一种microRNA在猪肌内脂肪检测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于本发明属于家畜分子标记制备与应用【技术领域】，具体涉及一种与猪肌内脂肪相关miRNA标志物及其特异引物的应用，所述的miRNA标志物基因是基于猪的microRNA-133a3p基因，利用该基因作为内参基因通过实时荧光定量PCR方法检测microRNA在猪肌内脂肪中的表达量的差异，结果显示本发明克隆制备的Ssc-miR133a3p基因的标志物的表达量高，稳定性强，重复性优于U6和18S?rRNA基因的引物。
【专利说明】—种microRNA在猪肌内脂肪检测中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于家畜分子标记制备与应用【技术领域】，具体涉及一种与猪肌内脂肪相关miRNA标志物及其特异引物的应用，所述的miRNA标志物基因是基于猪的microRNA-133a3p基因，利用该基因作为内参基因通过实时荧光定量PCR方法检测microRNA在猪肌内脂肪中的表达量。
【背景技术】
[0002]随着人们生活质量的提高，消费者对猪肉的品质要求也相应的提高，比如猪肉的口感，多汁和嫩度。而肌内脂肪(Intramuscular fat,简称IMF)即大理石纹对猪肉的品质有着至关重要的作用(谭林和姜海龙，2010)。IMF主要分布在肌束和肌纤维之间，其从肌纤维间融化出来而使肉质鲜嫩多汁。研究表明，頂F与肉质优劣呈正相关，但MF沉积的具体机制还不是很清楚。
[0003]MF含量是由脂肪细胞的生长发育决定的，脂肪细胞的增殖和肥大可以促进MF的沉积。有研究发现，涉及到脂滴代谢和脂肪形成的miCToRNA对脂肪细胞的形成有重要的作用(Xie et al.，2009)。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为18-25个核苷酸的非编码单链RNA分子。有研究表明miRNA可以调节脂肪代谢和骨骼肌的分化(Krutzfeldt and Stoffel, 2006) ?为了揭示miRNA在猪的MF形成过程中的作用，我们检测了 236头纯种大白猪的背最长肌IMF含量，从中选取高低各3个个体，选取与肌内脂肪高度相关的几个miRNA ，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行表达量的检测。
[0004]qRT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点。然而在分析数据过程中，RNA样品之间，反转录效率，以及人为因素等都会对目的基因表达结果产生影响，因此需要选择合适的内参基因进行校正和标准化，减少样本之间的差异(袁伟等，2012)。使用不理想的内参基因会对数据分析造成偏差。内参基因常常是看家基因，动物中常用的内参基因包括18S核糖体RNA(18S rRNA)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)，U6，ATCB等，选择正确的内参基因很大程度上取决于所研究的组织、细胞及实验目的等。
[0005]目前还没有一种理想的内参基因可以完全用于任何实验条件，且表达恒定不变， 申请人:根据实验目的和样品类型的不同，应当选择合适而稳定的内参基因进行校正和标准化，以期得到可靠的实验结果。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与猪肌内脂肪相关microRNA标志物及其特异引物的应用，该microRNA标志物在肌肉中特异性表达，且表达量高，我们将其命名为SSc-miR-133a3p基因，本发明通过筛选得到一种与猪肌内脂肪性状相关的microRNA实时荧光定量(qPCR)内参基因，通过与动物常用内参基因U6和18S rRNA或其组合，提供双内参基因片段，通过双内标方法进行猪的肌内脂肪性状的检测。
[0007]在本发明中， 申请人:选择以U6为内参基因，研究microRNA的表达情况。结果发现U6在猪肌内脂肪中的表达稳定性较差，扩增效率不均一，同一批处理样品，U6的Ct值会有2-3个的差异,而ssc-miR_133a3p在相应组织样中的表达稳定性均优于传统内参基因U6,其主要特点是扩增效率高，适合用于本发明的需要。
[0008]更详细的技术方案如下所述:
[0009] 申请人:从NCBI数据库中克隆得到猪的U6，18S rRNA和ssc-miR-133a3p基因的核苷酸序列，NCBI数据库中miR-133a3p基因被著录的用途定义为与脂肪的沉积相关。
[0010]一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物在猪肌内脂肪相关检测中的应用，该标志物的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:9所示。
[0011]一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，这些特异引物是如下所示的引物对和茎环引物，它们的核苷酸序列如下所示:
[0012]U6基因的引物:
[0013]正向引物:TCGCTTCGGCAGCACATATAC,
[0014]反向引物:CGAATTTGCGTGTCATCCTTGC；
[0015]18S rRNA基因的引物:
[0016]正向引物:CGACC ATAAACGATGCCGACT，
[0017]反向引物:GTGCCCTTCCGTCAATTCCT；
[0018]ssc_miR133a3p 基因的引物:
[0019]茎环引物:
[0020]GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG，
[0021 ]正向引物:CGCGGATTGGTCCCCTTC，
[0022]通用引物:CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA。
[0023]与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，上述U6基因的引物、18S rRNA基因的引物以及ssc-miR133a3p基因的引物可以单独或组合使用作为检测猪肌内脂肪含量的标准化的内参标志物，其中:所述的U6基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID N0:3所示，所述18S rRNA基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所述，ssc-miR133a3p基因的引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所述，这些引物单独或组合使用可以作为检测肌内脂肪含量的标准化的内参标志物。
[0024] 申请人:建立了一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用,其核心在于采用双内标的法构建反转录反应体系，该反转录反应体系包括如下所述:
[0025]核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的microRNAs标志物和如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的引物,反转录反应体系如下所示:
[0026]总RNA/mRNA 20ng_5μ g/5_500ng ;
[0027]Anchored Oligo (dT) 18 弓丨物(0.5 μ g/ μ I)，I μ I ;
[0028]随机引物(0.1μ g/μ 1)，1μ I ;或 GSP特异性引物，2pmol(0.5μ I)；
[0029]2Χ 反转录反应Mix, 10 μ I,TransScript 〇 R RT/RI Enzyme Mix反转录酶，1μ1;
[0030]去基因组DNA酶，1μ I ;[0031]RNase-无 RNA 酶水，补充至 20 μ I。
[0032]如上述体系所述应用，其中microRNA使用的是茎环引物方法扩增，以Ssc-miR-133a3p作为标志物，其扩增引物DNA序列如下:
[0033]茎环引物:
[0034]5’ GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG3’，长度为 50bp，
[0035]正向引物:5’CGCGGATTGGTCCCCTTC3’，长度为 18bp，
[0036]通用引物:5’CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA3’ ；长度 20bp，
[0037]PCR扩增所得产物长度为为71bp
[0038]具体地，本发明通过以下技术方案实现:
[0039]提取猪背最长肌的RNA，进行反转录；根据NCBI和miRBase数据库中公布的猪的U6,18S rRNA (基因登录号:G1: 374532828)，ssc_miR-133a3p (登录号:MIMAT0010186)基因的序列信息，设计PCR特异引物。用该引物对进行PCR扩增，分别得到长度为84bp、141bp和71bp的扩增片段(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)，与此同时对U6，18S rRNA和ssc-miR133a3p基因进行实时荧光定量PCR反应，多次重复后发现miR-133a3p片段在猪肌内脂肪中的表达量明显比基因U6和18S rRNA的表达量要稳定，反转录效率较高，为研究猪的肉质性状特别是与猪肌内脂肪相关检测提供了适宜的内参基因，或者 可以与U6基因作为双内标基因对猪的肌内脂肪性状进行相关的研究、分析和检测。
[0040]更详细的技术方案如《具体实施方法》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]序列表SEQ ID N0:1是报道的猪U6基因全序列的核苷酸序列，序列长度为107bp。
[0042]序列表SEQ ID NO:2是本发明扩增U6基因的正向引物的序列(21bp)。
[0043]序列表SEQ ID NO:3是本发明扩增U6基因的反向引物的序列(22bp)。
[0044]序列表SEQ ID NO:4是本发明扩增18S rRNA基因的正向引物的序列(21bp)。
[0045]序列表SEQ ID NO:5是本发明扩增18S rRNA的基因反向引物的序列(20bp)。
[0046]序列表SEQ ID NO:6是本发明扩增ssc-miR133a3p基因的茎环引物的序列(50bp)。
[0047]序列表SEQ ID NO:7是本发明扩增ssc_miR133a3p基因的正向引物的序列(18bp)。
[0048]序列表SEQ ID NO:8是本发明扩增ssc-miR133a3p的基因的通用引物序列(20bp)。
[0049]序列表SEQ ID NO:9是本发明克隆得到的猪的ssc-miR-133a3p基因的成熟子序列(即，本发明的分子标记)(21bp)。
[0050]图1:是本发明的总体技术路线图。
[0051]图2:是大白猪高低肌内脂肪组织反转录后U6，18S rRNA和SSC-miR133a3p基因的cDNA检测。图中标记说明:M泳道为DNA分子量标记(DL500，宝生物工程大连有限公司)。
[0052]图3:大白猪高低肌内脂肪个体RNA凝胶电泳结果。其中肌内脂肪含量高的个体为:H153, H193，H309，肌内脂肪含量低的个体为L13，L18，L311。[0053]图4:对大白猪高低MF含量个体中各候选基因的表达情况的检测(仅对各个基因表达的Ct值进行了统计分析)。
[0054]图5:利用在线软件综合分析各个候选内参基因的表达稳定性。
[0055]图6:利用在线软件通过Λ Ct方法分析各个候选内参基因的表达稳定性。
[0056]图7:利用在线软件Bestkeeper方法分析各个候选内参基因的表达稳定性。
[0057]图8:利用在线软件Normfinder方法分析各个候选内参基因的表达稳定性。
[0058]图9:利用在线软件Genorm方法分析个各候选内参基因的表达稳定性。
【具体实施方式】
[0059]以下对本发明的【具体实施方式】及发明效果进行说明，但不是对本发明的限制。
[0060]实施例1
[0061 ] 一、构建猪的家系及猪肌内脂肪测定
[0062]用于分析的实验猪群为纯种大白猪(为常规品种，华中农业大学动物遗传育种与繁殖分子生物学实验室与辉瑞制药有限公司合作组建的FCR项目试验群体，按照常规方法，该群体由华中农业 大学实验猪场喂养，共计236头，大白猪为来自国外血缘猪的常用品种)，体重达到SO-1OOkg时进行屠宰，样品收集分21个批次进行，屠宰后测定性状包括关联分析所用的体长数据，其包括:胴体长(简称CL)、胴体斜长(简称CDL)、肋骨数(简称RN)、肌内脂肪(简称IMF)等。
[0063]对236头纯种大白猪的背最长肌进行肌内脂肪测定，检测不同个体的肌内脂肪含量，并进行相关的分析。
[0064]二、个体的选择
[0065]根据本发明所需要的样品要求，对肌内脂肪数据进行标准化后，选取高低肌内脂肪含量的纯种大白猪个体各3头作为分析样本，选取个体的肌内脂肪含量进行测定，数据统计见表1所述。
[0066]表1纯种大白猪高低肌内脂肪含量的个体信息
[0067]
【权利要求】
1.一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物在猪肌内脂肪相关检测中的应用，其特征在于该标志物的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:9所示。
2.—种权利要求1所述的与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，其特征在于，所述的特异引物是如下所示的引物对和茎环引物，其核苷酸序列如下所示: U6基因的引物: 正向引物:TCGCTTCGGCAGCACATATAC， 反向引物:CGAATTTGCGTGTCATCCTTGC ； 18S rRNA基因的引物: 正向引物:CGACCATAAACGATGCCGACT， 反向引物:GTGCCCTTCCGTCAATTCCT ； ssc_miR133a3p基因的引物: 茎环引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC GAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG, 正向引物:CGCGGATTGGTCCCCTTC， 通用引物:CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA。
3.如权利要求2所述的与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，其特征在于，U6基因的引物、18S rRNA基因的引物以及ssc-miR133a3p基因的引物单独或组合作为检测猪肌内脂肪含量的标准化的内参标志物，其中:所述的U6基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，所述18S rRNA基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所述，ssc-miR133a3p基因的引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所述，这些引物单独或组合使用作为检测肌内脂肪含量的标准化的内参标志物。
4.如权利要求2所述的与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，其特征在于，采用双内标的法构建反转录反应体系，该反转录反应体系包括如下所述: 核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的microRNAs标志物和如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物,该反转录反应体系如下所示:
总 RNA/mRNA 20ng_5 μ g/5_500ng ； ` 0.5 μ g/ μ I 的 Anchored Oligo (dT) 18 引物，I μ I ; `0.1 μ g/ μ I的随机引物，1μ I ; 或0.5 μ I的GSP特异性引物，2pmol ； 2X 反转录反应Mix, 10 μ I, TransScript? RT/RI Enzyme Mix 反转录酶，I μ I ;去基因组 DNA 酶，1μ I ； RNase-无RNA酶水，补充至20 μ I。
【文档编号】C12Q1/68GK103981267SQ201410218807
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】曹建华, 刘慧莹, 赵书红, 李长春, 李新云, 朱猛进, 余梅 申请人:华中农业大学