一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法
【专利摘要】本发明公开一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，方法包括：首先将发酵液先加热升温至60℃，杀灭发酵液中的链霉菌活菌体，通过滤布或陶瓷微滤膜除去新奥霉素发酵液中培养基固形物和菌体杂质后，除去固形物的发酵液经大孔吸附树脂吸附处理，然后，用阳离子交换树脂吸附富集大孔吸附树脂流出液中的新奥霉素，最后，采用0.5-5.0％氨水进行解析、浓缩，制成新奥霉素母液，或添加载体，烘干制成粉剂。本发明提供了一种新的低成本制备新型生物农药新奥霉素母药或制剂的方法。
【专利说明】一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物农药制造【技术领域】，具体涉及到一种放线菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法。
【背景技术】
[0002]微生物来源的活性化合物是高效低毒农用抗生素的主要来源，以微生物代谢产物研制开发的抗生素是生物农药的重要组成部分，也是世界农药开发的主要研究方向。
[0003]我国农用抗生素的研究起步较早，早期，我国成功研制了春雷霉素，庆丰霉素，井岗霉素，多抗霉素，公主霉素，多效霉素，农抗120等。近十多年来，一些新的农用抗生素如中生霉素，武夷霉素，宁南霉素、华光霉素、嘧肽霉素等获得开发。目前，我国农用杀菌剂产品除了井R霉素外，进入实用化的还有春雷霉素、农用链霉素、宁南霉素等有限的几种，作为杀菌剂的抗生素类生物农药品种非常少，产业化水平较低，远不能满足市场需求。
[0004]新型核苷二肽类农用抗生素新奥霉素由一株诺尔斯链霉菌的发酵液中分离得到的。具有广谱的抗植物病毒病和细菌病害的活性尤其对革兰氏阳性菌、植物病毒的抑制活性很强。
[0005]在国内多个省、地区进行了小区和大田应用示范等试验，表明对烟草、辣椒、番茄花叶病毒病等具有很强的抗植物病毒病活性，还能够防治水稻白叶枯病、青枯病、软腐病等细菌病害，抗菌作用谱广。新奥霉素制剂毒理学试验结果表明属于微毒。产新奥霉素的链霉菌经多轮诱变选育，已获得了一株有产业化价值的高产菌株，并且，新奥霉素发酵生产技术及放大发酵生产技术已比较成熟。相对链霉菌发酵产物来说，在发酵产物中活性物质新奥霉素的量还是很低的，加之在发酵液中还存在与新奥霉素共存的其它大量杂质和副产物，如微生物细胞、蛋白质、色素、其它细胞代谢产物及末用完的培养基，因此，从发酵液中提取新奥霉素是一个比较复杂的过程。，
[0006]由于微生物发酵产生新奥霉素类的嘧啶核苷二肽的产量一直比较低，因此，近20年来，微生物学家研究的重点主要侧重于与用微生物发酵生产嘧啶核苷二肽类抗生素的方法，有关从微生物发酵液中提取嘧啶核苷二肽类抗生素的工作开展得不多。发明专利ZL200910060121.4公开了涉及微量新奥霉素样品(mg级)的制备技术，包括新奥霉素发酵结束后，通过添加2-4倍发酵液体积的甲醇或乙醇，从上述发酵培养液中收集新奥霉素，再通过正相硅胶层析和反相硅胶层析分离，得到的新奥霉素样品，用高效液相色谱进一步分离纯化，制备得到微量的新奥霉素。该提取技术方法步骤繁琐，耗用大量的有机溶剂，提取周期长，活性损失大，不适合大量新奥霉素的制备。发明专利ZL201110261822.1公开了的硅胶层析三元洗脱体系改变为二元洗脱体系的提取技术方法，并去掉了反相硅胶层析分离和高效液相色谱纯化步骤，具有耗用有机溶剂少等优点，但硅胶柱的再生和使用次数使放大生产受到了一定的限制。目前，非常缺乏从发酵液中提取新奥霉素的发酵工程下游技术。
[0007]为了解决现 有新奥霉素提取技术的不足，在充分进行了新奥霉素发酵产物理化性质研究的基础上，本发明提出了一种新的从链霉菌发酵代谢产物中提取新奥霉素的技术方案。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种链霉菌发酵液中新奥霉素的富集及分离提取方法，建立一种新奥霉素发酵工程下游提取技术，并且容易放大生产，而且分离效果好，产品收率高。
[0009]为达到上述目的，本发明的具体技术方案是:提供一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，该方法包括以下步骤:
[0010](I)将能发酵产生新奥霉素的一株诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)的遗传改良菌株“诺尔斯链霉菌XiAo-3”接种到发酵培养基中进行液体深层培养得到含有新奥霉素的发酵液，首先将发酵液先加热升温至60°C -80°C进行杀菌处理，再用滤布过滤或采用陶瓷微滤膜除去上述发酵液中的培养基固形物和菌体杂质，得到预处理发酵液；
[0011](2)用大孔吸附树脂处理步骤(1)中得到的预处理发酵液得到吸附树脂处理液；
[0012](3)使用阳离子树脂富集分离吸附树脂处理液中的新奥霉素:将步骤(2)得到的吸附树脂处理液均速流过装有大孔阳离子树脂的离子交换柱，控制吸附树脂处理液的流速使吸附树脂处理液与大孔阳离子树脂的接触时间为90min-180min，当交换后流出液中新奥霉素的生物活性单位达到原始发酵液活性单位的5-10%时停止继续进吸附树脂处理液，得到吸附达到饱和的树脂；
[0013](4)解析:将步骤⑶吸附饱和的树脂用洗脱剂进行解析得到解析液；
[0014](5)用硫酸或盐 酸将步骤(4)得到的解析液的pH值调至7后，再浓缩到新奥霉素含量大于12%以上，配制成浓度为8% -12%的新奥霉素农药母液；或再添加载体烘干制成粉剂。
[0015]关于步骤(1)中的菌株诺尔斯链霉菌XiAo-3 (Streptomyces noursei XiAo-3)的保藏信息是:保藏号为CGMCC N0.2898 ;分类命名为:诺尔斯链霉菌(Streptomycesnoursei);于2009年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址是:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
[0016]具体地或优选地，本发明上述一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法中:
[0017]步骤(2)中所述的大孔吸附树脂包括非极性、弱极性和强极性吸附树脂；优选型号如 S-8、D-101、D-101-1、DA-201、HPD-100、X_5、AB-8、DM130、DM-301 中的一种或几种的混合物；更优选D-101或D-101和DM130混合物。其作用是吸附除去预处理发酵液中的一些蛋白质、色素和其它一些会影响下一步交换富集新奥霉素的脂溶性杂质。
[0018]步骤(3)中所述的阳离子交换过程中使用的阳离子树脂包括但不限于是001X7、002X 7、7320、NKC-9、D72、D001、D151、D113中的一种，优选7320磺酸基聚苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂。
[0019]步骤⑷洗脱剂包括但不限于是质量分数为2% HCl溶液、I % NaCl溶液或
0.5-5.0%氨水中的一种，优选3%氨水。洗脱剂的流速控制在每小时1-4倍交换柱的体积。
[0020]步骤(5)中的载体为本领域常规使用的载体，包括但不限于高岭土、蛭石、白炭黑
坐寸ο
[0021]本发明有益效果:[0022]本发明首先针对诺尔斯链霉菌XiAo-3发酵新奥霉素的发酵液含有大量的蛋白质，发现并筛选了用可以重复使用的大孔吸附树脂提取工艺代替了现有技术中存在的添加2-4倍发酵液体积的甲醇或乙醇方法，不能重复使用的硅胶层析提取技术方法，不仅成本高，而且不易于放大生产。避免了在提取过程中大量有几溶剂的使用，减少了对环境的影响；以及在进一步富集发酵液中新奥霉素的工艺中，本发明发现了发酵液经除去了大量蛋白质之后，阳离子交换树脂可以很好的对新奥霉素进行富集，洗脱，而且，阳离子交换树脂工艺很容易进行规模化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明所述的一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法的提取流程图。
【具体实施方式】
[0024]以下所给出的实施例是为进一步说明本发明的技术特征，并非对本发明的技术方案进行限制。对本发明中的技术方案进行的任何修改或局部替换，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0025]实施例1
[0026]将诺尔斯链 霉菌XiAo-3的发酵培养基(甘油1.0%，蔗糖7.0%，硫酸铵0.1%,葡萄糖8.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，硫酸镁0.5%，磷酸二氢钾1.0%，氯化钠
0.5% ,氯化钙0.5%)于121°C灭菌30分，冷却后接种诺尔斯链霉菌XiAo-3种子液，在28°C-30°C温度下，通气搅拌发酵4天。发酵结束后。首先将发酵液先加热升温至60°C，保持30分钟，杀灭发酵液中的链霉菌活菌体，然后将发酵液温度降至30°C以下，加入2.0%硅藻土助滤剂到灭菌后的发酵液中，搅拌均匀，放置20分钟，用600目滤布过滤，收集滤液。
[0027]用大孔吸附树脂吸附处理滤布过滤液。使用的大孔吸附树脂是D-101非极性大孔吸附树脂，吸附除去滤布过滤液中的一些蛋白质、色素和其它一些会影响下一步交换富集新奥霉素的脂溶性杂质，得到吸附树脂处理液；
[0028]使用阳离子树脂富集分离吸附树脂处理液中的新奥霉素。阳离子交换过程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂。将吸附树脂处理液均速流过装有7320阳离子树脂的离子交换柱，控制吸附树脂处理液的流速使吸附树脂处理液与树脂的接触时间为150min。
[0029]吸附饱和后的树脂用3%氨水进行解析，洗脱剂的流速控制在每小时2倍树脂交换柱的体积。
[0030]用盐酸将上面得到的解析液的pH值调至7后，根据解析液的新奥霉素浓度大小，浓缩解析液到一定倍数使新奥霉素的浓度达到12%以上，配制成12%新奥霉素农药母液。
[0031]实施例2
[0032]将诺尔斯链霉菌XiAo-3的发酵培养基(甘油1.0%，蔗糖7.0%，硫酸铵0.1%,葡萄糖8.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，硫酸镁0.5%，磷酸二氢钾1.0%，氯化钠
0.5% ,氯化钙0.5%)于121°C灭菌30分，冷却后接种诺尔斯链霉菌XiAo-3种子液，在28°C-30°C温度下，通气搅拌发酵4天。发酵结束后。首先将发酵液先加热升温至60°C，保持30分钟，杀灭发酵液中的诺尔斯链霉菌活菌体，然后将发酵液温度降至30°C以下，将以上发酵液用陶瓷微滤膜过滤，除去发酵液中的培养基固形物和菌体杂质，分离孔径为
0.2 μ m，其过滤压力为0.1MPa,收集过滤液。
[0033]用大孔吸附树脂吸附处理微滤膜过滤液。使用的大孔吸附树脂是DM-301中极性大孔吸附树脂，吸附除去过滤液中的一些蛋白质、色素和其它一些脂溶性杂质，得到吸附树脂处理液；
[0034]使用阳离子树脂富集分离吸附树脂处理液中的新奥霉素。阳离子交换过程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂。将吸附树脂处理液均速流过装有7320阳离子树脂的离子交换柱，控制吸附树脂处理液的流速使吸附树脂处理液与树脂的接触时间为150min。
[0035]吸附饱和后的树脂用3%氨水进行解析，洗脱剂的流速控制在每小时2倍树脂交换柱的体积。
[0036]用硫酸或盐酸将上面得到的解析液的pH值调至7后，根据解析液的新奥霉素浓度大小，浓缩解析液到一定倍数使新奥霉素的浓度达到12%以上，添加白炭黑载体，烘干制成粉剂。
[0037]实施例3
[0038]除去发酵液中的培养基固形物和菌体杂质的方法同实施例2。处理滤液用大孔吸附树脂处理。使用的大 孔吸附树脂是D-101非极性和DM-301中极性大孔吸附树脂的混合物，得到吸附树脂处理液；
[0039]使用阳离子树脂富集分离吸附树脂处理液中的新奥霉素。阳离子交换过程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂。将吸附树脂处理液均速流过装有7320阳离子树脂的离子交换柱，控制吸附树脂处理液的流速使吸附树脂处理液与树脂的接触时间为150min。
[0040]吸附饱和后的树脂用2%氨水进行解析，洗脱剂的流速控制在每小时I倍树脂交换柱的体积。
[0041]用盐酸将上面得到的解析液的pH值调至7后，根据解析液的新奥霉素浓度大小，浓缩解析液到一定倍数使新奥霉素的浓度达到12%以上，添加高岭土载体，烘干制成粉剂。
【权利要求】
1.一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将能发酵产生新奥霉素的一株诺尔斯链霉菌(Streptomycesnoursei)的遗传改良菌株“诺尔斯链霉菌XiAo-3”接种到发酵培养基中进行液体深层培养得到含有新奥霉素的发酵液，首先将发酵液先加热升温至60°C -80°C进行杀菌处理，再用滤布过滤或采用陶瓷微滤膜除去上述发酵液中的培养基固形物和菌体杂质，得到预处理发酵液； (2)用大孔吸附树脂处理步骤(1)中得到的预处理发酵液得到吸附树脂处理液； (3)使用阳离子树脂富集分离吸附树脂处理液中的新奥霉素:将步骤(2)得到的吸附树脂处理液均速流过装有大孔阳离子树脂的离子交换柱，控制吸附树脂处理液的流速使吸附树脂处理液与大孔阳离子树脂的接触时间为90min-180min，当交换后流出液中新奥霉素的生物活性单位达到原始发酵液活性单位的5-10%时停止继续进吸附树脂处理液，得到吸附达到饱和的树脂； (4)解析:将步骤 (3)吸附饱和的树脂用洗脱剂进行解析得到解析液； (5)用硫酸或盐酸将步骤(4)得到的解析液的pH值调至7后，再浓缩到新奥霉素含量大于12%以上，配制成浓度为8% -12%的新奥霉素农药母液；或再添加载体烘干制成粉剂。
2.根据权利要求1所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂包括非极性、弱极性和强极性吸附树脂。
3.根据权利要求2所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂优选型号为S-8、D-1OU D-101-1、DA-201、HPD-100, X_5、AB-8、DM130、DM-301中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求2或3所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂优选为D-101或D-101和DM130混合物。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的阳离子交换过程中使用的阳离子树脂包括001X7、002X7、7320、NKC-9、D72、D001、D151、D113 中的一种。
6.根据权利要求5中所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的阳离子交换过程中使用的阳离子树脂优选是7320磺酸基聚苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤(4)中洗脱剂包括质量分数为2% HCl溶液、I % NaCl溶液或0.5-5.0%氨水中的一种。
8.根据权利要求7所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤⑷中洗脱剂优选为3%氨水。
9.根据权利要求7或8所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤⑷中洗脱剂的流速控制在每小时1-4倍交换柱的体积。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，其特征在于，步骤(5)中的载体为本领域常规使用的载体，包括但不限于高岭土、蛭石、白炭黑。
【文档编号】C12R1/57GK103965275SQ201410225218
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】周金燕, 杨杰, 钟娟, 谭红 申请人:中国科学院成都生物研究所