。
[0012]一种建立绿盲蝽生长发育关键基因的筛选方法，包括如下步骤:(I)取绿盲蝽总RNA,通过RT-PCR得到cDNA ； (2)选定目标基因一段特异性片段，设计带有T7序列的特异性引物；(3)通过PCR技术扩增目的基因片段:以第一步得到的cDNA为模板，第二步设计的特异引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(4)构建含有选定目的基因片段的载体:将目的基因片段用T4DNA连接酶插入载体PGM-T中，转入宿主大肠杆菌中，富集培养，提取含有目的基因片段的质粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的质粒为模板，第二步设计的特异性引物扩增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(6)利用T7RNA聚合酶将上一步得到的PCR产物合成为目的基因片段dsRNA ; (7)将dsRNA按上述注射方法导入绿盲蝽的体内，持续饲养记录若虫经RNAi后的表现型；(8)统计死亡率，确认该目的基因与生长发育的关系。
[0013]所述特异性片段为400_500bp。
[0014]所述目的基因为绿盲蝽β -actin基因，其序列如SEQ ID NOl所示。
[0015]所述绿盲蝽β -actin基因的特异性片段序列如SED ID N04所示。
[0016]所述步骤(7)的同时，将GFP基因的dsRNA作为对照组注射入绿盲蝽体内，所述GFP基因序列如SEQ ID N02所示。
[0017]所述GFP基因的特异性片段序列如SEQ ID N03所示。
[0018]所述持续饲养时间为5-10天。
[0019]本发明用注射法对绿盲蝽进行RNAi实验的注射参数(包括注射位置、注射体积，注射dsRNA总量)进行确定，并挑选了绿盲蝽持家基因β -actin验证绿盲蝽导入dsRNA能否引发RNAi效果并产生致死表型，结果表明导入β-actin基因dsRNA可以导致绿盲蝽生长发育受到严重不利的影响，甚至死亡的结论。
[0020]本发明首次建立了用于绿盲蝽基因功能研究的RNAi平台；同时利用建立的RNAi平台筛选得到了持家基因、能量代谢相关基因、细胞凋亡相关基因等多个与绿盲蝽生长发育密切相关的基因。本研究为筛选新的抗虫基因提供了新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供了新的基因资源。实践表明，发展转基因抗虫作物能有效地控制害虫危害，RNAi是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1 3龄绿盲蝽的注射位置
[0022]其中:1:前胸和中胸的节间膜 [0023]I1:后胸与腹部节间膜的最外侧
[0024]II1:腹部第2和第3节间膜最外侧
[0025]图2注射dsGFP与注射ds β -actin绿盲蝽7天内生存率。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下面涉及到的化学试剂均为市
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[0027]1、绿盲蝽总RNA的提取
[0028]绿盲蝽总RNA提取的过程在超净工作台内进行(离心除外)，以避免RNA酶(RNase)污染降解RNA。整个提取步骤如下所示:
[0029]1.取3-5头经过72小时饥饿处理的绿盲蝽，加入经液氮冷却的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1ml RNA提取试剂(Trizol)，将组织磨碎；将研磨好的组织溶液倒入
1.5ml无RNA酶的离心管中，置于冰上；
[0030]2.40C，12000g离心15min，将上清液体转移到新的1.5ml无RNA酶离心管中；
[0031]3.将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入200 μ I氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min ；
[0032]4.4°C，12000g离心15min，混合物在此时分层，下层为有机相，上层为水相(RNA在水相中);将上层水相转移到新的1.5ml无RNA酶离心管中，向离心管中加入500 μ I异丙醇，室温静置IOmin ；
[0033]5.4°C，12000g离心10min后，弃掉上清(尽量吸净)，向离心管中加入lml75%的乙醇(用无RNA酶的H2O配置，现用现配)，震荡离心管以洗涤沉淀；
[0034]6.4°C，7500g离心10min后，弃掉上清(尽量吸净)，在超净工作台中干燥5-10min ；
[0035]7.加入20 μ I无RNA酶的H2O,震荡离心，使沉淀充分溶解；
[0036]8.60°C温育IOmin后，取I μ I样品稀释至5μ1,其中2.5μ1进行电泳检测，
2.5μ I用浓度测量仪器(NanoDiOP)检测浓度；如果凝胶电泳检测结果合格且样品OD值如下:
[0037]260/280:1.80 ~2.00[0038]260/230:1.80 ~2.00
[0039]则说明RNA质量良好，存于_80°C备用。
[0040]2、第I链cDNA的合成
[0041]整个反转录过程尽量保证在超净工作台内进行，操作步骤按第一链cDNA合成试剂盒进行，具体操作如下:
[0042]1.在新的1.5ml无RNA酶离心管中加入2 μ g RNA (根据浓度测量的结果计算需加入RNA的体积数)，再加入I μ I引物(oligo-dT)，用无RNA酶的H2O补至12 μ I ;
[0043]2.65°C温育5min,之后马上置于冰上；
[0044]3.在离心管中分别加入下列试剂，使体系达到20μ 1:4μ I的5Χ反应缓冲液；2 μ I的dNTP混合物(IOmM) ；1μ I的反转录酶和I μ I的RNA酶抑制剂；简单混匀后，离心片刻；
[0045]4.42°C温育lh，然后再70°C温育5min ;合成后存于_20°C冰箱,使用前稀释10倍。
[0046]3、靶标基因的克隆
[0047]本发明选取了持家基因、能量代谢相关基因和细胞凋亡相关基因上的基因片段，通过注射法研究其对昆虫的影响，GFP基因上的片段作为对照。持家基因又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的；而能量代谢相关基因和细胞凋亡相关基因也在绿盲蝽生长发育和生理过程中起着非常重要的作用。本发明选取此类基因上的片段，利用注射法进行RNAi将其沉默，研究观察沉默该基因后，对绿盲蝽个体发育造成的影响。GFP即绿色荧光蛋白，在昆虫体内并不存在，故大量研究中将其作为对照基因合成dsRNA。
[0048]1.靶标基因引物的设计:
[0049](I)利用BLAST检索数据库，搜索绿盲蝽的相近物种同一靶标基因的蛋白或者cDNA编码的氨基酸序列，用绿盲蝽成虫若虫转录组组建的本地BLAST库进行比对查询，确定所选基因的序列。
[0050](2)根据祀标基因的片段,用Primer Premier5.0软件设计带T7启动子的引物，弓丨物设计原则如下:
[0051]a.引物设计的区间要在靶标基因的编码区，中间片段大小在400~500bp左右。[0052]b.中间片段尽量选在靶标基因的特异区域。
[0053]c.引物之间不能形成引物二聚体，交叉二聚体。
[0054]2.根据以上引物设计原则设计引物后，送至华大基因进行引物合成。
[0055]3.相关靶标基因的引物序列见表1-1。
[0056]表1.实验所用引物
[0057]
【权利要求】
1.对绿盲蝽进行RNAi实验的注射方法，其特征在于:注入dsRNA的注射位置为后胸与腹部节间膜的最外侧。
2.根据权利要求1所述的注射方法,其中用于注射的dsRNA浓度为10μg/μ 1，注射体积为 41.4nl。
3.根据权利要求2所述的注射方法，所述绿盲蝽为3L若虫。
4.一种建立绿盲蝽生长发育关键基因的筛选方法，包括如下步骤:(I)取绿盲蝽总RNA,通过RT-PCR得到cDNA ； (2)选定目标基因一段特异性片段，设计带有T7序列的特异性引物；(3)通过PCR技术扩增目的基因片段:以第一步得到的cDNA为模板，第二步设计的特异引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(4)构建含有选定目的基因片段的载体:将目的基因片段用T4DNA连接酶插入载体PGM-T中，转入宿主大肠杆菌中，富集培养，提取含有目的基因片段的质粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的质粒为模板，第二步设计的特异性引物扩增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(6)利用T7RNA聚合酶将上一步得到的PCR产物合成为目的基因片段dsRNA ； (7)将dsRNA按权利要求1-3任一所述的注射方法导入绿盲蝽的体内，持续饲养记录若虫经RNAi后的表现型；(8)统计死亡率，确认该目的基因与生长发育的关系。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，所述特异性片段为400-500bp。
6.根据权利要求4所述的筛选方法，所述目的基因为绿盲蝽β-actin基因，其序列如SEQ ID NOl 所示。
7.根据权利要求6 所述的筛选方法，所述绿盲蝽β-actin基因的特异性片段序列如SED ID N04 所示。
8.根据权利要求4所述的筛选方法，所述步骤(7)的同时，将GFP基因的dsRNA作为对照组注射入绿盲蝽体内，所述GFP基因序列如SEQ ID N02所示。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，所述GFP基因的特异性片段序列如SEQID N03所/Jn ο
10.根据权利要求4所述的筛选方法，持续饲养时间为5-10天。
【文档编号】C12Q1/68GK103993079SQ201410201539
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】王桂荣, 刘方舟, 杨婷, 刘杨 申请人:中国农业科学院植物保护研究所