人泡沫病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了人泡沫病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建和应用。抑制HIV-1复制的shRNA为shRNA1、2或3，它们都包含19nt的siRNA正义链（SEQIDNO.1、3、5），9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号。这些shRNA能够特异性地抑制HIV-1NL4-3基因的表达。通过构建表达上述shRNA的人泡沫病毒载体和Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本发明的shRNA可有效稳定地抑制HIV-1NL4-3基因的表达，展示了人泡沫病毒作为表达载体介导的siRNA在艾滋病治疗中的应用前景，为艾滋病治疗研究提供了实验依据。
【专利说明】人泡沬病毒载体介导的抑制HIV-1复制的shRNA的构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和生物医药【技术领域】，具体涉及人泡沫病毒载体介导的抑制Hiv-1复制的shRNA的构建和应用。
【背景技术】
[0002]人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus,HIV)俗称艾滋病(Acquiredimmune deficiency syndrome,AIDS)病毒,诱发人类获得性免疫缺陷综合征。该病毒在分类上属逆转录病毒科慢病毒属中的灵长类免疫缺陷病毒亚属。HIV感染一直是公众健康的重大威胁。目前的抗HIV治疗药物不能对疾病进行彻底的治疗，而且患者还需要终身服药。因此，更多的研究开始转变以往的治疗思路，探寻更加有效更加经济的治疗办法。
[0003]RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是近几年发展起来的可用于各种病毒治疗的新方法。目前已有很多研究报道了通过对HIV保守基因进行RNA干扰，进而达到抑制HIV病毒复制的目的。RNAi也称为依赖于RNA的基因沉默机制，是指通过双链RNA特异性地抑制与其序列同源的靶基因mRNA表达的现象。
[0004]由于HIV-1的高突变率，其在RNAi靶点序列的碱基突变可显著降低或解除RNAi的抑制效果。因此寻找保守的靶基因至关重要。HIV-1的长末端重复序列(long terminalrepeat, LTR)含有病毒复制所必需的重要调控因子，在病毒表达调控中起到了重要作用。因此选择HIV-1LTR区作为RNAi的靶序列。RNAi可以用化学合成的成熟的siRNA (smallinterfering RNA,小干扰RNA)去瞬时转染细胞,但在体内半衰期很短,短时间内降解，而且在动物中不适用。通过表达shRNA (short hairpin RNA,短发夹RNA)的病毒载体整合进入细胞进行长期稳定表达是RNAi的首选。
[0005]泡沫病毒(Foamy virus, FV),也称合胞体病毒,是逆转录病毒的重要成员。因其感染细胞后可诱导产生类似泡沫的大量空泡、多核细胞而得名，至今仍未能发现其与人类的某种疾病存在着相互关联。病毒载体有许多优点，如转染效率高、整合准确，可将外源基因转移入人体的许多不同类型的细胞等，但也存在着令人不安的难题，其中最主要为潜在的致癌可能性。而泡沫病毒载体的安全性则更高，同时它有着广泛的宿主范围，且可携带大片段外源基因。
[0006]人泡沫病毒(Human foamy virus, HFV,也称为原型泡沫病毒(Prototype foamyvirus, PFV))缺失载体(ΔΦ)缺失了原病毒基因组gag、pol、env、bell-3附属基因和LTR U3区，但是保留了一个必须的2.5kb长的顺式作用区。另外，终止密码子被引入到保留的gag序列 去阻止病毒多肽的表达，进一步消除Gag-Pol融合蛋白的反面影响。同时，还有三种单独的辅助载体质粒(pCiGS、pCiPS、pCiES)来分别表达Gag，Pol, Env蛋白，四种质粒瞬时共转染可以产生正常的人泡沫病毒载体原液(Trobridge G, JosephsonN, Vassilopoulos Gj Mac J，Russell DW.1mproved foamy virus vectors with minimalviral sequences.Mol Therj 2002, 6(3):321-8)0
【发明内容】
[0007]本发明的目的首要目的在于提供一种抑制HIV-1复制的siRNA。
[0008]本发明的另一目的在于提供含有上述siRNA抑制HIV-1复制的shRNA。
[0009]本发明的再一目的在于提供含有上述shRNA抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体及构建方法。
[0010]本发明的目的还在于提供上述siRNA、shRNA或人泡沫病毒表达载体的应用。
[0011]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0012]一种抑制 HIV-1 复制的 siRNA，为 siRNAl、siRNA2 或 siRNA3 ;其中，
[0013]siRNAl 的正义链为:5’ -GCATCCGGAGTACTACAAA-3’，
[0014]siRNAl 的反义链为:5’-TTTGTAGTACTCCGGATGC-3’ ；
[0015]siRNA2 的正义链为:5’ -GCCCTCAGATGCTACATAT-3’，
[0016]siRNA2 的反义链为:5’-ATATGTAGCATCTGAGGGC-3’ ；
[0017]siRNA3 的正义链为:5’ -GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3’，
[0018]siRNA3 的反 义链为:5’ -TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3’。
[0019]一种抑制HIV-1复制的shRNA，为shRNAl、shRNA2或shRNA3，它们都包含19nt的siRNA 正义链，9nt 的 loop 环，19nt 的 siRNA 反义链和终止信号；shRNAl、shRNA2、shRNA3的siRNA正义链和siRNA反义链分别为siRNAl、siRNA2、siRNA3的正义链和反义链；所述的loop环的碱基序列为TTCAAGAGA ;所述的终止信号的碱基序列为TTTTT。
[0020]一种抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体，为能表达shRNAl、shRNA2或shRNA3的 ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρ Δ Φ-Η1_8?ιΚΝΑ2 或 ρ Λ Φ-Hl-shRNASo
[0021]所述的抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体的构建方法包括如下步骤:
[0022](I)将 shRNAl、shRNA2、shRNA3 分别克隆到 shRNA 表达载体 pSUPER 上得至IjpSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER_shRNA3。
[0023](2)分别以 pSUPER-shRNAl、pSUPER_shRNA2、pSUPER_shRNA3 进行 PCR 扩增，引物为:
[0024]上游引物P1: 5 ’ -AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3，，
[0025]下游引物P2:5 ’ -GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3 ’。
[0026](3)通过KpnI和BamHI将⑵扩增的产物克隆到人泡沫病毒载体ρ Λ Φ上得到ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρΔ Φ-Η1_8?ιΚΝΑ2 或 ρΛ Φ-Hl-shRNASo 其中，人泡沫病毒载体 ρΔ Φ通过下列文献中阐述的材料方法制备得到(Trobridge G, Josephson N, VassilopoulosG, Mac J, Russell Dff.1mproved foamy virus vectors with minimal viral sequences.Mol Ther, 2002，6(3):321-8 ；
[0027]Trobridge GD,RusselI Dff.Helper-Free Foamy Virus Vectors.Hum GeneTher, 1998，9(17):2517-25)。
[0028]通过Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本发明人泡沫病毒介导的siRNA对HIV-1NL4_3有明显的抑制作用，能明显抑制Hiv-lgag、pol、env基因的mRNA表达水平，能够显著降低HIV-lp24蛋白的表达水平，且无细胞毒性。
[0029]基于本发明研究，上述抑制HIV-1复制的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表达载体可用于制备治疗艾滋病的药物。
[0030]一种治疗艾滋病的药物，包含上述抑制HIV-1复制的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表达载体。
[0031]本发明提供了能够抑制HIV-1复制siRNA、shRNA，成功构建了无细胞毒性、能抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体，为艾滋病治疗及预防研究提供实验依据及理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是shRNA转录生成siRNA的示意图；该shRNA包含19nt的siRNA正义链,9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和TTTTT终止信号，将其插入pSUPER载体Hl启动子下，就能有效表达出所需的siRNA。
[0033]图2是将shRNA表达载体质粒或pSUPER空载体分别与pNL4_3.Luc.R-E-、pRL_TK共转染293T细胞，48小时后Luciferase (荧光素酶实验)检测shRNA对HIV_1NM_3基因抑制水平的分析图；与空载体对照组比较，*#P〈0.005。
[0034]图3是抑制HIV-1复制的shRNA的人泡沫病毒表达载体ρ Δ Φ-Hl-shRNA的构建示意图；将含有Hl启动子的shRNA基因片段克隆入人泡沫病毒载体ρΛ Φ中得到人泡沫病毒表达载体；图中，CMV(cytomegalovirus,巨细胞病毒)是一种组成型启动子，能够控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度。
[0035]图4是辅助载体质粒pCiGS、pCiPS、pCiES的示意图;图中，Gag、Pol、Env分别是泡沫病毒的衣壳蛋白，逆转录酶和病毒糖蛋白；CMV(cytomegalovirus,巨细胞病毒)是一种组成型启动子，能够控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度；SpA(Simianvirus40poly adenylation signal, SV40poly (A))猿猴空泡病毒40多聚腺苷酸序列，对上游基因的转录水平起调控作用。
[0036]图5是将人泡沫病毒表达载体和辅助载体质粒及pNL4-3.Luc.R-E-, pRL-TK共转染293T细胞48h后，Luciferase (荧光素酶实验)检测人泡沫病毒载体介导的shRNA对HIV-1NL4_3基因抑制水平的分析图；与空载体对照组比较，*#P〈0.005。
[0037] 图6是将人泡沫病毒载体介导的shRNA和辅助载体质粒及pNL4_3.Luc.R-E-共转染293T细胞48h后，qPCR检测细胞培养基中HIV-1gag(A)、pol (B)、env (C)基因mRNA水平的分析图；与未转染shRNA的对照组比较，*P〈0.05，#P〈0.01。
[0038]图7是将人泡沫病毒载体介导的shRNA和辅助载体质粒及pNL4_3-Luc共转染293T细胞48h后，ELISA(酶联免疫吸附试验)检测胞内HIV_lp24蛋白表达水平的分析图；与空载体对照组比较，**P<0.01，*#P〈0.005。
[0039]图8是将人泡沫病毒载体介导的shRNA和辅助载体质粒及pNL4_3.Luc.R-E-共转染293T细胞48h后，LDH(乳酸脱氢酶实验)分析图，表明人泡沫病毒载体介导的shRNA不会产生细胞毒性；与空载体对照组比较，p>0.05,无显著性差异(non significant, ns)。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0041]实施例1由shRNA转录生成siRNA的策略[0042]shRNA转录生成siRNA的示意图如图1所示。设计的寡核苷酸链每条均为60nt, 5’端和3’端分别包含BglII和HindIII酶切位点，便于与pSUPER载体连接。5’端19nt的序列(siRNA正义链)与靶基因同源，另一端19nt的序列(siRNA反义链)与其反向互补，其间由9nt的TTCAAGAGA间隔序列形成环状结构，末端加有转录终止信号TTTTT。具有上述结构特征的寡核苷酸链经退火、磷酸化后形成双链DNA，然后定向插入经相同酶切的pSUPER载体Hl启动子下。具有上述结构的pSUPER载体能转录生成shRNA，后者经Dicer酶切后成为siRNA而发挥抑制基因表达的功能。
[0043]实施例2针对HIV-1基因干涉位点的选择与寡核苷酸的设计
[0044]根据shRNA的设计原则，以HIV-1 (GenBank编号:AF324493) LTR基因序列作为siRNA的祀序列，设计了 3条shRNA oligo,设计的shRNA序列进行BLAST (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/)同源分析证实为HIV-1特异序列。设计得到的shRNA及其革巴向HIV-1nl4_3的位点如表1所示。
[0045]表1.shRNA序列及其靶向HIV_1NM_3的位点
【权利要求】
1.一种抑制HIV-1复制的siRNA，其特征在于:所述的抑制HIV-1复制的siRNA为siRNAl、siRNA2 或 siRNA3 ;其中， siRNAl 的正义链为:5’ -GCATCCGGAGTACTACAAA-3’， siRNAl 的反义链为:5’ -TTTGTAGTACTCCGGATGC-3’ ； siRNA2 的正义链为:5’ -GCCCTCAGATGCTACATAT-3’， siRNA2 的反义链为:5’ -ATATGTAGCATCTGAGGGC-3’ ； siRNA3 的正义链为:5’ -GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3’， siRNA3 的反义链为:5’ -TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3’。
2.一种抑制HIV-1复制的shRNA，其特征在于:所述的抑制HIV-1复制的shRNA为shRNAl、shRNA2 或 shRNA3，它们都包含 19nt 的 siRNA 正义链，9nt 的 loop 环，19nt 的siRNA反义链和终止信号；shRNAl、shRNA2、shRNA3的siRNA正义链和siRNA反义链分别为权利要求1中siRNAl、siRNA2、siRNA3的正义链和反义链；所述的loop环的碱基序列为TTCAAGAGA ;所述的终止信号的碱基序列为TTTTT。
3.一种抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体，其特征在于:所述的抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体为能表达权利要求2中shRNAl、shRNA2或shRNA3的人泡沫病毒表达载体。
4.权利要求3种所述的抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将权利要求2中的shRNAl、shRNA2、shRNA3分别克隆到shRNA表达载体pSUPER上得到 pSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3 ； (2)分别以pSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3 进行 PCR 扩增，引物为: 上游引物 Pl:5’ -AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3’，
下游引物 P2:5’ -GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3’ ； (3)通过KpnI和BamHI将(2)扩增的产物克隆到人泡沫病毒载体ρΛ Φ上得到抑制HIV-1复制的人泡沫病毒表达载体ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρ Δ (D-Hl-shRNA2或ρΔ Φ-Hl-shRNASo
5.权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA或权利要求3所述的人泡沫病毒表达载体在制备治疗艾滋病的药物中的应用。
6.一种治疗艾滋病的药物，其特征在于:包含权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA或权利要求3所述的人泡沫病毒表达载体。
【文档编号】C12N15/113GK103966219SQ201410225029
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】刘万红, 何小华, 彭碧文, 程青青, 董兰兰, 李治, 孙燕 申请人:武汉大学