血清Exosomes来源的长链非编码RNA LINC00470的应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种血清外泌体(Exosomes)来源的长链非编码RNA(long?no-coding?RNA，LncRNA)LINC00470的应用方法，即血清Exosomes来源的LncRNA?LINC00470用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂。通过研究证实在胶质瘤患者血清中分离Exosomes后提取RNA，逆转录并进行实时荧光定量分析发现LncRNA?LINC00470表达水平下调。本发明利用血清Exosomes来源的LncRNA?LINC00470对胶质瘤早期诊断的特异性可达85.7％，灵敏度达到94.1％。通过检测胶质瘤患者血清Exosomes中LncRNA?LINC00470的表达水平，从而对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。
【专利说明】血清Exosomes来源的长链非编码RNA LI NC00470的应用方
法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及血清Exosomes来源的LncRNALINC00470在胶质瘤诊断中的应用方法。
【背景技术】
[0002]胶质瘤约占所有原发性神经系统肿瘤的60%，可发生于中枢神经系统的任何部位和任何年龄，手术切除是首选的治疗方法。由于胶质瘤多呈浸润性生长无明确的边界，手术难以真正彻底切除，而且术后局部复发率高，虽然近年来影像学诊断技术不断发展，显微神经外科技术得到应用，但是胶质瘤的诊断和治疗总体上并没有明显的进步，大多在确诊后数年死亡。目前，对胶质瘤的早期确诊和规范治疗还难以令人满意，因此，寻找无创伤性的胶质瘤早期诊断标志物对高危人群进行筛查，以便对胶质瘤患者进行早期诊断、早期治疗，提高患者生存率，一直是神经科学领域研究的主要任务。[0003]Exosomes是一类直径为30_150nm的囊泡，含有RNA、脂质和蛋白质等成分。在血液，唾液，尿液，脑脊液和母乳等多种体液中均有存在，可在体液中来回穿梭，在细胞之间运送遗传物质和蛋白质。肿瘤在生长过程中会不断地将Exosomes释放到周围环境中去，同时Exosomes可以在4°C条件下保存96小时或是_70°C下保存更长时间，而且通过在血清中分离Exosomes进行胶质瘤诊断克服了直接利用血液提取分子进行肿瘤诊断的血液中非检测物质的影响，使检验结果更加真实，精确。这些特点使得Exosomes有助于肿瘤的早期诊断和预后判断。通过研究在膀胱癌患者尿液来源的Exosomes中发现了 PCA-3，TMPRSS2两个生物标志物；在黑色素瘤患者血浆Exosomes中肿瘤相关标志物CAVl表达水平明显增加，以此可诊断黑色素瘤，在肺癌模型发现Exosomes中的miRNA可作为肺癌的标志物。利用Exosomes来源的LncRNA LINC00470来诊断脑胶质瘤不但能更好的对胶质瘤患者进行诊断，提早治疗，而且使得检验结果更加灵敏，特异。以上显示出血清Exosomes来源的LncRNALINC00470在胶质瘤早期诊断和筛查中的巨大潜力。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种血清Exosomes来源的LncRNA LINC00470 (longintergenic non-protein coding RNA470)定位于染色体 18pll, GeneBank 登录号:NR-023925的应用方法，尤其是一种能够用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂的应用方法。研究证实血清Exosomes来源的LncRNA LINC00470可用于胶质瘤患者的诊断，Exosomes来源的LncRNA LINC00470表达下调与胶质瘤组织验证结果具有一致性，且检验结果的灵敏性高，特异性好。因此Exosomes可用于胶质瘤高危人群的筛查和早期诊断和预后。
[0005]血清Exosomes来源的长链非编码RNA LINC00470的应用方法，所述的血清Exosomes来源的长链非编码RNA LINC00470用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA LINC00470的序列见SEQ NO:1。
[0006]所述的用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。
[0007]所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物:
[0008]Lnc RNA LINC00470 正向引物:5' -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3'，
[0009]Lnc RNA LINC00470 反向引物::5' -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3'。
[0010]所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒，
[0011]该试剂盒包括:(I)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA LINC00470逆转录为cDNA所 用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA LINC00470所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNALINC00470实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；
[0012]LncRNA LINC00470实时荧光定量PCR特异性引物:
[0013]LINC00470 正向引物 5’ -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3’
[0014]LINC00470 反向引物 5’ -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3’
[0015]U6snRNA内参特异性PCR引物:
[0016]正向引物为5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0017]正向引物为5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0018] 申请人:通过荧光定量分析发现Lnc RNA LINC00470在52例胶质瘤组织与12例正常人的脑组织中存在差异性表达(P = 0.0449)(图1)，且在胶质瘤组织中表达下调，进一步在血清中分离Exosomes用于LncRNA LINC00470的检测，发现LncRNA LINC00470的表达与正常人的表达存在明显的差异(P = 0.0455)(图2)，且与组织中的检测结果相一致。此方法可以检测各人群中LncRNA LINC00470的表达水平，从而预测胶质瘤患者的患病风险，筛查高危人群，并对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。本发明对胶质瘤早期诊断特异性好(图4)，可达85.7 %，灵敏度可达94.1 %，只需在Exosomes提取RNA即可检测LncRNALINC00470的表达水平，操作简单，稳定性好。不仅可用于胶质瘤的早期诊断而且可以用于胶质瘤患者的大规模筛查和患病风险的预测，为胶质瘤的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为实时荧光定量PCR分析LncRNA LINC00470在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达差异；
[0020]图2为实时荧光定量PCR分析Exosomes来源的LncRNA LINC00470在胶质瘤患者与正常人中的表达差异；
[0021]图3为Roc分析Exosomes来源的LncRNA LINC00470对胶质瘤早期诊断的特异性，
灵敏性。
【具体实施方式】[0022]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0023]实施例1制备长链非编码RNA LINC00470用于胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)
[0024]1.RNA 稳定溶液 50ml
[0025]2.异丙醇 100mL
[0026]3.三氯甲烷 100mL
[0027]4.Trizol 试剂 50ml
[0028]5.无酶水 IOml
[0029]6.1 μ M随机逆转录引物50ul [0030]7.5 X逆转录缓冲液200ml
[0031]8.1OmM三磷酸碱基脱氧核苷酸IOOul
[0032]9.40U/ μ I RNA 酶抑制剂 500ul
[0033]10.200U/ μ I MMLV 逆转录酶 50ul
[0034]11.Premix Ex Taq 50ul
[0035]12.10 μ M LncRNA LINC00470 实时荧光定量 PCR 特异性引物 30ul
[0036]LINC00470 正向引物 5’ -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3’
[0037]LINC00470 反向引物 5’ -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3’
[0038]I3.10 μ M U6SnRNA 特异性引物 3Oul
[0039]正向引物为5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0040]正向引物为5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0041]实施例2
[0042]LncRNA LINC00470在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达差异的验证
[0043]1、收集待测胶质瘤组织放入盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至_80°C冰箱备用。
[0044]2、组织中RNA的抽提:取适量标本于经180°C烘烤6_8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml Trizol研钵标本,研磨成液体状后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震荡15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g离心15min ;小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀,_20°C冰箱静置20min，4°C 12000g离心10min ;弃上清，加入75% DEPC水稀释的乙醇l_2ml混匀，40C 7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，0D260/280比值在1.8-2.0之间，_80°C保存。
[0045]3>LncRNA LINC00470逆转录:使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20 μ L逆转录反应的体系如下:
[0046]
j剂量/管
随机逆转录引物(?μΜ) TTl
RNA样本2ug
无酶水Το12μ I[0047]逆转录第一步条件:65°C 5分钟
[0048]
【权利要求】
1.血清Exosomes来源的长链非编码RNALINC00470的应用方法，其特征在于，所述的血清Exosomes来源的长链非编码RNA LINC00470用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA LINC00470的序列见SEQ NO:1。
2.根据权利要求1所述的长链非编码RNALINC00470的应用方法，其特征在于，所述的用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。
3.根据权利要求2所述的长链非编码RNALINC00470的应用方法，其特征在于，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物: Lnc RNA LINC00470 正向引物:5' -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3'， Lnc RNA LINC00470 反向引物::5' -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3'。
4.根据权利要求3所述的长链非编码RNALINC00470的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒， 该试剂盒包括:(I)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA LINC00470逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA LINC00470所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNALINC00470实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水； LncRNA LINC00470实时荧光定量PCR特异性引物:
LINC00470 正向引物 5’ -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3’
LINC00470 反向引物 5’ -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3’ U6snRNA内参特异性PCR引物: 正向引物为 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 正向引物为 5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
【文档编号】C12N15/11GK103981271SQ201410225278
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】武明花, 刘长红, 余志斌, 徐刚, 李桂源 申请人:中南大学