循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
【专利摘要】本发明公开了一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒以及方法，所述鉴定试剂盒包括有检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA的检测探针；所述上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。本发明所述鉴定方法采用多重RNA探针，能够同时标记多种循环肿瘤细胞(CTCs)特异性基因，并将其分型为I型(上皮型)、II型(上皮-间质混合型)及III型(间质型)，降低CTCs在进入外周血循环的过程中因缺失部分CTCs特异性基因而导致的假阳性结果。本发明鉴定方法能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度。
【专利说明】循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒以及方法。
【背景技术】
[0002]循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)为进入人体外周血的肿瘤细胞，可能是肿瘤远处转移的一种标志。近年来研究表明，肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM, Epithelial-mesenchymal Transit1n), EMT 过程中，除了细胞形态和移动性发生改变外，细胞基因表达谱特别是上皮、间质分子标志物及其转录因子的表达也发生改变，发生EMT的肿瘤细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强，脱离原发灶后进入血液形成循环肿瘤细胞。目前，根据CTCs抗原标志物的差异，可将CTCs分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)和间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)等。最新研究表明，间质标志物阳性表型的CTM具有最强的转移潜能。
[0003]目前，多数CTCs检测方法都是以肿瘤细胞表面的上皮细胞标志物为靶点，如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhes1n molecule, EPCAM),用相应的抗体捕获CTCs,以细胞表达CKs作为主要诊断依据，这类方法涉及的EPCAM和CKs都具有上皮细胞特异性。其中，代表性检测方法是目前唯一通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch系统。由于外周血中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，以及采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些CTCs由于发生EMT丢失了上皮抗原而无法被检测到，从而导致假阳性和假阴性的检测结果，此外，免疫 磁性分选(MACS)技术联合逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法也是常用的CTC分离与鉴定的技术，但是RT-PCR过程对环境和操作的要求高，且mRNA容易降解，无法进行CTC细胞分型等缺点，因此，急需一种能够准确检测CTCs的技术，实现CTCs的的鉴定与精确分型的新技术。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供一种能分型、灵敏度高的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。
[0005]实现上述目的的技术方案如下。
[0006]一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，包括有检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA的检测探针；所述上皮细胞标志基因选自:EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自:CDH2、VMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。
[0007]在其中一个实施例中，还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针,所述白细胞标志基因为CD45，使用白细胞标志基因，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰。
[0008]在其中一个实施例中,所述检测探针包括:[0009](I)针对每个标志基因的捕获探针:所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为:与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
[0010](2)针对每个标志基因的扩增探针:每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
[0011]在其中一个实施例中，所述检测探针包括:
[0012](I)针对每个标志基因的捕获探针:所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列PU间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的特异性序列P3互补配对的P2序列，所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
[0013](2)针对每个标志基因的扩增探针:每条扩增探针的喊基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，所述P4序列为不存在发夹结构，探针内 部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
[0014](3)针对每种种类的标记探针:所述标记探针具有与扩增探针P4互补配对的序列P5，且末端修饰有荧光基团；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
[0015]本发明的另一目的在于提供一种循环肿瘤细胞鉴定方法。
[0016]实现上述目的的技术方案如下。
[0017]一种循环肿瘤细胞鉴定方法，主要包括以下步骤:
[0018](I)得到去除红细胞后的生物体液样本；
[0019](2)过滤，在滤膜上富集循环肿瘤细胞，通过透化处理，消化细胞，使mRNA暴露；
[0020](3)检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，所述上皮细胞标志基因选自:EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自:CDH2、VMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。
[0021]在其中一个实施例中，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤:
[0022](3.1)每种标志基因的捕获探针的特异性序列Pl与对因的目标mRNA序列特异性结合；每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
[0023](3.2)捕获探针的P2序列与带有荧光基团标记的扩增探针的P3序列结合，从而实现目标mRNA信号的放大；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与PU P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
[0024](3.3)通过荧光检测仪检测。
[0025]在其中一个实施例中，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤:
[0026](3.1)每种标志基因的捕获探针特异性序列Pl与对应的目标mRNA序列结合；每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列PU间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
[0027](3.2)捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4分别为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
[0028](3.3)所述扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；
[0029](3.4)通过荧光检测仪检测。
[0030]在其中一个实施例中，针对EPCAM基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.1~SEQID N0.10中的2条或2条以上，针对KRT16基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.11~SEQID N0.20中的2条或2条以上，针对KRT8基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.21~SEQID N0.30中的2条或2条以上，针对KRT18基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.31~SEQID N0.40中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.41~SEQID N0.50中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQID N0.101 ;针对上皮细胞标志基因的P3序列为SEQ ID N0.104 ;针对上皮种类标志基因的P4 序列为 SEQ ID N0.107。
[0031]在其中一个实施例中，针对⑶H2基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.51~SEQID N0.60中的2条或2条以上，针对VMENTIN基因特异性序列Pl选自SEQ ID N0.61~SEQID N0.70中的2条或2条以上，针对FNl基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.71~SEQ IDN0.80中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.81~SEQ IDN0.90中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ IDN0.102 ;针对间质细胞标志基因的P3序列为SEQ ID N0.105，针对间质细胞标志基因的P4序列为 SEQ ID N0.108。
[0032]在其中一个实施例中，还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针,所述白细胞标志基因为CD45，针对CD45基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.91~SEQ ID N0.100中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID N0.103，针对白细胞标志种类基因的P3序列为SEQ ID N0.106，针对白细胞标志基因的P4序列为SEQID N0.109。
[0033]在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5 — 10个T。[0034]在其中一个实施例中，所述荧光基团选自:FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA, ROX,Texas RedaC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor488，且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
[0035]本发明的主要优点在于:
[0036](I)本发明所选择的上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。本发明标志基因的选取，除了能实现单个标志基因的检测外，更与其它标志基因一起使用，从而能够最全面地检测出循环肿瘤细胞，并区分其细胞类型，解决了循环肿瘤细胞个体之间由于某些标志基因表达水平的差异而造成假阴性，极大地提高检测的灵敏度。
[0037](2)本发明所述鉴定试剂盒和方法采用多重RNA探针，能够同时标记多种CTCs特异性基因，并将其分型为I型(上皮型)、π型(上皮-间质混合型)及III型(间质型)，降低CTCs在进入外周血循环的过程中因缺失部分CTCs特异性基因而导致的假阳性结果。
[0038](3)RNA原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的RNA原位杂交方法，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏 度。
[0039](4)本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
[0040](5)本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1是本发明阳性CTC鉴定结果示意图；
[0042]图2是本发明阳性CTC分型结果示意图；
[0043]图3是实施例4的比较上皮型CTCs的信号标记效果的示意图。
【具体实施方式】
[0044]为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0045]除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的【技术领域】的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0046]实施例1
[0047]本实施例所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，有两种类型，具有标记探针的与不具有标记探针。[0048]其中，具有标记探针的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒A，主要包括有:
[0049]一、捕获探针
[0050]捕获探针由三部分组成，5’端至3’依次是与对应的标志基因的mRNA互补配对的序列P1，间隔臂序列，与对应的扩增探针特异性序列P3互补配对的P2序列，同一类别的标志基因其捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5 - 10个T，本实施例优选为5个T。每个标志基因分别设计10条捕获探针，以提高检测的特异性。(使用时，针对每种目标基因，选择2条或3条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例6)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的标志基因的捕获探针见表1、不同类型的标志基因的捕获探针的P2序列见表2。
[0051]表1目标基因捕获探针的Pl序列
【权利要求】
1.一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，包括有检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA的检测探针；所述上皮细胞标志基因选自:EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自:CDH2、VIMENTIN,FNUAKT2中的一个或一个以上。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，还包括有白细胞标志基因mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为⑶45。
3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述检测探针包括: (1)针对每个标志基因的捕获探针:所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针,每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为:与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列PU间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序 列； (2)针对每个标志基因的扩增探针:每条扩增探针的喊基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与PU P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述检测探针包括: (1)针对每个标志基因的捕获探针:所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针,每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为:与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列PU间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的特异性序列P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列； (2)针对每个标志基因的扩增探针:每条扩增探针的喊基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列； (3)针对每种细胞种类的标记探针:所述标记探针具有与扩增探针P4互补配对的序列P5，且末端修饰有荧光基团；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
5.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于:针对EPCAM基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.10中的2条或2条以上，针对KRT16基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.11~SEQ ID N0.20中的2条或2条以上，针对KRT8基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30中的2条或2条以上，针对KRT18基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.31~SEQ ID N0.40中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.41~SEQ ID N0.50中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID N0.101、P3序列为SEQ ID N0.104、P4序列为 SEQ ID N0.107。
6.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于:针对CDH2基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.51~SEQ ID N0.60中的2条或2条以上，针对VMENTIN基因特异性序列Pl选自SEQ ID N0.61~SEQ ID N0.70中的2条或2条以上，针对FNl基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.71~SEQ ID N0.80中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.81~SEQ ID N0.90中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID N0.102、P3序列为SEQ ID N0.105、P4序列为SEQ ID N0.108。
7.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于:还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为⑶45，针对⑶45基因mRNA的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.91~SEQ ID N0.100中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因mRNA的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID N0.103、P3序列为SEQ ID N0.106、P4序列为SEQ ID N0.109。
8.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于:所述间隔臂序列为5 — 10个T。
9.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于:所述荧光基团选自:FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA, ROX, Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705 和 AlexaFluor488，且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
10.一种循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，主要包括以下步骤: (1)得到去除红 细胞后的生物体液样本； (2)过滤，在滤膜上富集循环肿瘤细胞，通过透化处理，消化细胞，使mRNA暴露； (3)检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，所述上皮细胞标志基因选自:EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自:CDH2、VMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。
11.根据权利要求10所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在,包括以下步骤: (3.1)每种标志基因的捕获探针的特异性序列Pl与对应的目标mRNA序列特异性结合；每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列PU间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列； (3.2)捕获探针的P2序列与带有荧光基团标记的扩增探针的P3序列结合，从而实现目标mRNA信号的放大；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与PU P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列； (3.3)通过荧光检测仪检测。
12.根据权利要求10所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在,包括以下步骤: (3.1)每种标志基因的捕获探针特异性序列Pl与对应的目标mRNA序列结合；每条捕获探针的喊基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列； (3.2)捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为:能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4分别为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列； (3.3)所述扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同； (3.4)通过荧光检测仪检测。
13.根据权利要求11或12所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于:针对EPCAM基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.10中的2条或2条以上，针对KRT16基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.11~SEQ ID N0.20中的2条或2条以上，针对KRT8基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30中的2条或2条以上，针对KRT18基因特异性序列Pl的选自SEQID N0.31~SEQ ID N0.40中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列Pl的选自SEQ ID N0.41~SEQ ID N0.50中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID N0.101、P3序列为SEQ ID N0.104、P4序列为 SEQ ID N0.107 ;和 / 或 针对CDH2基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.51~SEQ ID N0.60中的2条或2条以上，针对VMENTIN基因特异性序列Pl选自SEQ ID N0.61~SEQ ID N0.70中的2条或2条以上，针对FNl基因的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.71~SEQ ID N0.80中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异 性序列Pl选自SEQ ID N0.81~SEQ ID N0.90中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID N0.102、P3序列为SEQ IDN0.105、P4 序列为 SEQ ID N0.108 ;和 / 或 还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为CD45，针对CD45基因mRNA的特异性序列Pl选自SEQ ID N0.91~SEQ ID N0.100中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因mRNA的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID N0.103、P3序列为SEQ IDN0.106、P4 序列为 SEQ ID N0.109。
14.根据权利要求11或12所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于:所述间隔臂序列为5 — 10个T。
15.根据权利要求11或12所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于:所述荧光基团选自:FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA, ROX, Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705 和 AlexaFluor488，且不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
【文档编号】C12Q1/04GK104031993SQ201410228511
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】许嘉森, 吴诗扬, 刘苏燕, 刘志明, 胡文晖 申请人:益善生物技术股份有限公司