一株高产甘油的酿酒酵母及其在干白葡萄酒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株高产甘油的酿酒酵母及其在干白葡萄酒中的应用，菌株代号为JF-7，菌株26SrDNAD1/D2区Genbank登录号为KJ685388，现保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.8870；以其为发酵酵母，常规法酿造具有高甘油含量、口感肥硕的干白葡萄酒，酒中的甘油含量高达8.5g/L，比常用酿酒酵母菌株酿造的干白葡萄酒提高40%以上，提高了干白葡萄酒中的甘油含量，口感肥硕圆润，从而提升了干白葡萄酒的质量。
【专利说明】一株高产甘油的酿酒酵母及其在干白葡萄酒中的应用
[0001]【技术领域】:
本发明涉及工业微生物【技术领域】，具体地讲是一株高产甘油的酿酒酵母及其在干白葡萄酒中的应用。
[0002]【背景技术】:
在葡萄酒发酵过程中，甘油的主要功能是维持酵母细胞内NAD+/NADH的平衡，对发酵启动具有重要作用，还是发酵过程中渗透压力的代谢调节物质。甘油在葡萄酒中的感官阈值为5.2 g/L，当其浓度超过此值时会赋予葡萄酒甜味。甘油的黏性和甜味可使葡萄酒具有圆润、柔滑、甘甜、肥硕和更易入口的特性。甘油也可平衡酒中的酸感，增加口感复杂性，是高品质葡萄酒的重要成分；但现有的葡萄酒中甘油含量较低，从而影响产品的口感和品质。
[0003]不同葡萄酒酵母菌株间3-磷酸甘油脱氢酶活性的不同导致甘油生成量差异很大，因此在葡萄酒发酵过程中除了改善发酵工艺(如发酵温度，pH，溶氧，等)来提高葡萄酒中甘油产量外，通过筛选高产甘油的菌株作为酒精发酵的主导菌株是提高葡萄酒质量的重要途径。在众多葡萄酒酿造酵母的相关专利(如，一种玫瑰香葡萄酒专用酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用，CN101701195B ;—种用于风干葡萄酒的酵母及筛选方法，CN102649940A)中，未见高产甘油的酿造酵母专利。
[0004]
【发明内容】
:
本发明的目的是克 服上述已有技术的不足，而提供一株高产甘油的酿酒酵母。
[0005]本发明的另一目的提供一株高产甘油的酿酒酵母在干白葡萄酒中的应用。
[0006]本发明主要解决现有葡萄酒中甘油含量低而影响产品口感和质量的问题。
[0007]本发明的技术方案是:一株高产甘油的酿酒酵母，菌株代号为JF-7,该菌株已于2014年2月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址:北京市朝阳区大屯路3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC N0.8870，建议分类命名为:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0008]本发明的高产甘油的酿酒酵母，其形态特征；菌落为奶油色稍带绿色，球形凸出，表面光滑，不透明，为酿酒酵母的显著特征。
[0009]本发明一株高产甘油的酿酒酵母，是从霞多丽葡萄品种中得到的，筛选过程是:采摘成熟霞多丽葡萄，破碎后分汁分装无菌容器中进行自然发酵3-5d ;取Iml发酵葡萄汁经逐级稀释后涂布筛选培养基上，所用的筛选培养基为:葡萄糖10-40 g/L，甘油20-30 g/L,蛋白胨 10-20 g/L，酵母粉 5-15 g/L, Na2HPO4 2-6 g/L, KH2PO4 2-6 g/L，MgS04 1.2-5 g/L，氯霉素0.1-0.4 g/L, pH 6.5-8 ;在25_32°C下培养3d ;选取有典型酵母菌菌落特征的单菌落，重复划线分离多次，获得纯培养并甘油管保藏(_20°C)；
将分离的酵母菌株采用改进的YEH)培养基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)进行液体培养，发酵5d采用高效液相色谱法(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，SN/T 2544-2010)测定甘油含量，挑取高产甘油菌株；选育的菌株进行发酵产气试验、耐受SO2能力试验、耐受酒精能力试验、耐受高糖浓度试验、耐受酸能力试验，获得高产甘油且适用葡萄酒酿造工艺的一株酿酒酵母JF-7 ;菌株JF-7经26S rDNA D1/D2区序列测定，确定为酿酒酵母(Saccharomyces cere vi si ae )。
[0010]本发明采用的发酵产气性能试验，具体过程为:采用杜氏管发酵法，将IOml改进的YEH)培养基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)加入含有杜氏管的试管中，灭菌冷却后接入酵母菌，在28下。C培养，按照杜氏管充满气体的时间判定产气能力大小。
[0011]本发明中的酵母菌耐受能力试验，具体为:采用杜氏管发酵法，将IOml改进的YEPD培养基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)加入含有杜氏管的试管中，添加无水乙醇、苹果酸、葡萄糖和SO2至不同浓度，其中无水乙醇和SO2为灭菌后添加，苹果酸和葡萄糖为灭菌前添加。接入酵母菌，在28下。C培养，按照杜氏管充满气体的时间判定产气能力大小。
[0012]采用上述的高产甘油的酿酒酵母JF-7为发酵酵母生产干白葡萄酒的方法，以破碎除梗压榨后的葡萄汁为原料，采用JF-7为发酵剂，控温15-20°C发酵，经IOd后发酵醪残糖< 4g/L后发酵结束，测定相关指标，并与商品化酿酒酵母进行对比；本发明的干白葡萄酒产品具有较高甘油含量，香气浓郁且有别于商品化酵母发酵产品。
[0013]本发明所述的一株高产甘油的酿酒酵母及其在干白葡萄酒中的应用与已有技术相比具有突出的实质性特点和显著进步，本发明通过选择性筛选方法，分离出一株高产甘油的酿酒酵母，从而能够在干白葡萄酒的发酵生产中依靠酵母菌自身产生甘油，生产的干白葡萄酒中的甘油含量高达8.5 g/L，比常用酿酒酵母菌株酿造的干白葡萄酒提高40%以上，口感肥硕圆润，香气浓郁，对于提升干白葡萄酒的产品质量具有积极作用。
[0014]具体实 施方式:
为了更好地理解与实施，下面结合实施例详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。
[0015]实施例1:采摘中国山东蓬莱地区的成熟霞多丽葡萄，破碎后分汁分装无菌容器中进行自然发酵4d ;取Iml发酵葡萄汁经逐级稀释后涂布筛选培养基上，所用的筛选培养基为:葡萄糖 10 g/L，甘油 30 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母粉 5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, KH2PO4 2 g/L，MgS04 1.2 g/L，氯霉素0.1 g/L, pH 6.5，在28°C下培养3d ;选取有典型酵母菌菌落特征的单菌落，重复划线分离多次，获得纯培养并甘油管保藏(_20°C );将分离的酵母菌株采用改进的YEH)培养基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)进行液体培养，装液量200ml/500ml瓶，在28°C下静置发酵5d，采用高效液相色谱法测定甘油含量，获得高产甘油的酵母菌株一株，即酿酒酵母JF-7，甘油产量为14.8 g/L。
[0016]将上述的酿酒酵母JF-7用于干白葡萄酒酿制，以破碎除梗压榨后的霞多丽葡萄汁为原料，采用酿酒酵母JF-7为发酵剂，控温15-20°C发酵，经IOd后发酵醪残糖< 4g/L后发酵结束，干白产品具有较高甘油含量，香气浓郁。
[0017]1、实施例1的筛选酵母的菌属鉴定:
将保存的酵母菌株划线接种于WLN培养基中，置于28°C下培养5d后观察；菌落为奶油色稍带绿色，球形凸出，表面光滑，不透明，为酿酒酵母的显著特征。
[0018]上述采用的WLN培养基如下:称取酵母粉4 g，蛋白胨5 g，葡萄糖50 g，加储液A40 ml，加储液B I ml，琼脂粉20 g，加热融化后冷却室温调pH至5.5 ;将上述培养基组分在121°C下灭菌15min后，冷却至不60°C左右，趁热在超净工作台中加入1ml储液C ;储液A:磷酸二氢钾5.5 g，氯化钾4.25 g，氯化钙1.25 g，硫酸镁1.25 g，定容至400 ml，在4°C冰箱保存；储液B:氯化铁0.25 g，硫酸锰0.25 g，定容至100 ml，在4°C冰箱保存；储液C:溴甲酚绿0.44 g溶于IOml水和IOml无水乙醇中。
[0019]2、确认菌株JF-7为酿酒酵母:
提取菌株DNA，进行PCR，PCR产物电泳条带，切割所需DNA目的条带，纯化测序。以NL1-5' GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3 '和 NL4-5 ' GGTCCGTGTTTCAAGACGG3 '通用引物，PCR 循环条件:94°C预变性 4min，94°C 45 秒，52°C lmin,72°C Imin 循环 30 次，72°C 10 min修复延伸，40C终止反应。将测序结果与NCBI数据库中的已有序列进行比对，确认菌株JF-7为酿酒酵母cereFisiaeO,其 Genbank 登录号为 KJ685388。
[0020]测序结果如下: GCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAAT
CTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACA
GGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGT
TTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTA
CAGTGATGGAAAGATGAAAAGAA CTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTG
ATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTT
GGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGAC
TGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCT。
[0021 ] 3、酿酒酵母JF-7的发酵特性:
采用改进的YEro培养基(葡萄糖220 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉5g/L)作为初始培养基，杜氏管法考察发酵特性。其中酒精耐受力测定中乙醇终浓度分别为10%、13%、16%、19%，酸度耐受力测定中苹果酸终浓度分别为5g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L, SO2耐受力测定中终浓度分别为60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，耐受高糖能力测定中葡萄糖终浓度分别为220g/L、300g/L、400g/L、500g/L，并与商品化酿酒酵母 CY3079 和 R-HST (CY3079 和 R-HST为国内干白葡萄酒常用菌株)做对照。
[0022]结果表明，本发明的菌株JF-7与商品化酿酒酵母相比具有优良的发酵特性，所有测试条件下均能够正常启动发酵，其中经统计分析比对酒精耐受和SO2耐受能力处于同一水平上，而耐受酒精和高葡糖糖浓度下菌株JF-7的起酵特性总体优于商品化酵母。故酿酒酵母JF-7具备酿造高品质葡萄酒潜力。
[0023]4、高产甘油的酿酒酵母JF-7发酵生产霞多丽干白葡萄酒:
(1)所用菌种:高产甘油的酿酒酵母JF-7、商品化进口活性酿酒酵母CY3079和R-HST；
(2)酿酒酵母菌种制备:挑取斜面保藏菌种一环，接入装有200ml菌种制备培养基的500ml三角烧瓶中，置于28°C下培养48h。菌种制备培养基:葡萄糖220 g，蛋白胨20 g，酵母粉10g，加水至1000ml，pH自然，115°C下灭菌20min。活化种子液采用冷冻离心机在8000r/min和4°C下离心5min收集菌体,离心完毕后菌体用无菌水重悬浮,洗漆离心2次,收集囷体备用；
(3)酿造干白葡萄酒:成熟的霞多丽酿酒葡萄榨汁破碎收集葡萄汁，将葡萄汁初始糖浓度调整至200 g/L (含糖量较低时用蔗糖补充)，装入IOL玻璃容器中，装液量为容器体积的3/4。按照种子培养液体积的5%接入离心洗涤后的菌体，控温15-20°C下发酵10天，定期测定CO2失重、残糖量和酒精度。发酵完毕后用葡萄酒分析仪测定发酵参数指标，同时采用高效液相色谱法测定甘油含量；
将JF-7、CY3079和R-HST按照上面所述条件，进行干白葡萄酒发酵对比试验，结果见表I ;由表1看出，酿酒酵母JF-7具有良好发酵特性，与商品化酵母相比，发酵后产品的酒精度与总酸基本处于同一水平，但残糖量较低且甘油含量较高，达8.5g/L。
[0024]表1发酵参数指标
【权利要求】
1.一株高产甘油的酿酒酵母，菌株代号为JF-7，菌株26S rDNA D1/D2区Genbank登录号为KJ685388，现保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC N0.8870。
2.权利要求1所述的酿酒酵母在干白葡萄酒中酿制中的应用，以权利要求1所述的高产甘油的酿酒酵母JF-7为发酵酵母，常规法酿造具有高甘油含量、口感肥硕的的干白葡萄酒。
【文档编号】C12R1/865GK104017740SQ201410228616
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】李记明, 程仕伟, 韩鹏, 姜文广, 于英, 沈志毅 申请人:烟台张裕集团有限公司