血清Exosomes来源的长链非编码RNA PRKAG2-AS1的应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种血清外泌体(Exosomes)来源的长链非编码RNA(long?no-coding?RNA，LncRNA)PRKAG2-AS1的应用方法，即血清Exosomes来源的LncRNA?PRKAG2-AS1用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂。通过研究证实在胶质瘤患者血清中分离Exosomes后提取RNA，逆转录并进行实时荧光定量分析发现LncRNA?PRKAG2-AS1表达水平下降。利用本发明的制剂对胶质瘤早期诊断的特异性可达85.7％，灵敏度达到88.2％。通过检测胶质瘤患者血清Exosomes中LncRNA?PRKAG2-AS1的表达水平，从而对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。
【专利说明】血清Exosomes来源的长链非编码RNA PRKAG2-AS1的应用
方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及血清Exosomes来源的LncRNAPRKAG2-AS1在制备胶质瘤患者预后试剂中应用方法。
【背景技术】 [0002]胶质瘤约占颅内肿瘤的40.49%。脑肿瘤中胶质细胞瘤发病率最高，大脑半球发生的胶质瘤约占全部胶质瘤的51.4%。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边界不清，即使是最现代的神经外科技术也难以做到病理学上的全切除，因而胶质瘤术后复发率非常高，且随着手术和复发次数的增加，其恶性程度有增加的趋势。目前而言胶质瘤的诊断和治疗方法虽处于不断改进阶段，但是胶质瘤患者生存率并没有明显提高。胶质瘤诊断仍然处于以临床、病理学和影像学信息为基础的经验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为中晚期，远远不能适应对胶质瘤进行高危人群筛查和早期诊断的需求。因此，寻找无创伤性的胶质瘤早期诊断标志物对高危人群进行筛查，以便对胶质瘤患者进行早期诊断、早期治疗，提高患者生存率，一直是神经科学领域研究的主要任务。
[0003]Exosomes来源于多囊泡体，是由活细胞分泌而来的大小介于30_100nm的含有RNA、脂质和蛋白质的微囊泡。Exosomes广泛存在于血清，尿液，细胞培养上清，唾液等各种体液中，可在体液中来回穿梭，在细胞之间运送遗传物质和蛋白质。研究发现，在顺钼诱导急性肾损伤的大鼠模型的尿液Exosome中发现Fetuin-A表达上调，由此尿液Exosome中Fetuin-A的检测可作为诊断标志物；在膀胱癌患者尿液来源的Exosomes中还发现了PCA-3, TMPRSS2两个生物标志物；在黑色素瘤患者血浆Exosomes中肿瘤相关标志物CAVl表达水平明显增加，以此可诊断黑色素瘤；肿瘤细胞来源的Exosomes中miRNA的表达谱可作为卵巢癌的诊断标记物。因此Exosomes可用于肿瘤的早期诊断，也可作为靶向药物的载体进行疾病治疗。Exosomes具有在血清中稳定存在的特性，含有特异性的物质且可保护RNA免受RNA酶的作用，克服了直接利用血液提取分子进行肿瘤诊断的血液中非检测物质的影响，使检验结果更加真实，精确。利用Exosomes来源的LncRNA PRKAG2-AS1来诊断脑胶质瘤不仅减少了患者的痛苦和不便，而且提高了检验结果的灵敏性，特异性。以上显示出血清Exosomes来源的LncRNA PRKA G2-AS1在胶质瘤早期诊断和筛查中的巨大潜力。
[0004]LncRNA PRKAG2-AS1(protein kinase, AMP-activated, gamma2non-catalyticsubu nit)定位于染色体7q36.1，GeneBank登录号:NR_038926。有研究证实PRKAG2可在TP53的信号通路中发挥作用，并且PRKAG2与癌症患者的存活率密切相关。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种血清Exosomes来源的LncRNA PRKAG2-AS1的应用方法，尤其是一种能够用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂的应用方法。研究证实血清Exosomes来源的LncRNA PRKAG2-AS1可用于胶质瘤患者的诊断，Exosomes来源的LncRNA PRKAG2-AS1表达下调与胶质瘤组织验证结果具有一致性，且检验结果的灵敏性高，特异性好。因此Exosomes可用于胶质瘤高危人群的筛查和早期诊断和预后。
[0006]血清Exosomes来源的长链非编码RNA PRKAG2-ASI的应用方法，所述的血清Exosomes来源的长链非编码RNA PRKAG2-AS1用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA PRKAG2-AS1的序列见SEQ NO:1。
[0007]所述的用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂具体包括实时荧光定量PCR检测试剂。
[0008]所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物:
[0009]LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5，-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3，，
[0010]LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5，-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3，。
[0011]所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒，
[0012]该试剂盒包括:(I)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA PRKAG2-AS1逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA PRKAG2-AS1所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNAPRKAG2-AS1实时荧光定 量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；
[0013]LncRNA PRKAG2-AS1实时荧光定量PCR特异性引物:
[0014]正向引物:5’-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’，
[0015]反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。
[0016]U6snRNA内参特异性PCR引物:
[0017]正向引物为5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0018]反向引物为5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0019] 申请人:通过癌症基因图集TCGA数据库分析发现Lnc RNA PRKAG2-AS1在正常人与胶质母细胞瘤中的表达存在明显差异(P = 0.0156)(图1)。通过荧光定量分析发现Lnc RNA PRKAG2-AS1在52例胶质瘤组织与12例正常人的脑组织中存在差异性表达(P =
0.0005)(图2),且在胶质瘤组织中表达下调,进一步在血清中分离Exosomes用于LncRNAPRKAG2-ASI的检测，发现LncRNA PRKAG2-ASI的表达与正常人的表达存在明显的差异(P = 0.0306)(图3)，且与组织中的检测结果相一致。此方法可以检测各人群中LncRNAPRKAG2-AS1的表达水平，从而预测胶质瘤的患病风险，筛查易感人群，并对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。本发明对胶质瘤早期诊断特异性好(图4)，可达85.7%，灵敏度可达88.2%，只需在Exosomes提取RNA即可检测LncRNA PRKAG2-AS1的表达水平，操作简单，稳定性好。不仅可用于胶质瘤的早期诊断而且可以用于胶质瘤患者的大规模筛查和患病风险的预测，为胶质瘤的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为癌症基因图集TCGA数据库中LncRNA PRKAG2-AS1在胶质母细胞瘤与正常脑组织中的表达差异；
[0021 ] 图2为实时荧光定量PCR分析LncRNA PRKAG2-AS1在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达差异；
[0022]图3为实时荧光定量PCR分析Exosomes来源的LncRNA PRKAG2-AS1在胶质瘤患者与正常人中的表达差异；
[0023]图4为Roc分析Exosomes来源的LncRNA PRKAG2-AS1对胶质瘤早期诊断的特异性，灵敏性。
【具体实施方式】
[0024]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0025]实施例1制备长链非编码RNA PRKAG2-AS1用于胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)
[0026]1.RNA 稳定溶液 50ml
[0027]2.异丙醇 100mL
[0028]3.三氯甲烷 100mL
[0029]4.Trizol 50ml [0030]5.无酶水 IOml
[0031]6.1 μ M随机逆转录引物50ul
[0032]7.5 X逆转录缓冲液200ml
[0033]8.1OmM三磷酸碱基脱氧核苷酸IOOul
[0034]9.40U/ μ I RNA 酶抑制剂 500ul
[0035]10.200U/ μ I MMLV 逆转录酶 50ul
[0036]11.Premix Ex Taq 50ul
[0037]12.10 μ M LncRNA PRKAG2-AS1 实时荧光定量 PCR 特异性引物 30ul
[0038]LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5，-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3，，
[0039]LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5，-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3，；
[0040]13.10 μ M U6SnRNA 特异性引物 3Oul
[0041]正向引物为5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'
[0042]反向引物为5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0043]实施例2
[0044]LncRNA PRKAG2-AS1在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达差异的验证
[0045]1、收集待测胶质瘤组织放入盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至_80°C冰箱备用。
[0046]2、组织中RNA的抽提:取适量标本于经180°C烘烤6_8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml Trizol研钵标本,研磨成液体状后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震荡15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g离心15min ;小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀,_20°C冰箱静置20min，4°C 12000g离心10min ;弃上清，加入75% DEPC水稀释的乙醇l_2ml混匀，40C 7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，0D260/280比值在1.8-2.0之间，_80°C保存。[0047]3、LncRNA PRKAG2-AS1逆转录:使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20 μ L逆转录
反应的体系如下:
[0048]
【权利要求】
1.血清Exosomes来源的长链非编码RNAPRKAG2-AS1的应用方法，其特征在于，所述的血清Exosomes来源的长链非编码RNA PRKAG2-AS1用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA PRKAG2-AS1的序列见SEQ NO:1。
2.根据权利要求1所述的长链非编码RNAPRKAG2-AS1的应用方法，其特征在于，所述的用于制备胶质瘤高危人群的筛查、早期诊断或者胶质瘤患者的预后制剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。
3.根据权利要求2所述的长链非编码RNAPRKAG2-AS1的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物:
LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5’ -CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’， LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。
4.根据权利要求3所述的长链非编码RNAPRKAG2-AS1的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒， 该试剂盒包括:(I)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA PRKAG2-AS1逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA PRKAG2-ASI所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNAPRKAG2-ASl实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水； LncRNA PRKAG2-AS1实时荧光定量PCR特异性引物: LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5’-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’， LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。 U6snRNA内参特异性PCR引物: 正向引物为 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向引物为 5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
【文档编号】C12Q1/68GK103966337SQ201410225037
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】武明花, 刘长红, 余志斌, 徐刚, 李桂源 申请人:中南大学