TaNAC2蛋白及其编码基因的应用的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种TaNAC2蛋白及其编码基因的应用，TaNAC2基因可以促进植物对氮的吸收利用。本发明公开的一种提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步骤：将SEQ?ID?No.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率提高。本发明具有如下优点：1、TaNAC2基因作为硝态氮响应的调控因子调控小麦氮素吸收利用途径上的一系列基因的表达，这对阐明植物氮素代谢利用的机理研究将有极大的推动作用。2、通过基因工程技术提高TaNAC2的表达量能够提高氮素同化效率，从而达到少施肥多产出的目的等。【专利说明】TaNAC2蛋白及其编码基因的应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种转录调控因子及其编码基因的应用；特别涉及TaNAC2蛋白及其编码基因在调控植物氮素吸收利用中的应用，属于生物【
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背景技术：
】[0002]小麦是我国重要的粮食作物。无论是栽培面积还是总产量，我国都是世界上最大的小麦生产国。在新中国建立初期，中国的小麦单产很低，1952年只有0.73吨/公顷(48.8公斤/亩)，到2006年达到4.55吨/公顷(303.3公斤/亩)，增加了5.2倍，其中一个重要原因就是化肥用量的增加。据统计，化肥对农业增产的贡献占32%，占农业生产成本的25%,占全部农业生产物质费用的50%。目前我国年氮肥用量超过24Mt(纯氮)，占全世界年氮肥消耗量的30%以上(Juetal.，2004)。然而在我国氮肥利用率较低，只有30-35%(发达国家45%)，有多达45-50%的氮肥未被农作物吸收利用而损失进入环境，导致资源浪费和环境污染(ZhuandChen，2002)。在我国耕地面积持续减少的情况下，仍需依靠增施化肥来促进小麦等农作物增产以满足日益增长粮食需求。因此，利用生物学手段提高小麦吸收利用氮素的效率对保证我国粮食安全和农业可持续发展具有十分重大的战略意义。[0003]植物对氮的吸收利用包括两个过程:氮素的吸收转运和氮素的同化，这其中涉及到的基因在模式植物拟南芥中研究的最清楚。植物对硝酸根的吸收靠两套硝酸根转运系统:高亲和性硝酸根转运蛋白和低亲和性硝酸根转运蛋白。硝酸根浓度较低时高亲和性转运蛋白起作用，AtNRT2.1和AtNRT2是最早克隆到的高亲和性硝酸根转运基因(FilleurandDaniel-Vedele,1999；Zhuoetal.，1999),根据同源搜索,又发现了这个家族的另外五个基因(Initiative.，2000)。硝酸根浓度较高时低亲和性转运蛋白起作用，AtNRTl.1(CHLl)是在抗氯酸盐(硝酸盐类似物)的突变体中克隆出来的(Tsayetal.，1993)。硝酸根进入植物体后要经过硝酸根还原酶(NR)和亚硝酸根还原酶(NiR)的作用还原为铵态氮(NH4+)，在谷氨酰胺合成酶GS、谷氨酸脱氢酶GDH的作用下，进入氨基酸代谢途径。研究表明超量表达GS、G0GAT和⑶H，可以明显提高农作物氮素同化效率和产量(Amezianeetal.2000；Habashetal.2001；MifIinandHabash2002)。[0004]以上研究只是停留在单个功能基因层面，氮、磷吸收同化的调控是交叉网络式的，涉及光合作用、能量代谢等过程，单凭通路中某个基因的超量表达往往难以提高植物的养分利用效率。Dof是一类植物特有的转录因子，最近的研究表明:将拟南芥中的Dofl基因超量表达，可以显著提高(~30%)拟南芥中的氮净含量和耐受缺氮的能力(Yanagisawaetal.，2004)。其原理是Dofl可以调控碳素同化过程中的关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸激酶(PK)等高表达，提高碳代谢途径，积累合成氨基酸所需要的碳骨架，因此增加了蛋白质的含量。因此，寻找新的调控植物氮磷响应的调控因子，不仅可以进一步理解植物适应氮磷胁迫的基因调控网络，而且还可为养分高效农作物新品种培育提供新的基因资源。[0005]NAC转录因子是植物特有的转录调控因子。自1996年从矮牵牛(Petuniahybrida)中克隆得到植物中第一个NAC转录因子以来，目前已在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、小麦、大豆(Glycinemax)等物种中相继发现。拟南芥中至少包含107个NAC基因(Riechmannetal.，2000)，水稻中含有140个(Fangetal.，2008)。在NAC转录因子中，最主要的结构特点是各成员的N端含有高度保守的NAC结构域。NAC结构域大约由160个氨基酸残基组成，可分为1、I1、II1、IV和V共5个亚结构域(Ookaetal.,2003),可能负责与DNA和其它蛋白结合(Ernstetal.，2004)。NAC蛋白的C端保守性较低，具有转录激活功能(Renetal.，2000；Xieetal.，2000；Duvaletal.，2002)。研究表明，NAC类蛋白参与了种子的萌发(Kimetal.，2008)、细胞次生壁的合成(Kuboetal.，2005；Koetal.，2007)、器官边界和分生组织的形成(Aidaetal.,1997；Takadaetal.,2001；Vroemenetal.,2003；Maoetal.,2007)、开花(Kimetal.,2007)、衰老(GuoandGan,2006；Yoonetal.,2008；Uauyetal.,2006)等多个植物生长发育过程。NAC类蛋白还在植物的生物胁迫如病害过程中发挥着重要作用(CollingeandBoiler,2001；Jensenetal.,2007；Buetal.,2008)。目前已发现多个NAC蛋白参与植物对逆境的响应。来自水稻的SNAC1/2(stress-responsiveNAC2)基因受到干旱、高盐、低温、伤以及ABA的诱导表达，其过表达植株耐冷、抗盐并能抵御干旱等(Huetal.，2008)，将小麦中的TaNAC2超表达在拟南芥中也能够提高拟南芥对非生物胁迫的耐受力(Maoetal.，2012)。NAC蛋白中中国春小麦的TaNAC2基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示，TaNAC2蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.4所示。综上，NAC类蛋白作为一类重要的转录因子，在调控植物生长发育过程和多种植物逆境防御反应方面发挥着重要作用，然而关于NAC类蛋白在提高植物养分吸收尤其是调控硝酸根吸收速率方面的研究却鲜有报道。【
发明内容】[0006]本发明的目的是提供一种TaNAC2蛋白及其编码基因的应用，TaNAC2蛋白及其编码基因可以促进植物对氮的吸收利用。[0007]本发明提供一种提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步骤JfSEQIDN0.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率提高。[0008]上述方法中，所述编码基因是通过重组载体导入的，所述重组载体是将所述编码基因替换改造后的PACH25的⑶S基因序列得到的，具体是将SEQIDN0.3所示的DNA分子插入改造后的PACH25的BamHI和KpnI酶切位点间，替换改造后的pACH25的⑶S基因序列得到的；[0009]所述改造后的pACH25是将Ubiquitin启动子插入pACH25载体的PstI酶切位点间得到；[0010]所述将SEQIDN0.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物的方法为基因枪介导转化的方法；[0011]所述编码基因的核苷酸序列具体如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。[0012]上述任一所述的方法中，所述植物为小麦。[0013]如下任一所述的物质在提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率中的应用也属于本发明的保护范围:[0014](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0015](2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；[0016](3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。[0017]如下任一所述的物质在促进植物生长、发育和/或产籽中的应用也属于本发明的保护范围:[0018](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0019](2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；[0020](3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。[0021]如下任一所述的物质在促进植物根生长中的应用也属于本发明的保护范围:[0022](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0023](2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；[0024](3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。[0025]如下任一所述的物质在促进植物主根长增长和/或侧根数增加中的应用也属于本发明的保护范围:[0026](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0027](2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；[0028](3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。[0029]如下任一所述的物质在提高植物硝酸根吸收速率中的应用也属于本发明的保护范围:[0030](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0031](2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；[0032](3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。[0033]如下任一所述的物质在提高植物分蘖数或地上部分干重，或提高植物单株籽粒产量，或提高植物植株中氮含量，或提高植物籽粒中氮浓度中的应用也属于本发明的保护范围:[0034](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0035](2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；[0036](3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。[0037]上述任一所述的应用中，所述植物为小麦；[0038]所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。[0039]本发明具有如下优点:[0040]1、虽然目前已经克隆到了一些氮素吸收、同化、转运等过程的关键基因，但植物氮素吸收利用的调控是交叉网络式的，单个功能基因不足以阐明其调控网络，而本发明克隆的TaNAC2基因作为硝态氮响应的调控因子调控小麦氮素吸收利用途径上的一系列基因的表达，这对阐明植物氮素代谢利用的机理研究将有极大的推动作用。[0041]2、TaNAC2基因可以促进小麦提高硝酸根吸收速率、单株籽粒产量、植株总氮含量、籽粒氮浓度以及氮素收获指数，说明通过基因工程技术提高TaNAC2的表达量能够提高氮素同化效率，从而达到少施肥多产出的目的。[0042]3、TaNAC2基因不仅影响氮素吸收利用，超表达该基因还增加了小麦的侧根数目和最长根长，该基因的功能研究对于植物水肥高效利用的研究意义深远。【专利附图】【附图说明】[0043]图1为pACH25/TaNAC2载体示意图。[0044]图2为转基因植株的DNA水平鉴定。[0045]图3为转基因植株的RNA水平鉴定。[0046]图4为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下根系表型。[0047]图5为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下根的硝酸根吸收速率。[0048]图6为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下分蘖数。[0049]图7为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下苗期的地上部干重。[0050]图8为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下单株籽粒产量。[0051]图9为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下苗期总氮含量测定。[0052]图10为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下籽粒氮浓度。[0053]图11为转基因植株与野生型植株在高、低氮培养条件下氮素收获指数。【具体实施方式】[0054]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0055]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0056]中国春小麦(TriticumaestivumL.,“ChineseSpring”)在文献“BrenchleyR,SpannaglM,PfeiferM,etal.AnalysisofthebreadwheatgenomeusingwhoIe-genomeshotgunsequencing[J].Nature,2012,491(7426):705-710.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。[0057]KODplusDNA聚合酶购自Τ0Υ0Β0公司。[0058]10XPCRbufferforKODplus购自TOYOBO公司。[0059]pACH25载体在文献“ChristensenAH,QuailPH,1996,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicRes5:213-218,”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，改造后的PACH25载体是将Ubiquitin启动子插入pACH25载体的PstI酶切位点间得到。[0060]小麦陇春23在文献“袁俊秀,杨文雄,丰产广适优质春小麦新品种-陇春23号,麦类作物学报，2009,29(4):740”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。[0061]实施例中氮素浓度分别为2mM和0.2mM的高氮营养液和低氮营养液的配方如表1所示。[0062]表1高氮营养液和低氮营养液的配方【权利要求】1.一种提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步骤^fSEQIDN0.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率提高。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述编码基因是通过重组载体导入的，所述重组载体是将所述编码基因替换改造后的PACH25的GUS基因序列得到的，具体是将SEQIDN0.3所示的DNA分子插入改造后的pACH25的BamHI和KpnI酶切位点间，替换改造后的pACH25的⑶S基因序列得到的；所述改造后的PACH25是将Ubiquitin启动子插入pACH25载体的PstI酶切位点间得到；所述将SEQIDN0.4所示的蛋白的编码基因导入出发植物的方法为基因枪介导转化的方法；所述编码基因的核苷酸序列具体如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述植物为小麦。4.如下任一所述的物质在提高植物氮素的吸收转运和/或氮素的同化效率中的应用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.如下任一所述的物质在促进植物生长、发育和/或产籽中的应用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。6.如下任一所述的物质在促进植物根生长中的应用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。7.如下任一所述的物质在促进植物主根长增长和/或侧根数增加中的应用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。8.如下任一所述的物质在提高植物硝酸根吸收速率中的应用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。9.如下任一所述的物质在提高植物分蘖数或地上部分干重，或提高植物单株籽粒产量，或提高植物植株中氮含量，或提高植物籽粒中氮浓度中的应用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的编码基因；(3)含有(2)所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。10.根据权利要求4-9任一所述的应用，其特征在于:所述植物为小麦；所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。【文档编号】C12N15/29GK104004769SQ201410224957【公开日】2014年8月27日申请日期:2014年5月26日优先权日:2014年5月26日【发明者】童依平,何雪,赵学强,曲宝原,马文英,李文静,洪霞,史计,李滨,李振声申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所