用于检测肺炎支原体23S rRNA突变的特异性引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明涉及引物和探针技术，旨在提供一种用于检测肺炎支原体23S?rRNA突变的特异性引物和探针。本发明中用于检测肺炎支原体23S?rRNA2617位点C:A突变的引物具体包括：上游引物MPF，其序列如SEQ?NO.1所示；下游引物MPR，其序列如SEQ?NO.2所示。本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，说明其灵敏度良好。引物和探针对不含沙眼衣原体的样本没有检测信号，说明其特异性强，避免假阴性和假阳性结果的出现。通过利用本发明提供的引物和探针进行荧光PCR处理，操作简便、检测迅速、检出率高，与传统分离培养检测技术相比，提高了检出效率、降低了漏检率。能对多种临床样本进行高效可靠的筛查，对临床病情进行监测，指导合理用药。
【专利说明】用于检测肺炎支原体23S rRNA突变的特异性引物和探针
【技术领域】
[0001]本发明涉及引物和探针技术，特别涉及一种用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的特异性引物和探针。
【背景技术】
[0002]肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)是介于细菌与病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞型生物。能在体外生存而不依靠活细胞，能够自我复制。主要通过呼吸道传播，儿童和青年人易感，一般为散发或小流行，一年四季均可发病，多在秋季暴发，流行趋势为每3-7年在全球流行，在人群密集处如学校发病率高，在家庭成员中易相互传染。从近年来流行的报道可以看出MP肺炎发病率有上升趋势，占各类肺炎总数的8.5% -27.9%，而且在小年龄儿童呼吸道感染中也较常见，MP对人类健康的威胁已不容忽视。重症肺炎支原体肺炎表现为大量胸腔积液、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺纤维化、阻塞性细支气管炎等，而且常常伴随肺外表现，如脑炎、心肌炎、肝炎、肾炎等，严重威胁儿童的身心健康，甚至危及生命，早期诊断和治疗显得非常重要。MP缺乏细胞壁这一结构特点，使其对影响细胞壁合成的抗生素具有本质耐药性。临床治疗MP感染主要选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物，如大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类。由于儿童处于生长发育期，能够用于治疗儿童MP感染的药物选择更少，目前首选大环内酯类药物，主要为14元环的红霉素和15元环的阿奇霉素。而四环素类、氨基糖苷类和喹诺酮类由于副作用的原因，已极少用于儿科临床。随着大环内酯类抗生素的广泛使用，已有越来越多关于MP对大环内酯类抗生素耐药的报道。我们在临床上也常发现大环内酯类药物治疗无效的病例，这些病例经大环内酯类抗生素治疗后，体温不降，咳嗽和肺部炎症无好转，易合并胸腔积液和肺不张，需要调整药物治疗。细菌药物研究较早，有了很多发现。但由于MP生长缓慢、培养周期长和需要特殊培养基，体外分离培养比较困难，以往MP感染的诊断多依赖血清学检查，因此药物敏感性研究报道较少。
[0003]目前，临床上对肺炎支原体耐药性的检查，主要是依靠肺炎支原体的分离及药敏实验，由于肺炎支 原体分离较为困难，所以灵敏度较低，而且耗时耗力，不利于及时指导用药。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的引物和探针。
[0005]为解决技术问题，本发明的解决方案是:
[0006]提供一种用于检测肺炎支原体23S rRNA突变的特异性引物，该引物是用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的引物，具体包括:
[0007]上游引物MPF，其序列为 SEQ N0.1:5’ CGTGAGTTGGGTTCAA3’ ；
[0008]下游引物MPR，其序列为 SEQ N0.2:5’ CTTCGGTCCTCTCGTA3’。[0009]本发明还提供了用于检测肺炎支原体23S rRNA突变的特异性探针，该探针是用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的探针2617P，其序列为SEQ N0.3:5，FAMACAGGTTGGTCACTATCTATTG BHQ13’。
[0010]本发明进一步提供了检测肺炎支原体23S rRNA突变的方法，是利用前述的引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，通过PCR实现靶核酸序列片断的扩增；所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸；在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号能够被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在；具体的判断依据为:
[0011]如果待检样本中含有发生2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度能够达到1000拷贝/mL ;如果待检样本中没有2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号。
[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0013]1、本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，说明其灵敏度良好。
[0014]2、本发明提供的引物和探针对不含2617位点C:A突变的肺炎支原体的样本没有检测信号，说明其特异性强。
[0015]3、由于本发明是针对2617C:A突变位点，进行了程序和体系优化，避免了假阴性和假阳性结果的出现。
[0016]4、通过利用本发明提供的引物和探针进行荧光PCR处理，通过一次试验即可明确是否有耐药肺炎支原体的感染，操作简便、检测迅速、检出率高，有利于对疾病进行及时诊断及合理选择治疗方案。与传统分离培养检测技术相比，提高了检出效率、降低了漏检率。可对多种临床样本进行高效可靠的筛查，以及对临床病情和用药效果进行监测，指导合理用药。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为利用引物对MPF/MPR和探针2617P检测肺炎支原体23SrRNA2617位点C:A突变阳性样本的荧光PCR扩增图。
[0018]图中曲线I为肺炎支原体2617C:A突变阳性样本扩增曲线；曲线2为内标扩增曲线。
【具体实施方式】
[0019]PCR技术是20世纪分子生物学的重大发现，可以迅速获取大量的单一核酸片段，使人们能通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍，具有操作简便易行、检测周期短和灵敏度高等优点，所以近年来该方法得到了发展。本发明利用特异性的引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，通过PCR实现靶核酸序列片断的扩增；所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸；在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收；在？0?扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号能够被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在；具体的判断依据为:
[0020]如果待检样本中含有发生2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度能够达到1000拷贝/mL ;如果待检样本中没有2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号。
[0021]本发明的具体实现方式如下:
[0022]1.引物和探针的设计:通过分别对所有已知的肺炎支原体23SrDNA序列进行比较分析，选择2617位点所在区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。最优引物探针序列组合如下:
[0023]上游引物MPF:5’ CGTGAGTTGGGTTCAA3’ (SEQ N0.1)
[0024]下游引物MPR: 5 ’ CTTCGGTCCTCTCGTA3 ’ (SEQ N0.2)
[0025]探针2617P:5’ FAM ACAGGTTGGTCACTATCTATTG BHQl3’ (SEQ N0.3)。
[0026]2.反应体系的优化:利用临床分离的肺炎支原体灭活液作为待检样品，用磁珠裂解法抽提肺炎支原体核酸，分装后贮存于一 80°C。
[0027]2.1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将肺炎支原体引物浓度分别从0.1 μ mol/L至1.6 μ mol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是0.2ymol/L。
[0028]2.2探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将肺炎支原体突变检测用探针浓度分别从0.1 μ mol/L至0.5 μ mol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.16 μ mol/L。
[0029]利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的肺炎支原体23SrRNA2617位点C:A突变的实时荧光PCR反应体系为25 μ L。按照荧光定量PCR试剂盒说明进行反应液的配置。
[0030]3.仪器检测通道的选择
[0031]选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。
[0032]4.PCR反应条件如下
[0033]500C 2min 进行 UNG 酶反应；95°C 3min, I 个循环；94°C 10s，62°C 40s,40 个循环，在62°C 40s阶段收集荧光。
[0034]5.检测结果分析
[0035]如果待检样本中含有发生2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，如果待检样本中没有2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阴性 扩增曲线，即无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。
【权利要求】
1.用于检测肺炎支原体23SrRNA突变的特异性引物，其特征在于，该引物是用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的引物，具体包括: 上游引物 MPF，其序列为 SEQ N0.1:5’ CGTGAGTTGGGTTCAA3’ ； 下游引物 MPR，其序列为 SEQ N0.2:5’ CTTCGGTCCTCTCGTA3’。
2.用于检测肺炎支原体23SrRNA突变的特异性探针，其特征在于，该探针是用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的探针2617P，两端分别是标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡 核苷酸；其序列为:
SEQ N0.3:5’ FAM ACAGGTTGGTCACTATCTATTG BHQ13’。
3.—种检测肺炎支原体23S rRNA突变的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针，采用实时荧光定量PCR技术，通过PCR实现靶核酸序列片断的扩增；所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸；在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号能够被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在；具体的判断依据为: 如果待检样本中含有发生2617位点C: A突变的肺炎支原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度能够达到1000拷贝/mL ;如果待检样本中没有2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号。
【文档编号】C12N15/11GK103993087SQ201410225038
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月25日 优先权日:2014年5月25日
【发明者】耿红, 王越, 沈亦红, 杨晓鹤, 虞华 申请人:浙江省医疗器械研究所