美人鱼发光杆菌快速检测引物、试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了美人鱼发光杆菌快速检测引物、试剂盒及应用，其引物由外引物和内引物组成，外引物由SEQ?ID?NO.1所示的外引物上游引物和SEQ?ID?NO.2所示的外引物下游引物组成；内引物由SEQ?ID?NO.3所示的内引物上游引物和SEQ?ID?NO.4所示的内引物下游引物组成。本发明解决了现有技术检测美人鱼发光杆菌周期长、检测成本高、不能应用于现场检测等问题，检测快速有序，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，不易出错。扩增引物具有很好的特异性和准确性。采用内置染料的方法，反应结束后不用打开反应管，取出后直接肉眼观察结果，避免了被扩增产物污染后续待检样品，提高了该试剂盒的应用可靠性。
【专利说明】美人鱼发光杆菌快速检测引物、试剂盒及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒及其检测方法，具体是一种采用环介导等温扩增技术对养殖鱼类致病菌进行快速检测的试剂盒及其检测方法，属于水产病原菌快速检测领域。
【背景技术】
[0002]美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(PhotobacteriumdamseIae subsp.piscicida)为一种具溶血性的革兰氏阴性短杆菌，有荚膜，曾被称为杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)、美人鱼弧菌(Vibrio damsela),寄生感染宿主不具特异性,对多种养殖鱼类均有高致病性，可引起美洲狼自卢、斑点叉尾鮰、日本五条蛳、军曹鱼、黄尾蛳、金头鲷等发病，在国内，已从发病的大黄鱼、半滑舌鳎、卵形鲳鰺、东星斑、龙胆石斑鱼等分离到该菌，是养殖鱼类的重要致病菌之一，具有很强的传染性，一旦发病，可造成很高的死亡率。由于水产动物特定的生活环境和生理特性，病害一旦发生，很难控制，往往造成巨大的经济损失，因此对于水产动物疾病，病原的早期检测与及时有效的预防治疗尤为重要。目前对于鱼类美人鱼发光杆菌的检测，主要采用传统的细菌分离鉴定，血清学反应及PCR检测技术尚未建立，细菌分离鉴定耗时长，成 本高，多以杀死水产动物为前提，操作复杂，需要专业的仪器设备和技术人员，养殖生产中急需一种能够应用于养殖现场的、快速准确、操作简便的美人鱼发光杆菌检测技术及其产品。
[0003]环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是2000年建立的一种新型核酸等温扩增技术，其特征是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，在等温条件(60~65°C )放置30~60min即可完成核酸扩增反应，反应液中加入核酸染料SYBR Green I或钙黄绿素，若有核酸扩增即可显示颜色反应，即时得到检测结果。LAMP的核心技术为特异性基因片段的选取及其引物的设计，弓丨物不同，所建立的LAMP检测技术在反应准确性、特异性、灵敏性方面也有所不同。目前尚未有关于美人鱼发光杆菌LAMP检测技术的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种美人鱼发光杆菌快速检测引物。
[0005]本发明的第二个目的是提供一种能应用于现场检测的一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒。
[0006]本发明的第三个目的是提供一种检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，对鱼体损伤小的、操作简便的不易出错的一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用。
[0007]本发明的技术方案概述如下:
[0008]一种美人鱼发光杆菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID N0.3所示的内引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的内引物下游引物组成。
[0009]一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒，包括:
[0010](I)样品预处理液，其组成为 pH = 8.0 的 20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA，体积浓度为1.2% Triton X-100，溶剂是蒸馏水；
[0011]⑵DEPC 水；
[0012](3) LAMP反应液，24 μ I LAMP反应液的组成为:2.5 μ IlOX反应缓冲液；3μ I浓度为2.5mmol/L的dNTP ; I μ I浓度为8U/ μ I的Bst DNA聚合酶；I μ I浓度为5 μ mol/L的由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，1μ I浓度为5 μ mol/L的由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，1μ I浓度为40 μ mol/L的由SEQ ID N0.3所示的内引物上游引物，I μ I浓度为40 μ mol/L的由SEQ ID N0.4所示的内引物下游引物；4 μ 11.6mol/L的甜菜碱；1 μ I钙黄绿素与锰离子形成的配合物、8.5μ I DEPC水；
[0013](4)阳性对照液，所述阳性对照液为I μ g/ml的美人鱼发光杆菌基因组DNA ;
[0014](5)无菌封装的FTA膜片、研磨棒若干。
[0015]上述一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用，包括如下步骤:
[0016](I)取待检样品组织加入100 μ I样品预处理液,研磨棒研磨,煮沸后静置IOmin,得到上清液；
[0017](2)将FTA膜片在步骤(1)获得的上清液中充分润湿后室温干燥；另取两片FTA膜片分别在DEPC水、阳性对照液中充分润湿后室温干燥，作为阴性对照膜片和阳性对照膜片;
[0018](3)将步骤⑵获得的膜片分别加入100 μ I DEPC /K，震荡洗涤3~5min ;从洗涤液中取出膜片，分别放入盛有24 μ I LAMP反应液的反应管中，置于60-65°C条件下保温40~60min，得到阴性对照、阳性对照和检测液；
[0019](4)阴性对照呈橙色，阳性对照呈绿色，根据检测液颜色判断是否含有美人鱼发光杆菌。
[0020]待检样品为鱼血液、鱼脾、鱼肾组织或细菌。
[0021]本发明的优点:
[0022](I)本发明解决了现有技术检测美人鱼发光杆菌周期长、检测成本高、不能应用于现场检测等问题，使检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，不易出错。
[0023] (2)本发明依据优选的美人鱼发光杆菌IGS2 (AJ535849.1)基因所设计的扩增引物能有效检测美人鱼发光杆菌，具有很好的特异性和准确性。
[0024](3)采用内置染料的方法，反应结束后不用打开反应管，取出后直接肉眼观察结果，避免了被扩增产物污染后续待检样品，提高了该试剂盒的应用可靠性。
[0025](4)基于对取样方法的改进，不经过细菌培养，仅需取少量鱼类血液等样品即可进行检测，实现了微创取样，尤其适用于经济价值较高的鱼类。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒检测结果示意图。
[0027]图2为美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒实际应用检测结果图。[0028]图3为美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒实际应用检测结果图。
[0029]图4为美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒灵敏性检测结果图。
[0030]图5为美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒特异性检测结果图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，下面的实施例并不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内。
[0032]本发明所用仪器及试剂:
[0033]电热恒温水浴锅购自北京三二八科学仪器有限公司；高速冷冻离心机购自SIGMA公司；Bst DNA聚合酶、IOX反应缓冲液、dNTP购自NEB公司；引物SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4均由上海生工生物工程有限公司合成；DEPC水、Tris,Triton X-100购自上海生工生物工程有限公司；甜菜碱、钙黄绿素购自SIGMA公司；FTA膜片购自通用电气医疗公司(GE healthcare) ;EDTA、 硫酸锰为国产分析纯。
[0034]钙黄绿素与锰离子形成的配合物配比为0.05mmol/L钙黄绿素和0.6mmol/L锰离子。
[0035]美人鱼发光杆菌基因组DNA采用商业化的DNA抽提试剂盒(天根的快速DNA提取检测试剂盒KG203)从纯培养的美人鱼发光杆菌菌液中提取。(美人鱼发光杆菌是从患病豹纹鳃棘鲈脾脏、肾脏中提取，经形态学、生化特性分析及以16S rDNA为遗传标记的系统发育分析鉴定为美人鱼发光杆菌)
[0036]本发明可用于检测鱼血液、鱼脾、鱼肾组织是否感染美人鱼发光杆菌，也可用于检测水体中是否含有美人鱼发光杆菌或某菌液是否为美人鱼发光杆菌。
[0037]实施例1
[0038]一种美人鱼发光杆菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID N0.3所示的内引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的内引物下游引物组成。
[0039]实施例2
[0040]一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒，(以检测8个样品的包装为例)包括:
[0041](1)8个盛有样品预处理液的采样管，每管内有100 μ I样品预处理液，样品预处理液的组成为 pH = 8.0 的 20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA,体积浓度为 1.2% TritonX-100，溶剂是蒸馏水；
[0042](2)洗涤管10个，每管内含100 μ I DEPC水
[0043](3)反应管10个，每管含24 μ I LAMP反应液，其组成为:2.5 μ IlOX反应缓冲液、3 μ I浓度为2.5mmol/L的dNTP、I μ I浓度为8U/ μ I的Bst DNA聚合酶；I μ I浓度为5 μ mol/L的由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，I μ I浓度为5 μ mol/L的由SEQ IDN0.2所示的外引物下游引物，I μ I浓度为40 μ mol/L的由SEQ ID N0.3所示的内引物上游引物，I μ I浓度为40 μ mol/L的由SEQ ID N0.4所示的内引物下游引物；4μ 11.6mol/L的甜菜碱；1 μ I钙黄绿素与锰离子形成的配合物、8.5 μ I DEPC水；
[0044](4)阳性对照管I个，内含10 μ I浓度为I μ g/ml的美人鱼发光杆菌基因组DNA的阳性对照液；
[0045](5)无菌封装的FTA膜片、研磨棒若干。
[0046]实施例3
[0047]美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒检测方法的建立(使用实施例2的试剂盒)
[0048](I)模板制备:采用DNA提取试剂盒(天根的快速DNA提取检测试剂盒KG203)提取的纯培养的美人鱼发光杆菌基因组DNA，作为阳性对照液，以纯培养的美人鱼发光杆菌菌液，作为检测样品，测试所建立检测方法的可行性。
[0049]⑵引物设计合成
[0050]采用BLAST软件分析美人鱼发光杆菌基因序列，筛选出美人鱼发光杆菌Photobacterium damseIae subsp.piscicida IGS2 (AJ535849.1)基因的核酸序列，根据LAMP技术引物设计原则，针对该片段设计出LAMP引物并合成，所用引物如下:[0051]SEQ ID N0.1:5’ ACTCTTTCTTAGGATAAGAAAGGT3’
[0052]SEQ ID N0.2:5’ ACCACTTTTTAATAACTCTCAGAG3’
[0053]SEQ ID N0.3:5’ GATCGAACCGCTGACCTCTTCttttAATTTGGGGCTATAGCTCAG3’
[0054]SEQ ID N0.4:5’ ATTTTCTGCACGGATTCGCAggatccTCGACAAAGCGATTCAACG3’
[0055](3)检测过程
[0056]①将FTA膜片在步骤(1)所述的纯培养的美人鱼发光杆菌菌液中充分润湿后室温干燥；另取两片FTA膜片分别在DEPC水、阳性对照液中充分润湿后室温干燥，作为阴性对照膜片和阳性对照膜片；
[0057]②将步骤①获得的膜片分别加入盛有100μ I DEPC水的洗涤管中，震荡洗涤4min ;从洗涤液中取出膜片，分别放入盛有24 μ I LAMP反应液的反应管中，置于65°C条件下保温50min，得到阴性对照、阳性对照和检测液；
[0058]③观察反应管中液体的颜色，阴性对照呈橙色，阳性对照呈绿色，根据检测液颜色判断是否含有美人鱼发光杆菌。结果见图1(图1中I为美人鱼发光杆菌菌液检测结果，反应液呈明显的绿色；2为阳性对照，反应液呈明显的绿色；3为阴性对照，反应液呈橙色)。
[0059](4) LAMP反应条件及优化
[0060]设定反应管中弓丨物混合液外弓丨物与内弓丨物浓度比分别为1: 1、1: 2、1: 4、1: 6、1: 8、1:10、1:12，反应时间从 20min、25min、30min、40min、50min、60min，反应温度为 54°C、57°C、60°C、63°C、65°C、68°C，选择最佳反应参数建立完善的LAMP检测技术。最终确定的反应参数如下:
[0061]外引物与内引物的浓度比为1:8，即外引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N02浓度为5ymol/L，内引物 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 引物浓度为 40 μ mol/L，将反应管置于60_65°C保温40-60min，得到检测液，直接观察检测液颜色，判定反应结果为阳性或者阴性。
[0062]实施例4.美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用
[0063](I)提取待检样品DNA
[0064]在无菌条件下抽取待检鱼血液100 μ 1，加入100 μ I样品预处理液，煮沸后静置IOmin,得到上清液；
[0065](2)将FTA膜片在步骤⑴获得的上清液中充分润湿后室温干燥，另取两片FTA膜片，分别在DEPC水、阳性对照液中充分润湿后室温干燥，作为阴性对照膜片和阳性对照膜片;
[0066](3)将步骤⑵获得的膜片分别加入100 μ I DEPC /K，震荡洗涤4min ;从洗涤液中取出膜片，分别放入盛有24 μ I LAMP反应液的反应管中，置于63°C条件下保温50min，得到阴性对照、阳性对照和检测液；
[0067](4)取出反应管，直接观察反应管内液体颜色呈绿色，判断是含有美人鱼发光杆菌。
[0068]实施例5.美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用
[0069](I)提取待检样品DNA
[0070]在无菌条件下，取一个健康鱼脾lOOmg，一个人工感染美人鱼发光杆菌后发病的鱼脾lOOmg，一个健康鱼肾lOOmg，一个人工感染美人鱼发光杆菌后发病的鱼肾lOOmg，分别用研磨棒研磨，煮沸后静置lOmin，得到上清液；
[0071](2)将4个FTA膜片分别在步骤(1)获得的上清液中充分润湿后室温干燥；另取两片FTA膜片分别在DEPC水、阳性对照液中充分润湿后室温干燥，作为阴性对照膜片和阳性对照膜片； [0072](3)将步骤(2)获得的膜片分别加入100 μ I DEPC水，震荡洗涤3min ;从洗涤液中取出膜片，分别放入盛有24 μ I LAMP反应液的反应管中，置于65°C条件下保温40min，得到阴性对照、阳性对照和检测液；
[0073](4)取出反应管，直接观察反应管内液体颜色，健康鱼脾和鱼肾的反应管呈橙色，人工感染美人鱼发光杆菌后发病的鱼脾和鱼肾的反应管呈绿色，判断后两者是含有美人鱼发光杆菌。(结果见图2。I为阴性对照，呈橙色；2为阳性对照，呈绿色；3为人工感染美人鱼发光杆菌发病后的鱼肾脏研磨液检测结果，呈绿色；4为健康东星斑肾脏研磨液检测结果，呈橙色；5为健康鱼脾脏研磨液检测结果，呈橙色；6为人工感染美人鱼发光杆菌发病后的鱼脾脏研磨液检测结果，呈绿色。
[0074]实施例6.美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用
[0075](I)提取待检样品DNA
[0076]取纯培养的菌液，煮沸后静置lOmin，得到上清液；
[0077](2)将FTA膜片在步骤(1)获得的上清液中充分润湿后室温干燥；另取两片FTA膜片分别在DEPC水、阳性对照液中充分润湿后室温干燥，作为阴性对照膜片和阳性对照膜片;
[0078](3)将步骤⑵获得的膜片加入100 μ I DEPC /K，震荡洗涤5min ;从洗涤液中取出膜片，分别放入盛有24μ I LAMP反应液的反应管中，置于60°C条件下保温60min，得到阴性对照、阳性对照和检测液；
[0079](4)取出反应管，直接观察反应管内液体颜色呈绿色，判断所检样品是含有美人鱼发光杆菌。结果见3。I为阳性对照，呈绿色；2为纯培养的菌液，呈绿色；3为阴性对照，呈橙色。
[0080]实施例7美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的检测灵敏度测定
[0081]将纯培养的美人鱼发光杆菌接入TSB液体培养基中培养24h后，以无菌生理盐水洗涤3次，调整菌液浓度为3X 108cfu/ml，10倍比梯度稀释，取稀释好的菌液按照实施例6所述方法，检测梯度稀释的美人鱼发光杆菌菌液。结果如图4所示，样品I为阴性对照(呈橙色)，2-9作为模板的美人鱼发光杆菌菌液浓度分别为3X lOkfu/ml (呈橙色)、3X102cfu/ml(呈绿色)、3X103cfu/ml(呈绿色)、3X 104cfu/ml (呈绿色)、3X IO5Cfu/ml (呈绿色)、3X 106cfu/ml (呈绿色)、3X 107cfu/ml (呈绿色)、3X 108cfu/ml (呈绿色)。结果显示3X102cfu/ml以上浓度的菌液，均呈现绿色，表明该试剂盒对美人鱼发光杆菌的最低检测浓度为3X102cfu/ml。
[0082]实施例8.美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的检测特异性测试
[0083]分别取纯培养并鉴定后的海豚链球菌、柱状黄杆菌、哈维氏弧菌、维氏气单胞菌、诺卡氏菌、美人鱼发光杆菌菌液，按照实施例6所述方法检测以上样品。检测结果见图5，样品1-8分别为阴性对照(呈橙色)、海豚链球菌(呈橙色)、柱状黄杆菌(呈橙色)、哈维氏弧菌(呈橙色)、维氏气单胞菌(呈橙色)、诺卡氏菌(呈橙色)、美人鱼发光杆菌(呈绿色)、阳性对照(呈绿色)。样品7美人鱼发光杆菌及样品8阳性对照为阳性，阴性对照及其它菌检测结果均为阴性，证实该试剂盒具有较好的检测特异性。
[0084] 本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种美人鱼发光杆菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID N0.3所示的内引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的内引物下游引物组成。
2.一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒，其特征是包括: (1)样品预处理液，其组成为pH= 8.0的20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA,体积浓度为1.2% Triton X-100，溶剂是蒸馏水；
(2)DEPC 水； (3)LAMP反应液，24 μ I LAMP反应液的组成为:2.5 μ IlOX反应缓冲液；3μ I浓度为2.5mmol/L 的 dNTP ; I μ I 浓度为 8U/ μ I 的 Bst DNA 聚合酶；I μ I 浓度为 5 μ mo I/L 的由 SEQID N0.1所示的外引物上游引物，1μ I浓度为5 μ mol/L的由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，1μ I浓度为40ymol/L的由SEQ ID N0.3所示的内引物上游引物，I μ I浓度为40 μ mol/L的由SEQ ID N0.4所示的内引物下游引物；4 μ 11.6mol/L的甜菜碱；1μ I钙黄绿素与锰离子形成的配合物、8.5μ I DEPC水； (4)阳性对照液，所述阳性对照液为1μ g/ml的美人鱼发光杆菌基因组DNA ； (5)无菌封装的FTA膜片、研磨棒若干。
3.权利要求2的一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用，其特征是包括如下步骤: (1)取待检样品组织加入100μ I样品预处理液，研磨棒研磨，煮沸后静置lOmin，得到上清液； (2)将FTA膜片在步骤(1)获得的上清液中充分润湿后室温干燥；另取两片FTA膜片分别在DEPC水、阳性对照液中充分润湿后室温干燥，作为阴性对照膜片和阳性对照膜片； (3)将步骤(2)获得的膜片分别加入100μ I DEPC水，震荡洗涤3~5min ;从洗涤液中取出膜片，分别放入盛有24 μ I LAMP反应液的反应管中，置于60-65°C条件下保温40~60min,得到阴性对照、阳性对照和检测液； (4)阴性对照呈橙色，阳性对照呈绿色，根据检测液颜色判断是否含有美人鱼发光杆菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述待检样品为鱼血液、鱼脾、鱼肾组织或细菌。
【文档编号】C12R1/01GK103981270SQ201410225271
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】徐晓丽, 姚学良, 邵蓬, 张勤, 张振奎 申请人:天津市水产技术推广站