融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法及其使用的蛋白片断的制作方法

融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法及其使用的蛋白片断的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特征在于：为一种Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白；或为一种T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白。本发明还通过尝试在离子通道蛋白及运输蛋白的N-末端、C-末端或膜内环区插入BRIL，和T4L等融合蛋白片段构建融合蛋白表达质粒，从而改进其体外稳定性及可结晶性。成功得到稳定性好，表达量高，并可结晶的离子通道及运输蛋白。
【专利说明】融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法及其使用的蛋白 片断

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种融合表达离子通道蛋白及 运输蛋白的方法及其使用的蛋白片断。

【背景技术】
[0002] 离子通道蛋白（Ion channel)是一种成孔蛋白，它通过允许某种特定类型的离子 依靠电化学梯度穿过该通道，来帮助细胞建立和控制质膜间的微弱电压压差。这些离子通 道存在于所有细胞的细胞膜上。离子通道按离子分可以分为氯离子通道族，钾离子通道族， 钠离子通道族，钙离子通道族，质子通道族和泛离子通道族
[0003] 运输蛋白（transport protein)，能选择性地使非自由扩散的小分子物质透过质 膜。运输蛋白能够使不溶于脂的绝大多数代谢上重要的分子和无机离子，可以有效地进出 活细胞，而且有精细的控制机制，使其在细胞内外达到适度的浓度梯度，形成一定的膜电位 差。运输蛋白根据作用方式分成三类：载体蛋白（carrier protein)、通道蛋白（channel protein)、离子泵（ion pump)。
[0004] 由于电压激活的通道是神经冲动的基础，而传输激活的通道则负责触突之间的信 号传导，因此离子通道及运输蛋白在神经系统里面扮演着极为重要的角色。事实上大多数 生物的攻击性或者防御性神经毒素，都是通过调整通道的传导性以及动力学特征，来达到 关闭或者麻痹系统的目的的。此外，离子通道及运输蛋白对于涉及细胞中快速变化的大量 生物学过程也是一个关键结构。例如心肌、骨骼肌以及平滑肌的肌肉收缩过程，向上皮传输 营养物质和离子，T细胞的激活，以及胰脏beta细胞释放胰岛素的过程。在研究新型药物 的时候，离子通道及运输蛋白是一个非常常见的研究目标。
[0005] 由于离子通道及运输蛋白在体内具有重要的生理功能，对离子通道及运输蛋白的 结构和功能研究一直是一个很重要的研究热点和难点。然而，天然的离子通道及运输蛋白 在体外并不稳定，很难得到高纯度的稳定的离子通道及运输蛋白。
[0006] 近年来，有多个研究小组报道了从原核表达系统中纯化得到不同种属的离子通道 蛋白并得到相应的晶体结构。目前的研究主要集中在对来源于原核生物的离子通道及运输 蛋白，国内外鲜有对人源性的离子通道及运输蛋白有过表达纯化和结晶的报道。其主要原 因是因为离子通道蛋白和运输蛋白可溶性很差，稳定性比较低，难以通过体外重组表达得 到大量的稳定蛋白用于研究。本发明提供了一种融合表达离子通道及运输蛋白的方法，可 应用于解决包括人源性离子通道蛋白和运输蛋白的体外稳定高表达问题。


【发明内容】

[0007] 本发明旨在克服上述缺陷，解决离子通道及运输蛋白在体外重组表达所遇到的问 题，为离子通道及运输蛋白的体外表达纯化，蛋白结晶提供技术平台，为离子通道及运输蛋 白的结构研究和靶向离子通道及运输蛋白的药物研发打下基础。
[0008] 本发明提供了一种应用BRIL或T4L蛋白片段进行离子通道蛋白及运输蛋白融合 表达的新方法。
[0009] 具体地，本发明提供了用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特 征在于：为一种Bril蛋白片段（氨基酸序列23-128,蛋白号：P0ABE7)或与该片段序列同源 性大于90%的蛋白；或为一种T4L蛋白片段（氨基酸序列2-161，蛋白号：P00720)或与该 片段序列同源性大于90 %的蛋白。
[0010] 其中，上述Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID N0. 1.1所示；上述T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 1. 2所示。
[0011] 此外，本发明还提供了上述Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋 白的编码基因序列如SEQ ID N0. 2.1所示；上述T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于 90%的蛋白的编码基因序列如SEQ ID N0. 2. 2所示。
[0012] 另外，本发明还提供了融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：将 上述蛋白片段的氨基酸序列插入到离子通道蛋白或运输蛋白的N-末端、C-末端或者膜内 环区构建融合蛋白。
[0013] 优选地，采用ASIC(酸敏感离子通道）及GLUT1 (葡萄糖转运蛋白）。
[0014] 具体地，本发明提供了含序列如SEQ ID NO. 1. 1，和序列如SEQ ID NO. 1. 2所示的 离子通道融合表达蛋白在ASIC(酸敏感离子通道）及GLUT1(葡萄糖转运蛋白）的应用，即 把上述BRIL，和T4L等蛋白片段插入到ASIC (酸离子通道）及GLUT1 (葡萄糖转运蛋白） 的不同区域（N-末端，C-末端或者膜内环区）构建融合蛋白。
[0015] 进一步地说，即、将上述Bril蛋白片段与ASIC进行融合表达，得到的融合白蛋氨 基酸序列如SEQ ID NO. 3. 1所示；或将上述T4L蛋白片段与ASIC进行融合表达，得到的融 合白蛋氨基酸序列如SEQ ID N0. 3. 2所示。
[0016] 以及，采用上述Bril蛋白片段构建的ASIC融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID NO. 4. 1所示；或采用上述T4L蛋白片段构建的ASIC融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID Ν0· 4· 2 所示。
[0017] 另外，本发明还将上述Bril蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融合白蛋氨 基酸序列如SEQ ID N0. 3. 3所示；或将上述T4L蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融 合白蛋氨基酸序列如SEQ ID N0. 3. 4所示。
[0018] 以及，采用上述Bril蛋白片段构建的GLUT1融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID NO. 4. 3所示；或采用上述T4L蛋白片段构建的GLUT1融合表达质粒，其蛋白序列如SEQ ID Ν0· 4· 4 所示。
[0019] 另外，本发明还发现上述人源性ASIC (酸离子通道）融合表达质粒可以在昆虫细 胞（如：SF9、SF21、HiFive等）中表达，人源性GLUT1 (葡萄糖转运蛋白）融合表达质粒在 哺乳细胞（如：293，CH0等）中表达。
[0020] 将上述中 SEQ ID N0. 4. 1、SEQ ID N0. 4. 2、SEQ ID N0. 4. 3、SEQ ID N0. 4. 4 所示 的基因序列的构建到表达载体如：pFastBacl，PcDNA3. 1，PET21b等上进行蛋白质表达。
[0021] 本发明的作用和效果:
[0022] 出于提高离子通道蛋白及运输蛋白可溶表达，及蛋白的稳定性考虑，本发明通过 对目标离子通道及运输蛋白进行独特的改造，即、通过尝试在离子通道蛋白及运输蛋白的 N-末端、C-末端或膜内环区插入BRIL，和T4L等融合蛋白片段构建融合蛋白表达质粒，从 而改进其体外稳定性及可结晶性。成功得到稳定性好，表达量高，并可结晶的离子通道及运 输蛋。
[0023] 这类蛋白是非常重要的药物作用靶标蛋白，对这类蛋白的结构研究将有助于未来 靶向离子通道及运输蛋白的药物的研究与开发。值得指出的是，根据本发明提供的方法，可 广泛适用于各种离子通道及运输蛋白的研究。
[0024] 经研究发现，本发明构建的融合蛋白既可以在昆虫细胞中表达，也可以在酵母中 和哺乳动物细胞等细胞中进行表达，具有广泛的应用范围。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 附图1、两种ASIC1融合蛋白纯化后的电泳检测图；
[0026] 其中，左图为T4L-ASIC融合蛋白；右图为BRIL-ASIC1融合蛋白。
[0027] 附图2、两种ASIC1融合蛋白的UPLC检测图谱；
[0028] 其中，左图为T4L-ASIC融合蛋白；右图为BRIL-ASIC1融合蛋白。
[0029] 附图3、两种GLUT1融合蛋白纯化后的电泳检测图；
[0030] 其中，左图为T4L-GLUT1融合蛋白；右图为BRIL-GLUT1融合蛋白。
[0031] 附图4、两种GLUT1融合蛋白纯化后的电泳检测图；
[0032] 其中，左图为T4L-GLUT1融合蛋白；右图为BRIL-GLUT1融合蛋白。

【具体实施方式】
[0033] 本领域的技术人员能采用本领域熟知的方法能用于构建含BRIL，和T4L等蛋白片 段的离子通道蛋白及运输蛋白融合表达质粒，这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技 术、体内重组技术等，所构建的离子通道蛋白及运输蛋白融合表达基因序列可以有效地连 接到不同表达载体的适当启动子上，以指导mRNA合成。
[0034] 构建好的质粒可以用本领域技术人员熟知的常规技术转染或转化到细胞，如可以 用Bac-to-Bac技术把含融合表达基因的PFastBac载体转化到SF9细胞中进行表达，转化 后细胞的培养和病毒的收集和传代等方法均为本领域技术人员所熟知的常规技术。
[0035] 实施例1
[0036] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的基因合成
[0037] 化学合成
[0038] BRIL蛋白片段（氨基酸序列如SEQ ID NO. 1. 1所示）、核苷酸模板（SEQ ID NO. 2. 1)
[0039] (5 ' GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAA TGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAG CTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATT GATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACC CGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTG3'），正向引物为：（5'CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCA TCATCACCACCATCACGCTGATCTGGAAGACAATTGG3 '），反向引物为：（5 ' CCCCTGAAAGTACAGGITTTCC AGGTACTTCTGAATGTATGC3'），用PCR反应获得BRIL蛋白片段基因。
[0040] 参考人类基因密码子，化学合成ASICI核苷酸模板（5'ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGA GGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCT TCTCCTACGAGCGCCTGTCTCTGAAGCGCGCACTGTGGGCCCTGTGCTTCCTGGGCTCCCTGGCTGTGCTGCTGTGT GTGTGCACGGAGCGCGTGCAGTACTACTTCCACTACCACCATGTCACCAAGCTCGACGAGGTGGCTGCCTCTCAGCT TACCTTCCCTGCTGTCACGCTGTGCAACCTCAACGAGTTCCGCTTTAGCCAAGTCTCCAAGAATGACCTGTATCATG CTGGCGAGCTGCTGGCCCTGCTCAACAACAGGTATGAGATACCAGACACACAGATGGCAGATGAAAAGCAGCTGGAG ATACTGCAGGACAAAGCCAACTTCCGCAGCTTCAAACCCAAACCCTTCAACATGCGCGAGTTCTACGACCGCGCTGG CCACGACATTCGCGACATGCTGCTCTCCTGCCACTTCCGCGGCGAGGTCTGCAGCGCTGAAGACTTCAAGGTGGTCT TCACACGCTATGGAAAGTGCTACACGTTCAACTCCGGCCGCGATGGCCGCCCGCGCCTGAAGACCATGAAGGGTGGC ACGGGCAATGGCCTGGAAATCATGCTGGACATCCAGCAGGACGAGTACCTGCCTGTGTGGGGCGAGACTGACGAGAC GTCCTTCGAAGCAGGCATCAAAGTGCAGATCCATAGTCAGGATGAACCTCCTTTCATCGACCAGCTGGGCTTTGGCG TGGCCCCAGGCTTCCAGACCTTTGTGGCCTGCCAGGAGCAGCGCCTCATCTACCTGCCCCCACCCTGGGGCACCTGC AAAGCTGTTACCATGGACTCCGATTTGGATTTCTTCGACTCCTACAGCATCACTGCCTGCCGCATCGACTGTGAGAC GCGCTACCTGGTGGAGAACTGCAACTGCCGCATGGTGCACATGCCAGGCGATGCCCCATACTGTACTCCAGAGCAGT ACAAGGAGTGTGCAGATCCTGCTCTGGACTTCCTGGTGGAAAAGGACCAGGAGTACTGCGTGTGTGAAATGCCTTGC AACCTGACCCGCTATGGCAAAGAGCTGTCCATGGTCAAGATCCCCAGCAAAGCCTCAGCCAAGTACCTGGCCAAGAA GTTCAACAAATCTGAGCAATACATAGGCGAGAACATCCTGGTGCTGGACATTTTCTTTGAAGTCCTCAACTATGAGA CCATTGAACAGAAGAAGGCCTATGAGATTGCAGGCCTCCTGGGTGACATCGGCGGCCAGATGGGCCTGTTCATCGGC GCCAGCATCCTCACGGTGCTGGAGCTCTTTGACTACGCCTACGAGGTCATTAAGCACAAGCTGTGCCGCCGCGGAAA ATGCCAGAAGGAGGCCAAAAGGAGCAGTGCGGACAAGGGCGTGGCCCTCAGCCTGGACGACGTCAAAAGACACAACC CGTGCGAGAGCCTTCGCGGCCACCCTGCCGGCATGACATACGCTGCCAACATCCTGCCTCACCATCCGGCCCGCGGC ACGTTCGAGGACTTTACCTGCTGA3 '），正向引物（5 ' GAAAACCTGTACTTTCAGGGGTCCACACTGCACGGCCT GGCCCACA3'），反向引物（5, CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反应获得基因 ASICI (25-464)。正向引物（5'CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCA TCACCACCATCACGAAAACCTGTACTTTCAG3 '），反向引物（5 ' CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGC TTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反应获得基因 8*His-BRIL(23-128)-TEV-ASICI (25-464)。参 照以上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点BamHI，反向引物引入限制性酶切 位点Xhol和终止密码子。
[0041] T4L蛋白（氨基酸如序列表1. 2所示）其核苷酸模板如序列表2. 2所示
[0042] (5, AACATCTTCGAGATGCTCCGTATCGACGAGGGCCTCAGGTTGAAGATCTATAAGGACACAGAGGGC TATTACACCATCGGTATTGGTCATCTCTTGACTAAGTCGCCTTCACTTAACGCAGCAAAATCCGAACTGGACAAGGC CATCGGTCGCAATACAAATGGTGTCATTACTAAGGACGAAGCTGAAAAGCTCTTCAACCAGGACGTTGATGCAGCTG TTCGCGGAATCCTGCGCAACGCAAAGCTCAAGCCGGTTTACGATTCTTTGGACGCCGTTCGCCGTGCGGCCTTGATT AACATGGTGTTTCAGATGGGTGAAACCGGAGTTGCAGGATTTACCAACTCGCTGAGGATGCTGCAACAAAAGAGATG GGACGAAGCCGCTGTGAATCTCGCCAAATCTAGGTGGTACAACCAGACACCCAATCGTGCGAAGAGAGTGATAACTA CATTCCGCACCGGTACTTGGGACGCATAT
[0043] 3'），正向引物为：（5' CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCATCACCACCATCACAAC ATCTTCGAGATGCTCCGT3'），反向引物为：（5, CCCCTGAAAGTACAGGITTTCATATGCGTCCCAAGTACCGG TG3'），用PCR反应获得T4L蛋白片段基因。
[0044] 参考人类基因密码子，化学合成ASICI核苷酸模板（5'ATGGAACTGAAGGCCGAGGAGGA GGAGGTGGGTGGCGTCCAGCCGGTGAGCATCCAGGCCTTCGCCAGCAGCTCCACACTGCACGGCCTGGCCCACATCT TCTCCTACGAGCGCCTGTCTCTGAAGCGCGCACTGTGGGCCCTGTGCTTCCTGGGCTCCCTGGCTGTGCTGCTGTGT GTGTGCACGGAGCGCGTGCAGTACTACTTCCACTACCACCATGTCACCAAGCTCGACGAGGTGGCTGCCTCTCAGCT TACCTTCCCTGCTGTCACGCTGTGCAACCTCAACGAGTTCCGCTTTAGCCAAGTCTCCAAGAATGACCTGTATCATG CTGGCGAGCTGCTGGCCCTGCTCAACAACAGGTATGAGATACCAGACACACAGATGGCAGATGAAAAGCAGCTGGAG ATACTGCAGGACAAAGCCAACTTCCGCAGCTTCAAACCCAAACCCTTCAACATGCGCGAGTTCTACGACCGCGCTGG CCACGACATTCGCGACATGCTGCTCTCCTGCCACTTCCGCGGCGAGGTCTGCAGCGCTGAAGACTTCAAGGTGGTCT TCACACGCTATGGAAAGTGCTACACGTTCAACTCCGGCCGCGATGGCCGCCCGCGCCTGAAGACCATGAAGGGTGGC ACGGGCAATGGCCTGGAAATCATGCTGGACATCCAGCAGGACGAGTACCTGCCTGTGTGGGGCGAGACTGACGAGAC GTCCTTCGAAGCAGGCATCAAAGTGCAGATCCATAGTCAGGATGAACCTCCTTTCATCGACCAGCTGGGCTTTGGCG TGGCCCCAGGCTTCCAGACCTTTGTGGCCTGCCAGGAGCAGCGCCTCATCTACCTGCCCCCACCCTGGGGCACCTGC AAAGCTGTTACCATGGACTCCGATTTGGATTTCTTCGACTCCTACAGCATCACTGCCTGCCGCATCGACTGTGAGAC GCGCTACCTGGTGGAGAACTGCAACTGCCGCATGGTGCACATGCCAGGCGATGCCCCATACTGTACTCCAGAGCAGT ACAAGGAGTGTGCAGATCCTGCTCTGGACTTCCTGGTGGAAAAGGACCAGGAGTACTGCGTGTGTGAAATGCCTTGC AACCTGACCCGCTATGGCAAAGAGCTGTCCATGGTCAAGATCCCCAGCAAAGCCTCAGCCAAGTACCTGGCCAAGAA GTTCAACAAATCTGAGCAATACATAGGCGAGAACATCCTGGTGCTGGACATTTTCTTTGAAGTCCTCAACTATGAGA CCATTGAACAGAAGAAGGCCTATGAGATTGCAGGCCTCCTGGGTGACATCGGCGGCCAGATGGGCCTGTTCATCGGC GCCAGCATCCTCACGGTGCTGGAGCTCTTTGACTACGCCTACGAGGTCATTAAGCACAAGCTGTGCCGCCGCGGAAA ATGCCAGAAGGAGGCCAAAAGGAGCAGTGCGGACAAGGGCGTGGCCCTCAGCCTGGACGACGTCAAAAGACACAACC CGTGCGAGAGCCTTCGCGGCCACCCTGCCGGCATGACATACGCTGCCAACATCCTGCCTCACCATCCGGCCCGCGGC ACGTTCGAGGACTTTACCTGCTGA3 '），正向引物（5 ' GAAAACCTGTACTTTCAGGGGTCCACACTGCACGGCCT GGCCCACA3'），反向引物（5, CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGCTTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反应获得基因 ASICI (25-464)。正向引物（5'CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGCATCACCATCA TCACCACCATCACGAAAACCTGTACTTTCAG3 '），反向引物（5 ' CTTGGTACCGCATGCCTCGAGTTACTTGTGC TTAATGACCTCGTAG3'），用 PCR 反应获得基因 8*His-T4L(2-161)-TEV-ASICI (25-464)。参照 以上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点BamHI，反向引物引入限制性酶切位 点Xhol和终止密码子。
[0045] PCR 反应条件：在 50 μ L 反应体系中（PCR Buffer, 1. 5mM MgS04, 200 μ M dNTPs)加 入扩增引物各〇. 2μΜ。充分混匀后开始PCR循环：94°C变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退 火30秒，68°C延伸2分钟，共进行30个循环，最后在68°C保温10分钟。PCR产物经1. 2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收后用于克隆。
[0046] 实施例2
[0047] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的质粒构建
[0048] 将实施例1中获得的PCR片段与经过限制性内切酶EcoRI和Xhol双酶切的载体 pFastBacl(购自Invitrogen)进行连接。连接产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，体 积不应超过感受态细胞的10 %，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟，将管放入42°C水 浴，定时60秒热休克，快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却，每管加入400 μ 1 LB培养 基，37°C缓摇60分钟，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，低速离心2分 钟，去上清，留约100 μ 1培养基在离心管内，重悬菌体，用玻璃铺菌器将菌液在琼脂板上铺 匀。将平板倒置于37°C恒温培养箱，12-16小时后可出现菌落。涂板后挑取阳性克隆进行 鉴定。
[0049] 实施例3
[0050] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的表达
[0051] 将实施例2中获得的重组质粒转化至DHlOBac E. coli感受态细胞中，体积不应该 超过感受态细胞的5%，轻轻旋转几次混匀内容物。冰浴30分钟；将管放入42°C水浴，定时 90秒热休克；快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却；每管加入800ulLB培养基，37°C，缓 摇4小时，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；用玻璃铺菌器将30ul菌液在抗 性琼脂板上铺匀；将平板倒置于37°C恒温培养箱中，30-48小时后可出现蓝白斑菌落；挑取 阳性白斑单菌落接入5ml抗性LB，缓摇12-16h，取菌液进行PCR鉴定，结果显示杆粒重组正 确。将重组杆粒经转染试剂转染到昆虫细胞中，4-5天后收取细胞上清液作为第一代杆状病 毒。用第一代杆状病毒感染昆虫细胞72小时后，获得第二代病毒，用于组合多肽的表达；使 用第二代病毒1: 1〇〇体积比感染密度为2xl(T6/ml的昆虫细胞sf9,继续培养72小时后，离 心收细胞，PBS洗一遍细胞。
[0052] 实施例4
[0053] ASIC1 (酸敏感通道蛋白）融合蛋白的纯化
[0054] 用 100ml 预冷的裂解液（25mM Tris ρΗ8· 0, 10mM MgCl2, 20mMKCl)重悬 1L 细胞到 l〇〇m中，用匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后用超速离心机离心45分钟，去掉上清，重复洗涤 步骤3次，再用高盐溶液重复洗涤步骤三次，提取好的细胞膜用加甘油的裂解液溶解并用 液氮进行速冻，储存在-80C冰箱。在冰上融化解冻细胞膜，放置30分钟后按照每升细胞 膜加入100ml溶膜缓冲液比例加入溶膜缓冲液，并继续在冰上放置过夜溶膜，用超速离心 机在100, 000g离心力下离心1小时，弃掉沉淀，上清与lml用平衡缓冲液平衡好的Talon IMAC resin -起孵育过夜，次日，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移到自 流柱里。依次用冲洗缓冲液 1 (25mMTris ρΗ8· 0 ;150mMNaCl ;0· 05% DDM ;5mMMgCl2)洗 10个 柱体积，冲洗缓冲液 2(25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM ;5mM MgCl2 ; 25mM Imid) 洗 10 个柱体积，冲洗缓冲液 3(25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0· 05% DDM ;5mM MgCl2 ;50mM Imid)洗5个柱体积，然后用5个柱体积的洗脱缓（25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM;5mM MgCl2;250mM Imid)冲液洗脱目的蛋白，纯化后得到的目的蛋白保存在-80°C，图 1位三种融合蛋白的电泳检测结果。
[0055] 从得率来看，经纯化后3种膜蛋白的得率都超过lmg/L细胞，具有较高的产率。
[0056] 实施例5
[0057] 发明融合ASIC1 (离子通道蛋白）蛋白均一性检测
[0058] 采用Waters公司的Acquity Η-Class Bio UPLC系统进行检测，检测所用柱子 为S印ax SEC250分子筛柱，上样前先用平衡缓冲液（25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM ;5mM MgCl2)洗柱子至基线没有太大变化止，然后将待检测的样品加入专用的96孔板中 上样，积分处理采用仪器自带的软件。
[0059] 按照上述方法对三种融合蛋白分别进行了检测，结果如图2所示，三种融合蛋白 均一性都很好，能够检测到融合蛋白单体峰，且单体占蛋白样品的大部分。
[0060] 实施例6
[0061] GLUT1 (葡萄糖转运蛋白）融合蛋白的基因合成
[0062] T4L蛋白（氨基酸如序列表1. 2所示）其核苷酸模板如序列表2. 2所示
[0063] (5, AACATCTTCGAGATGCTCCGTATCGACGAGGGCCTCAGGTTGAAGATCTATAAGGACACAGAGGGC TATTACACCATCGGTATTGGTCATCTCTTGACTAAGTCGCCTTCACTTAACGCAGCAAAATCCGAACTGGACAAGGC CATCGGTCGCAATACAAATGGTGTCATTACTAAGGACGAAGCTGAAAAGCTCTTCAACCAGGACGTTGATGCAGCTG TTCGCGGAATCCTGCGCAACGCAAAGCTCAAGCCGGTTTACGATTCTTTGGACGCCGTTCGCCGTGCGGCCTTGATT AACATGGTGTTTCAGATGGGTGAAACCGGAGTTGCAGGATTTACCAACTCGCTGAGGATGCTGCAACAAAAGAGATG GGACGAAGCCGCTGTGAATCTCGCCAAATCTAGGTGGTACAACCAGACACCCAATCGTGCGAAGAGAGTGATAACTA CATTCCGCACCGGTACTTGGGACGCATAT
[0064] 3'），正向引物为：（5' CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGAACATCTTCGAGATGCTCCGTAT C3'），反向引物为：（5, CAGCTTCTTGCTGCTGGGCTCCATATATGCGTCCCAAGTACCGGTGC3'），用 PCR 反应获得T4L蛋白片段基因。
[0065] 参考人类基因密码子，化学合成GLUT1模板（5' ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTGACGG GTCGCCTCATGCTGGCCGTGGGAGGAGCAGTGCTTGGCTCCCTGCAGTTTGGCTACAACACTGGAGTCATCAATGCC CCCCAGAAGGTGATCGAGGAGTTCTACAACCAGACATGGGTCCACCGCTATGGGGAGAGCATCCTGCCCACCACGCT CACCACGCTCTGGTCCCTCTCAGTGGCCATCTTTTCTGTTGGGGGCATGATTGGCTCCTTCTCTGTGGGCCTTTTCG TTAACCGCTTTGGCCGGCGGAATTCAATGCTGATGATGAACCTGCTGGCCTTCGTGTCCGCCGTGCTCATGGGCTTC TCGAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATCGGTGTGTACTGCGGCCTGACCACAGG CTTCGTGCCCATGTATGTGGGTGAAGTGTCACCCACAGCCCTTCGTGGGGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCA TCGTCGTCGGCATCCTCATCGCCCAGGTGTTCGGCCTGGACTCCATCATGGGCAACAAGGACCTGTGGCCCCTGCTG CTGAGCATCATCTTCATCCCGGCCCTGCTGCAGTGCATCGTGCTGCCCTTCTGCCCCGAGAGTCCCCGCTTCCTGCT CATCAACCGCAACGAGGAGAACCGGGCCAAGAGTGTGCTAAAGAAGCTGCGCGGGACAGCTGACGTGACCCATGACC TGCAGGAGATGAAGGAAGAGAGTCGGCAGATGATGCGGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGAGCTGTTCCGCTCCCCC GCCTACCGCCAGCCCATCCTCATCGCTGTGGTGCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCTGGCATCAACGCTGTCTTCTA TTACTCCACGAGCATCTTCGAGAAGGCGGGGGTGCAGCAGCCTGTGTATGCCACCATTGGCTCCGGTATCGTCAACA CGGCCTTCACTGTCGTGTCGCTGTTTGTGGTGGAGCGAGCAGGCCGGCGGACCCTGCACCTCATAGGCCTCGCTGGC ATGGCGGGTTGTGCCATACTCATGACCATCGCGCTAGCACTGCTGGAGCAGCTACCCTGGATGTCCTATCTGAGCAT CGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTTCTTTGAAGTGGGTCCTGGCCCCATCCCATGGTTCATCGTGGCTGAACTCT TCAGCCAGGGTCCACGTCCAGCTGCCATTGCCGTTGCAGGCTTCTCCAACTGGACCTCAAATTTCATTGTGGGCATG TGCTTCCAGTATGTGGAGCAACTGTGTGGTCCCTACGTCTTCATCATCTTCACTGTGCTCCTGGTTCTGTTCTTCAT CTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGACTAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGGGGGAG CCAGCCAAAGTGACAAGACACCCGAGGAGCTGTTCCATCCCCTGGGGGCTGATTCCCAAGTGTGA3'），正向引物 (5, ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTG3'），反向引物（5, ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGGTGGTGTGTC TTGTCACTTTGGCTGGCTC3'），用 PCR 反应获得基因 GLUT1 (1-478)。正向引物（5'CCCGTTTCTGC TAGCAAGCTTACCATGAACATCTTCGAGATGCTCCGTATC3 '），反向引物（5 ' GGTCGAGGTCGGGGGATCCTTA ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATG3'），用 PCR 反应获得基因 T4L-GLUT1 (l-478)-10*His。参照以 上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点Hindlll，反向引物引入限制性酶切位 点BamHI和终止密码子。
[0066] BRIL蛋白片段（氨基酸序列如序列表1. 1所示）核苷酸模板（序列表2. 1)
[0067] (5, GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAA TGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAG CTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATT GATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACC CGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTG3'），正向引物为：（5' GCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAAC3'）， 反向引物为：（5, CAGGTACTTCTGAATGTATGCATTC'），用PCR反应获得BRIL蛋白片段基因。
[0068] 参考人类基因密码子，化学合成GLUT1核苷酸模板（5'ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCT GACGGGTCGCCTCATGCTGGCCGTGGGAGGAGCAGTGCTTGGCTCCCTGCAGTTTGGCTACAACACTGGAGTCATCA ATGCCCCCCAGAAGGTGATCGAGGAGTTCTACAACCAGACATGGGTCCACCGCTATGGGGAGAGCATCCTGCCCACC ACGCTCACCACGCTCTGGTCCCTCTCAGTGGCCATCTTTTCTGTTGGGGGCATGATTGGCTCCTTCTCTGTGGGCCT TTTCGTTAACCGCTTTGGCCGGCGGAATTCAATGCTGATGATGAACCTGCTGGCCTTCGTGTCCGCCGTGCTCATGG GCTTCTCGAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATCGGTGTGTACTGCGGCCTGACC ACAGGCTTCGTGCCCATGTATGTGGGTGAAGTGTCACCCACAGCCCTTCGTGGGGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCT GGGCATCGTCGTCGGCATCCTCATCGCCCAGGTGTTCGGCCTGGACTCCATCATGGGCAACAAGGACCTGTGGCCCC TGCTGCTGAGCATCATCTTCATCCCGGCCCTGCTGCAGTGCATCGTGCTGCCCTTCTGCCCCGAGAGTCCCCGCTTC CTGCTCATCAACCGCAACGAGGAGAACCGGGCCAAGAGTGTGCTAAAGAAGCTGCGCGGGACAGCTGACGTGACCCA TGACCTGCAGGAGATGAAGGAAGAGAGTCGGCAGATGATGCGGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGAGCTGTTCCGCT CCCCCGCCTACCGCCAGCCCATCCTCATCGCTGTGGTGCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCTGGCATCAACGCTGTC TTCTATTACTCCACGAGCATCTTCGAGAAGGCGGGGGTGCAGCAGCCTGTGTATGCCACCATTGGCTCCGGTATCGT CAACACGGCCTTCACTGTCGTGTCGCTGTTTGTGGTGGAGCGAGCAGGCCGGCGGACCCTGCACCTCATAGGCCTCG CTGGCATGGCGGGTTGTGCCATACTCATGACCATCGCGCTAGCACTGCTGGAGCAGCTACCCTGGATGTCCTATCTG AGCATCGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTTCTTTGAAGTGGGTCCTGGCCCCATCCCATGGTTCATCGTGGCTGA ACTCTTCAGCCAGGGTCCACGTCCAGCTGCCATTGCCGTTGCAGGCTTCTCCAACTGGACCTCAAATTTCATTGTGG GCATGTGCTTCCAGTATGTGGAGCAACTGTGTGGTCCCTACGTCTTCATCATCTTCACTGTGCTCCTGGTTCTGTTC TTCATCTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGACTAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGG GGGAGCCAGCCAAAGTGACAAGACACCCGAGGAGCTGTTCCATCCCCTGGGGGCTGATTCCCAAGTGTGA
[0069] 3，），正向引物（5，CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGCTG3，）， 反向引物（5 ' GTTTCCCAATTGTCTTCCAGATCAGCCTTGGCCCGGTTCTCCTCGTTG3 '），用 PCR 反应获得 基因 GLUTl(l-225),正向引物（5'GAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAGAAGAAGGTCACCATCCTGGA GC3 '），反向引物（5 ' ATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGGTGGTGCACTTGGGAATCAGCCCCCA3 '），用 PCR 反应获得基因 GLUTl(254-492)。正向引物（5, CCCGTTTCTGCTAGCAAGCTTACCATGGAGCCCAGCA GCAAGAAGCTG3'），反向引物（5, GGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGATGGTGGTGATGGTGGTGATG3'）， 用 PCR 反应获得基因 GLUT1 (1-225) -BRIL (130-233) -TEV-GLUT1 (254-492) -10*His。参照以 上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点Hindlll，反向引物引入限制性酶切位 点BamHI和终止密码子。
[0070] 实施例7
[0071] 本发明GLUT1 (葡萄糖转运蛋白）的表达
[0072] 将实施案例4中lmg GLUT1质粒溶解于50ml Opti-MEM培养集中，混匀·并与 3ml PEI (lmg/ml)溶于500pti-MEM培养集中，混勻，室温孵育15分钟后加入到1L细胞密度 为1. 2xl06cells/ml293F细胞中。37°C，5% C02培养72小时，收细胞沉淀。
[0073] 实施例8
[0074] 发明GLUT1 (运输蛋白）的纯化
[0075] 用 20ml 预冷的裂解液（50mM Tris ρΗ7· 5, 200mM NaCl, 5% glycerol)重悬 300mL 细胞到20mL中，用匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后用超速离心机离心50分钟，去掉上清，重 复洗涤步骤3次，再用高盐溶液（50mM Tris pH7. 5, 1M NaCl，5% glycerol)重复洗涤步骤 两次。提取好的细胞膜按照每300mL细胞加入20mL溶膜缓冲液比例加入溶膜缓冲液（50mM Tris ρΗ7· 5, 200mM NaCl，5% glycerol，1% DDM)，用匀浆器在冰上进行匀浆，并用磁力搅 拌器在4°C过夜搅拌溶膜，用超速离心机在100, 000g离心力下离心1小时，弃掉沉淀，上清 与 lmL 用平衡缓冲液（50mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5% glycerol，0.05%DDM)平衡好 的Talon IMAC resin -起孵育3hrs，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移 到自流柱里。依次用冲洗缓冲液 l(250mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5%glycerol，0.05% DDM)洗 10 个柱体积，冲洗缓冲液 2(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5%glycerol，0.05% DDM，20mM imidazole)洗 10 个柱体积，冲洗缓冲液 3(50mM Tris pH7.5,200mM NaCl，5% glycerol，0. 05% DDM, 50mM imidazole)洗5个柱体积，然后用5个柱体积的洗脱缓（50mM Tris ρΗ7· 5, 200mM NaCl, 5% glycerol，0.05% DDM，250mM imidazole)冲液洗脱目的蛋白， 纯化后得到的目的蛋白浓缩至400uL保存在-80°C。图3位三种融合蛋白的电泳检测结果。
[0076] 从得率来看，经纯化后2种GLUT1融合蛋白的得率都超过0. 5mg/L细胞，具有较高 的产率。
[0077] 实施例9
[0078] 发明GLUT1 (葡萄糖转运蛋白）融合蛋白均一性检测
[0079] 采用Waters公司的Acquity Η-Class Bio UPLC系统进行检测，检测所用柱子 为S印ax SEC250分子筛柱，上样前先用平衡缓冲液（25mMTris pH8. 0 ;150mMNaCl ;0. 05% DDM ;5mM MgCl2)洗柱子至基线没有太大变化止，然后将待检测的样品加入专用的96孔板中 上样，积分处理采用仪器自带的软件。
[0080] 按照上述方法对三种融合蛋白分别进行了检测，结果如图4所示，2种GLUT1融合 蛋白的均一性都很好，能够检测到融合蛋白单体峰，且单体占蛋白样品的大部分。
[0081] 序列表 SEQUEIs'CE LIST!KG <110> 维亚生物科技I上海）有跟公司 <120> ?合表途?予通道蛋# JJtlt蛋自购方*及其使用缝蚤由爲断 <130> 2U14 <160> 38 <!?0> Patentln version 3,3 <2H)> 1 <211> 1116 <2I2> PRT <21i> BIUL 蛋白 <m> i Ain k$p Leu Clu Asp Axn Trp Clu Tlir Lou Asn Asp Asn Leu Lys VnI 1 5 10 15 lie Glu Lfs Ala Asp Asji Ala Ala Gin Vil Lfi Asp ila L參? Thr Lys 20 25 30 iei Arg Alt Ala Ala Leu Asp Alt Gin Lyi Alt Thr Pro Pro Lys leu 35 40 45 Glu Asp Lys Scr Pru Asp Scr Pro GIu Mci Lyn Asp fhc Arg His Clly 58 55 60 Flic Asp 11c Leu VaI (Hy Gin lie Asp ：\$p Ala Leu lys Leu Ah Asn
[0082] 65 7β 75 80 Ghi Gly Lys hi Lys Gii義 Ala CUn Ala Ala Ahi Giu ()1ιι ixu Lys Tlu 85 90 95 Thr Arp Asn Ala Tyr lie Gin Lys Tyr Leu 1關 ?5 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> T4L 蛋白 <40β> 2 Asn lie Phe Glu Met Leu Arg lie Asp Giu Gly Leu Arg Leu Lys lie 15 10 15 Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr Thr lie- C]y I le Gly His Leu Leu 20 25 30 Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala 35 40 45 lie Cly Arg Asn Thr Asn Gly Val lie Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys 50 55 m Leu Phe Asa Gin Asp Val Asp Ala Ai翁 V魏1 Arg Cly lie Leu Arg Asn 65 70 75 80
[0083] Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala 85 90 95 Ala Leu lie Asn Met Val Phe Gin Met Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly 100 105 110 Fhc Thr Asn Scr Leu Arg Mei Leu Gin Gin Lys Arg Trp Asp Glu Ala 115 120 125 Ala Val Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gin Thr Pro Asn Arg 130 135 140 Ala Lys Arg Val lie Thr Thr Phc Arg Thr Cly Thr Trp Asp Ala Tyr 145 150 155 160 <210〉 3 <211〉 318 <212> DKA <213> BRIL 蛋白 <400> 3 gctgatcigg aagacaattg ggaaactctg aacgacaaic tcaaggtgai cgagaaggci 60 gacaalgctg cacaagicaa agacgcicig accaagaiga gggeageage cciggacgci 120 cagaaggcca ctccacctaa gcicgaggac aagagcccag atagccctga aatgaaagac 180 tiicggcaig galicgacai iciggtggga cagaiigatg atgcacicaa gctggccaal 240
[0084] gaagggaaag icaaggaagc acaagcagcc gcigagcagc tgaagaccac ccggaaigca iacaitcaga agiaccig 318 <210> 4 <211> 彻 <212> m：\ <2〗3> m蛋白 <棚> 4 mcaici icg aga igciccg iuicgacgag ggcctxaggi igiiagalcui luaggacucii 60 paggficla 11 acacca tcp5g ialigjua.1 i ciciigacui agicgcclic nciimc^cn 120 geawateeg awtggaeaa ggeeateggt egMataeaa atggtgleat taetwggae 181) gaagotgaaa agetetteaa scaggaegtt gatgsigstg tlegcggaat eelgogeaae 240 gcaaagcica agccggi1ia cgaiiciiig gacgccgiic gccgigcggc ciigaitaac 3M atggtgilie agaigggiga aaccggagii gcaggaiiu-i ocaaciogct gaggaigoig 360 cuactuuiuga gaigggacga a gc cgc i g t g a a t c i c gcca aa ixtaggig gtacaaccag 4211 aGaceaiau， gigcgaagag Hgigalaacrl aeal iccgcu ccrgglacug ggacgcalai 48(1 <2H)> 5 <21 J> 562 <212> PRT <2i3> ASICI蛋白与臟IL蛋命_?表达 <_> 5 Met His ils His His His Ills His Bis Ala Asp Leu Clu Asp Asn Trp
[0085] 15 ΙΟ 15 Glu Thr Leu Asn Asp Asji Leu Lys VaJ He Cilu Lys Ala Asp Asn Ala 20 25 30 Ala Oln Val Lys Asp Ala Leu Thr Lys Me! htf, Ata Ala Ala Leu Asp BS 40 45 Ala filn Lys Ala Tlir Pro Pro Lys Leu Ciu Asp Lys Scr Pro Asp Scr 50 55 60 Pro Clu Met Lys Asp Phe Arg HiJ Gly PM Asp 1? Leu Val Gly Gin 65 70 75 80 lie Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Clu fily Lys Val Lys (ilu Ala 85 90 95 (;ln 41a Ala Ala Glu (Πη Lys Thr llir Arg Asn Ala Tyr lie (;ln 100 IttS 110 Lys Tyr Leu Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Ser Thr Leu IHs G1 y Leu 115 120 125 Ala His lie Phe Ser Tyr C!ly Arg Ley Scr leu Lys Arg Ala Leu Trp 130 135 14tt Ala Leu Cys Phe Leu Cly Ser Leu Ala Val Lou Leu Cys Val Cys 丁hr
[0086] 145 150 155 160 Glu Arg Val Gin Ijr Tyr Phe lis Tji His His ￥al Thr Lys Leu Asp 165 170 175 Glu Val Ala A1 a Scr Gin Leu 丁hr Phc Pro A1 a Va1 丁hr Leu Cys Asn 180 185 190 Leu Asn Glu Phe Arg Phe Ser Gin fal Ser Lys Am Asp Leu Tyr His 195 200 20S Ms Giy Glu Leu Lw Ala Leu L_ Asn Asn Arg Tyr Glu lie Pro Asp 210 215 220 Tlir Gin Mcl Ala Asp Glu Lys Gin Leu Glu I Ic Leu Gin Asp Lys Aia 225 230 235 240 Asn Phc Arg Scr Phc Lys Pro l.ys Pro Phc Asn Met Arg Glu Phc Tyr 245 250 255 Asp Arg Ala Gly His Asp lie Arg Asp Mei Leu Leu Scr Cys His Phc 260 265 270 Arg Gly Glu ￥al Cjs Ser Ala 6Iu Asp Ph? Lys Val Vtl Phe Thr Arg 275 280 285 Tyr Gly Lys Cys Tyr Thr Phc Asn Scr Gly Arg Asp Gly Arg Pro Arg
[0087] 290 295 300 Leu Lys Thr Met Lys Gly Gly Tlir Giy Asn Gly Lou GIu lie Met Leu 305 310 315 320 Asp 1 Ic Gin Gin Asp GIu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu 325 330 335 Thr Scr Phe Glu Ala Gly He Lys Val (Un Ho His Scr (tin Asp filu 340 345 350 Pro Pro Phe lie Asp Gin Leu GIj Phe Gly ￥al Alt Pro Gly Phe Gin 355 360 365 Tlir Phe Va 1 Ala Cys Gin C1 u Gin Arg Leu I Ic Tyr Leu Pro Pro Pro 370 375 380 Trp (rly Tor Cys Lys Ala Val Thr Mci Asp Scr Asp Leu Asp Phe Phe 3§5 390 395 400 Asp Scr Tyr Scr Uc 丁hr Ala Cys Arg lie Asp Cys Glu Thr Arg 丁yr 405 410 415 hm Vtl Glu Asn Cys Asn Cys Arg Met ￥al His Mat Pro Crly Asp Ala 420 425 430 Pro Tyr Cys Tbr Pro Giu Gin Tfr Lys Glu Cys Alt Asp Pw Ala Lmi
[0088] 435 440 445 Asp Phc Leu Val (ilu Lys Asp Gin Glu Tyr Cys Cys Cllu Mel Pro 450 455 4611 Cys Asn Leu Thr Arg Tyr Giy Lys Glu Leu Scr Met Va] Lys lie Pro 465 470 475 480 Scr l.-ys A1 a Scr Ala Lys Tyr [,cn Alu l.ys Lys Phc Asn Lys Scr Ghs 485 490 495 GIe Tyr IIc Giy Glu Asn lie Leu Va] Leu Asp 1lo Phc Phc Glu Val 500 505 510 Leu Asn Tyr Clu Thr lie Olu Cln Lys Lys Ala Tyr Glu IJc Ala fily 515 520 525 Leu Leu Gly Asp lie GJy (；ly Gin Mel CHy Leu Phc lie Gly Ala Scr 530 535 540 lie Leu Thr Va1 Leu Glu Leu Phc Asp Tyr Ala Tyr Glu Val Ilc Lys 545 550 555 560 Hs Lys <210> 6
[0089] <211> 616 <212> PRT <213> ASICI蛋台与了礼融合表达 <400> 6 Met His His His His His Ills His His Asn lie Phe Glu Mci Leu Arg 1 5 10 15 i!c Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys lie Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr 20 25 30 Tyr Thr lie Gly lie Gly His Leu Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn 35 40 45 Ala Wa Lys Ser Glu Leu Asp Lys Ala lie Gly Arg Asn Hu Asn Giy 50 55 60· Val lie Thr Lys Asp Glu Ala Glu Lys Leu Phe Asn Gin Asp Val Asp 65 70 75 80 Λ1 a Ala Val Arg Gly 11c I.cu Arg Asn Ala Lys Leu i.ys Pro Val Tyr 85 90 95. Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Leu lie Asn Met Val Phe 100 105 110 Gin Mci Gly Glu Thr Gly Val Ala Gly Phe Thr Asn Scr Leu Arg Mci 115 120 125
[0090] Leu Gin Gin Lys Arg frp Asp Glu Ala Alt Vai km Leu Ala Lys Ser 130 135 140 Arg Trp Tyr Asn Gin Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val lie Thr Tin 145 150 155 160 Ptie Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Giy 165 170 175 Scr Thr Leu Ilis Gly Leu Ala IHs lie Phe Ser Tyr Glu Arg Leu Ser 180 185 190 Leu Lys Arg Ala Leu Trp Ala Leu Cys Phe Leu Gly Scr Leu Ala Val 195 200 205 Leu Leu Cys \'al Cys Thr C;lu Arg Val (;ln Tyr Tyr Phe His Tyr llis 210 215 220 If is Val Thr Lys Leu Asp Glu Val Ala Ala Scr Gin Leu Thr Fhc Fro 225 230 235 240 A1 a Va1 Thr Leu Cys Asn Leu Asn Giu Phe Arg Phe Ser Gin Val Scr 245 250 255 Lys Asn Asp Leu TTyr IIis Ala Gly Glu lx? Leu Ala Leu Leu Asn Asn 260 265 270
[0091] Arg Tyr Glu lie Pro Asp flir Gin Met Alt Asp GIu Lys Gin Leu Glu 275 280 285 I]〇 Leu (;】n Asp Lys Ala Asn Phc Arg Scr Phc Lys Pro Lys Pro Phc 290 295 300 Asn Met Arg Glu Phc Tyx Asp Arg Ala Gly llis Asp lie Arg Asp Met 305 310 315 320 Leu Leu Scr Cys llis Fhe Arg Gly Glu Val Cvs Scr Ala Glu Asp Phc 325 m) 335 Lys ￥al ￥al Phe Thr Arg Tyr Gly Lys Cys Tyr Thr Phe Asn Ser Gly 340 345 350 Arg Asp Gly Arg Pro Arg Leu Lys Thr Met Lys Gly Gly Thr Gly Asn 355 360 365 Gly Leu Glu lie Mci Leu Asp lie Gin Gin Asp Glu Tyr Leu Pro Val 370 375 380 Trp Gly Glu Thr Asp Glu Thr Ser Phe Glu Ala Gly He Lys Val 61a 385 390 395 400 lie His Ser Gin Asp Glu Pro Pro Phe He Asp Gin Leu Glj· Phe Cily 405 410 415
[0092] Val Ala Pro Gly Pile Gin Thr Phe Val Ala Cys Gin Glu Gin Arg Leu 420 425 430 He Tyr Leu Pro Pro Pro Trp CHy Thr Cys Lys Ala Val Thr Met Asp 435 440 445 Scr Asp Leu Asp Phe Phe Asp Scr Tyr Scr He Thr A1 a Cys Arg lie 450 455 460 Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Leu Val Ghi Asn Cys .Asn Cys Arg Mci Val 465 470 475 480 I!is Mel Pro Gly Asp Ala Pro Tyr Cys Thr Pro Glu Gin Tyr Lys Glu 485 490 495 Cys Ala Asp Pro Ala Leu Asp Phe Leu Va1 Glu Lys Asp Gin Glu Tyr 500 505 510 Cys Val Cys Glu Mci Pro Cys Asn Leu Thr Arg Tvr Gly Lys Glu Leu 515 520 525 Ser Met Val Lys lie Pro Ser Lys Ala Ser Ala Lys Tyr Leu Ala Lys 530 535 540 Lys Phe Asn Lys Ser Glu Gin Tyr 11e Gly Glu Asn lie Leu Val Leu 545 550 555 560
[0093] Asp 1le Phc Phc GIu Val Leu Asn Tyr Glu Thr lie GIu Gin Lys Lys 565 570 575 AI a Tyr Ciu 11 c Ala (i I y Leu Leu Civ Asp lie (? I y Gi y fiI n Met G1 y 580 585 590 Leu Phc He (?ly Ala Scr ilc Leu Thr Val Leu Ghi Ley Phc Asp Tyr 595 600 605 Ala Tyr Glu Val lie Lys llis Lys 610 615 <2!0> 7 <211> 1689 <212> DNA <213> ASIC1蛋白与BML融合蛋白 <400> 7 atgeaicacc a tealcaeca ccaicacgci gaiciggaag acaaliggga aactcigaac 60 gacaatctca aggtgatcga gaaggctgac aatgctgcac aagtcaaaga cgctctgacc 120 aagatgaggg cagcagccci ggacgcicag aaggccacic cacciaagct cgaggacaag 180 agcccagala gcccigaaai gaaagacili cggcaiggal ic+gacai.lei. ggigggacag 240 atigatgaLg cacicaagci ggccaalgaa gggaaagtca aggaagcaca agcagccgct 300 gagcagctga agaccacccg gaalgcatac aitcagaagl acctggaaaa cciglaciu 360
[0094] caggggtcca cacigcacgg cctggcccac afc?!cfcct acgagcgcci gtclclgaag 420 cgcgcacigt gggccctgtg citxcigggc iccciggcig igcigcigig igigtgcacg 480 gagcgcglgc aglaciact t ccaclaccac ca Iglc-acca agclcgficga gglggcigcc 540 tctcagclta ccliccctgc igtcacgcig igcaaccica acgagliccg cillagccaa 600 glctccuagu aigacctgta icnlgciggc gagcigcigg cccigc-icaa aiaengguil 660 gagaiaccag acacacagat ggcagalgaa gcagcigg agaiacigca ggacaaagcc 720 aacticcgca gcticaaacc caaaccctic aacaigcgcg iigUcuicga ccgcgciggc 780 cacgacattc gcgacatgci gctcicctgc caeUecgeg gcgagglctg cagcgcigaa 840 gacticaagg iggtcucac acgciatgga aagigciaca cgiicaacic cggccgcgat 900 ggccgcccgc gcctgaagac catgaagggi ggcacgggca atggccigga aateaigclg 960 gacateeage aggacgagta eetgeetgLg tggggegaga etgaegagae gteettegaa 1020 gcaggcatca aagtgcagat cc-ataglcag gatgaacc-tc ctttcatcga c-cagctgggc 1080 tttggcgtgg cccoaggctt ccagaccttf gtggcctgcc aggagcagcg cctcatctac 1140 cigcccccac ectggggcac cigcaaagct guaecaigg aciccgaiu ggaiitcuc 1200 gactcctaca gcaicactgc cigccgcaic gaciglgaga cgcgciacct ggtggagaac 1260 tgcaactgcc gcatggtgca catgccaggc gatgccccat aotgtaetcc agagcagtac 1320 aaggagtgtg cagatcctge tctggactto etggtggaaa aggaceagga gtactgcgtg 1380 tgtgaaitgc cttgcaacct gacccictat igcaaigage tgtccatigt caagatcccc 1440
[0095] agCAiageot eagccaagta cctggceaag Mgttcaaca tatctgtgca ttacataggc 1500 gagaacalee tggtgctgga ca H 11cU l gnagicclc.i acin LgHgac t ig?ac?g 156(1 aagaaggcci algaga t tgc aggcctcctg ggigacatcg gcggccagal gggcctgt tc 1620 aicggcgcca gcatcctcac ggigclggag ctctugact acgcciacga ggtcatlaag 1680 cac.aagiaa 1689 <210> 8 <21l> 1851 <212> DNA <2]3> ASICI蛋白与了4L融合蛋白 <400> S aigcatcacc aicaicacca ccfUCiHcaat: a let legaga tgctccgtat egaegaggge 60 cicaggiiga agatciaiaa ggacacagag ggciauaca ccatcggiat iggicaicic 120 ttgactaagt cgccttcact taacgcagca aaatccgaac iggacaaggc catcggtcgc 180 aaiacaaatg gigicaiiac iaaggacgaa gcigaaaagc telicaacca ggacgiIga1 240 gcagctgitc gcggaatccl gcgcaacgca aagcicaagc cggtttacga ltelttggac 300 gccgttcgcc gtgeggeett gattaacatg gtgttteaga tgggtgaaac eggagttgea 360 ggatttacca actcgctgag gatgetgesa caaiagigst gggsegsage cgctgtgaat 420 eicgccaaai ciaggtggia caaccagaca eccaategtg egatgagagt gataaciaca 410 ttccgcaccg gtacttggga egeatatgaa aacctgtact ttcaggggtc cacactgcac 540 ggcciggccc acatcttcic ctacgagcgc eigtctciga agcgcgcact gtgggccctg 6_
[0096] tgcticclgg gciccctggc Igigcigcig iglglgigca cggagcgcgi gcagiaeuic 660 Uccaciacc accaiglcac caagcicgac gaggiggcig ccicicagci iaccucccl 720 gclgicacgc tglgcaacci c-aacgagtic cgei?lagcc t-mgiciccm gtmigaeeig 780 ta teal gelg gcgagctgci ggccclgcic aacaacaggi algagaiacc agacacacag 840 aiggcagaig aaaagcagct ggagaiycig caggacaaag ccaacliccg cagcucaaa 900 ccmmmci teaacatgog cgagttctao gacegcgctg gccaegactt togcgacatg 960 cigcictcci gccacitccg cggcgaftgic igcagcgcig aagaciicaa ggiggicnc 1020 acacgciafg gaaagtgcta c-acgttcaac fx-cggccgcg aiggccgcc-c gcgc-ctgaag 1080 accaLgaagg gtggcauggg uaaigguclg gaaaicaigc tggacatcca gcaggacgag 1140 taccigcctg tgiggggcga gactgacgag acgicciicg aagcaggcai caaagigcag 1200 atccatagtc aggatgaacc tcctttcatc gaccagctgg gciiiggcgi ggccccaggc 1260 ttccagacct ttgtggcetg ceaggagcag cgectcatct aoctgoecce aecctggggc 1320 acctgcaaag ctgttaccat ggac-tccgat tiggatltet tcgactccta c-agcatc-act 1380 gcclgccgca tcgacigtga gacgcgciac ctggtggaga acigcaacig ccgcatggtg 1440 cacaIgccag gcgatgcccc aiacigtaci ccagagcagt acaaggagig igcagalcct 1500 gctctggact tcctggtgga aaaggaccag gagtaotgeg tgtgtgaaat gccttgcaac 1560 ctgacccgct atggcaaaga gctgtecatg gtoaagatcc eoageaaagc ctoagccaag 1620 lacclggcca agaagtlcaa caaalctgag caalacatag gcgagaacal cciggigctg 1680
[0097] gacatcitct iigaagicct caactatgag acca t tgaac agaagaaggc ciatgagait 1740 gcaggcctcc igggtgaca t cggcgaccag algggcclgl tcatcggcgc cagcaicclc 18?0 acggtgcigg agetctiigu clacgcciae gaggtcaitu agcacaagia a 1851 <2H)> 9 <lll> 580 <212> PIT <213> GLUT1蛋白与WUL融合表达 <400> 9 Met Gin Pro Scr Scr l,ys I.ys Leu Thr Gly Arg l.cu Mel Leu Ala Val 15 10 15 Gly Gly Ala Val Leu Gly Scr Leu Gin Phe Gly Tyr Asn 丁hr Gly Ya! 20 25 30 He Asn Ala Pro Gin Lys Val He Glu Glu Phe Tyr Asn Gin Thr Trp 35 4〇 45 al His Arg Tyr Clj Glu Scr lie Leu rro Thr flir Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Val Alt He Phe Ser ￥al Gly Gly Met He Gly Ser 65 70 75 80 Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met
[0098] 85 m 95 Leu Me I Mci Asu Leu Leu Ala Pile Val Scr Ala ￥a 1 Leu Met Oly Phe 100 105 1HI Scr Lys Leu Cly Lys Scr Phe (ilu Mei Leu lie Leu C1 y Arg Phe lie 115 120 125 lie (Hy Val ITyr (Jys fily Leu Thr Tlir Gly Phe Val Pro Mel 丁yr Val 130 135 140 Gly Gin ￥ai Ser Pro Thr Ala Leu Arg Oly Ala Leu Giy Tlir hm His 145 150 155 160 Gin Leu Gly He Val Va 1 Gly lie Leu lie Ala Gin Vai Phe 01 y Leu 165 m 175 Asp Scr 11 c Mel (?Iy Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu [,cu Scr 11c m) 185 Iffl lie Pile He Pro Ala Leu Leu Gin Cys lie Val Leu Pro Phe Cys Pro 195 200 205 61u Ser Pro Arg Phe hm Lm He Asn Arg Asn Glu (Hu hsn Arg Ala 210 215 220 Lys Ala Asp Leu Clu Asp Asn Trp Gin Thr Leu Asm Asp Asn Lc-υ Lys
[0099] 225 230 235 240 Val Me (ila Ly s A hi Asp \sn ΛI h Ala Gin Vul Lys Λ s p Λ1 n Leu Thr 9-0 2?$ Lys Mel Arg Ala Ala Ala Leu Asp Ala Gin Lys Ala Thr Pro Pro Lys 260 265 270 Leu G1 u Asp Lys Ser Pro Asp Ser Pro (j 1 u Met Lys Asp Phe 4rg His 275 280 285 Glj Phe Asp lie Leu fal Gly Gla lie Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala 290 295 300 Asn Clu Gly Lys Val Lys (;!υ Ala C1 n Ala Ala Ala Glu Cln Leu Lys 305 310 315 320 Thr Thr Arg Asn Ala Tyr He Gin Lys Tyr Leu Glu Lys Lys Val Thr 325 330 335 lie Leu Glu Leu Phc Arg Scr Pro A1 a Tyr Arg Gin Pro lie Leu lie 340 345 350 Ala Val Val Leu Cln Leu Scr Gln Gin Leu Ser Gly He Asn Ala Val 355 360 365 Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser lie Plie Glu Lys Ala Gly fal Gin 61n Pro
[0100] 37i 375 38β Val Tyr Ala Tin lie GJy Scr Gly He Vai Asti Thr Ala Phe Thr Va) 385 39? 395 400 Vul Scr Lou Phe Val VyJ Glu Arp Ala C1 y Arg Arg Thr Leu IIis Leu 405 410 415 lie Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala lie Leu Met Thr lie Ala 420 425 430 Leu Ala Lw Leu Glu Gift L_ Pro Trp Sar Tyr Leu Ssr lie Val 435 440 445 Ala lie Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Va1 Gly Pro Gly Pro lie 450 455 460 Pro Trp Phe I Ic Val Ala (Mu Leu Phe Scr <?ln (Sly Pro Arg Pro Ala 465 470 475 480 Ala He AUi Va 1 Ala Gly Phe Scr Asn Trp Thr Scr Asn Phe i!c Val 485 490 495 Gly Met Cys Phe <iln Tyr Val Glu Glii Lau Cyi Gly Pro Tyr Vil Phe 500 505 510 lie J 1c Phe Thr Va 1 Leu Leu Val Leu Phe Pile I Ic Phe Thr Tyr Phe-
[0101] 515 520 525 Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Tlir Phc Asp Glu 1 lo Ala Scr Gly 530 535 540 Phc Arg Ciln (ily GIy Ala Scr Gin Scr Asp Lys Thr Pro Glu Clu Leu 545 550 555 560 Pile His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gin fai His Bis His His His His 565 570 575 His His His His 580 <210> 10 <21l> 649 <212> PRT <213> GLCT1蛋白与T4L ?合表达 <400> 10 Met Asn lie Phe Glu Met Leu Arg lie Asp Glu G1y Leu Arg Leu Lys 15 10 15 Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Trr 取 Tlr lie Gly ile Gly Bis Leu 20 25 30 Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Giu Leu Asp Lys 35 40 45
[0102] Ala lie Gly Arg Asn Thr Asn Gly Val lie Thr Lys Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Lys Leu Phe Asn Gin Asp Val Asp Ala Alt Val Arg Gly lie Leu Arg 65 70 75 80 Asn Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg 85 90 95 Ala Ala Leu lie Asn Met Val Phc Gin Met Gly Glu Thr Gly Val Ala 100 105 110 Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gin Gin Lys Arg Trp Asp Glu 115 120 125 Ala Ala Val Asn Leu Ala Lys Scr Arg Trp Tyr Asn (iln Thr Pro Asn 130 135 140 Arg Ala Lys Arg Val lie Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala 145 150 155 160 Tyr Mci Glu Pro Scr Scr Lys Lys Leu Thr Gly Arc Leu Met Leu Ala 165 170 175 Val Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gin Phe Gly Tyr Asn Thr Gly 180 185 190
[0103] Val lie Asn Ala Pro Gin Lys Val lie Glu Giu Phe Tyr Asn Gin Thr 195 200 205 Trp Val His Arg Tyr Gly Glu Ser lie Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr 210 215 220 Leu Trp Scr Leu Scr Val Ala 11c Phc Scr Val Gly Gly Met lie Gly 225 230 235 240 Scr Fhe Ser Val G1y Leu Phc Va] Asn Arg Fhe (?1y Arg Arg Asn Scr 245 250 255 Met Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly 260 265 270 Phe Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu lie Leu Gly Arg Phe 275 280 285 lie lie Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phc Val Pro Mcl Tyr 290 295 300 Val Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg GIv Ala Leu Gly Thr Leu 305 310 315 320 His Gin Leu Gly lie val Val Gly lie Leu lie Ala Gin ￥al Phe Gly 325 330 335
[0104] Leu Asp Ser He Met C!y Am Lys Asp Leu Trp Ριυ Leu Leu Leu Ser 340 345 350 lie lie Phe lie Pro Ala Leu Leu Gin Cys He Val Leu Pro Phe Cys 355 360 365 Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu He Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg 370 375 380 Ala Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Tlir Ala Asp Val Thr His 385 390 395 400 Asp Leu Gin Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gin Met Mel Arg Glu Lys 405 410 415 Lys Val Thr lie Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gin Pro 420 425 430 He Leu He Ala Va 1 Va 1 Leu Gin Leu Ser Cln Gin Leu Ser Gly lie 435 440 445 Ass Aia Vai Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser lie Phe Glu Lys Ala Gly Val 450 455 460 Gin Gin Pro ￥al Tyr Ala Thr lie Gly Ser Gly He ￥al Asn Thr Ala 465 470 475 4M
[0105] Phe Tlir Val Val Scr Leu Pile Val Val 6Iu Arg Ala Giy Arg Arg Tlir 485 490 495 Leu His Leu I】c (;]y Leu Ala Gly Mel AU ffly Cys Ala lie Leu Mcl 500 505 510 Tlir lie A1 a Leu Ala Leu Leu Ghi Gin Leu Pro Trp Mel Ser Tyr Leu 515 520 525 Scr He Val Ala lie Fhe (ily Phe Val Ala Flic Fhc Glu Val Gly Pro 530 535 540 Gly Pro lie Pro Trp Phe lie Val Ala Glu Leu Phe Scr Gin Gly Pro 545 550 555 560 Arg Pro Ala Ala He Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Tip Tin Ser Asn 565 570 575 Phe lie Val Gly Met Cys Phe Gin Tyr Val Glu Gin Leu Cys Gly Pro 580 585 590 jr Val Phe lie lie rhe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe lie rhe 595 600 605 Thr Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Giy Arg Thr Phe Asp Glu He 610 615 620
[0106] Ala Scr Gly Phc Arg GIe Gly G1y Ala Scr Gin Scr Asp Lys Thr His 625 630 635 640 His His llis ills llis IHk Ills His llis 645 <210> 11 <211> 1743 <212> m <213> GLUT1蛋白与BML融合表达 <400> 11 alggagccca gcagcaagaa gcigacgggi cgcclcatgc iggccgiggg aggagcagig 60 ctlggciccc igcagi Ugg ciacaacaci ggagtcaica a igcccccca gaaggigaic 120 gaggagtict acaaccagac atgggiccac cgciaigggg agagcatcci gcccaccacg 180 clcaccacgc ictggiccci ctcagiggcc atciiuclg ugggggcai gaiiggcicc 240 uctctgigg gccuttcgi iaaccgci11 ggccggcgga attcaatgci gaigaigaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgetcatg ggcttetcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgcigatcc igggccgctt cateategg? gtgiacigcg gccigaccac aggetiegig 420 cccalgiatg igggigaagt gicacccaca gcccttcgig gggccciggg cacccigcac 480 cageigggea Icgicglcgg caiccicaic gcccagglgt leggedgga cieaUcaig 540 ggcaacaagg acctgtggcc ccigctgcig agcaicatci icatcccggc cctgcigcag _
[0107] tgcatcgtgc tgcccf tclg ccccgagag! ccccgcf fee tgc.icalcaa ccgcmtcgag 660 gagaaccggg ccaaggciga iciggaagac aaiLgggaaa cicigaacga caaicicaag 720 IcgagH aggclgacaa Igclgcacaa gicaaagacg eld gaccaa gH I gagggea 780 gcygcccigg acgcicagaa ggccaclcca cclaagcicg aggacaagag cccagy iage 840 ccigaaulgu aagaciticg gcnlggaiic gacnlicigg iggguc-agai igaigaiigca 900 cicaagclgg ccaatgaagg gaaaglcaag giiagcacaag cagccgciga gcagctgaag 960 accacccgga atgcaiacal icagaagiac- cigigagaaga uggicaecat cciggagcig 1020 ticcgctccc ccgcciaccg ccagcccaic cieategcig iggtgclgca gcigicccag 1080 cagcigicig gcatcaacgc igtciicui laciccacga gcaicucga gaaggcgggg 1140 gigeageage ctgtgtaigc caecatigge tccggialcg icaacacggc citcaciglc 1200 gigtegeigt itgiggtgga gegageagge eggcggae^c tgcacetcat iggcctegcL 1260 ggc-atggcgg gttgtgc-cat ac-tc-atgacc alcgcgctag cactgctgga gcagctacc-c 1320 tggaigtcct atetgageat cgtggccato tttggctltg tggeettett tgaagtgggt 1380 cciggcccca tcccaiggu catcgiggct gaactcuca gceagggiec acgiccagct 1440 gccaltgccg ttgcaggcit ciccaacigg accicaaali tcaiigiggg catgtgcttc 1500 cagtatgtgg igcaactgtg tggtccctac gtcticatca tcttcactgt gctcctggti 1560 ctgttcttca tet_eeta ettcaaagtt ectgagacta aaggeeggae ettegatgag 1620 aicgciiccg gciiccggca ggggggagcc agccaaagig acaagacacc egaggageig 1680
[0108] ilccaicccc igggggclga ucccaagig caccaccalc accaccaica ccaccalcai 174B taa 1743 <210> 12 <211> 1950 <212> RKA <213> GUm蛋白与T4L融合表达 <棚> 12 algaacalci icgaga igci eegulegac gagggeciCct ggi ig腿gxt i clalaaggac 60 aeagaggict attacaecat cggtattgft eatetcttga ctmgtcgm 12β gcagcaaaat ccgaacigga caaggccaic ggicgcaala caaaiggigi cailaclaag 180 gacgaagclg aaaagc-Lcl t caaccaggac gilgalgcag cigilcgcgg aaicctgcgc 24D aacgcaaagc tc-aagc-cggt uacgattci ttggacgccg ttcgccgtgc ggccugatt 300 aacaiggigl ticagatggg igaaaccgga gtigcaggai tiaccaaclc gcigaggatg 3.60 etgeaacaaa agagatggga cgaagocgct gtgaatctog ccaaatctag gtggtaoaao 420 cagacaccca atcgtgcgaa gagagtgata actacaticc gcaccggtac ttgggacgca 480 lauiggagc ccagcagcaa gaagcigacg ggtcgccica ige.igge-egi gggaggagca 540 gtgcttggct ccctgcagtt tggctacaac actggagtca tcaatgcccc ccagaaggtg 600 atcgaggagt Ictacaacca gacatggglc caccgctatg gggagagcat cctgcccacc 660 acgcicacca cgcictggtc ccicicagig gccaictut cigiiggggg caigaiiggc 720 tccttctctg tgggccttli cgttaaccgc tttggccggc ggaattcaat gctgaigatg 780
[0109] aaccigclgg ccltcgtglc cgccgigctc aigggciicl cgaaaciggg caagiccut 840 gagalgciga tcctgggccg ciicaicaic ggigigiaci gcggccigac cacaggciic 900 gigcccnigi atglgggtga agtglcaccc ac-Hgcccitc glggggccct ggge-acccig 960 aiceagelgg gc-a teg Leg t cggcaiccic aicgcct-ai*g igi icggcci ggaciccaic 1020 ai-gggcaaca aggacclgig gccccigcig dgagea!ca lei icaiccc ggcccigclg 1080 caglgcaicg tgcigcccii etgocecgag agteowg€t iccigcicai caaccgcaac 1140 gaggagaficc gggccaagag igigciaang aagcigcgcg ggacagciga egigacecal 1200 gacclgcagg agatgaagga agagagiegg aigalgalgc gggagaagaa gglcaccalc 1260 ClggagGLgl IGCgClCCCC CgCCiclCCgC CrlgCCClilCC iCHicgclgi ggigctgcag ? 320 clgicccagc agciglcigg caic-?acgcl |U c 11 c 1 a ? l acLcc^cgag ualciiciuig 1 380 aaggeggggg tgcagcagcc tgtgtatgcc aceattgget ccggiatcgt caacacggco 1440 ttcaeigtcg tgtcgctgtt tgtggtggag egageaggee ggcggaecct geaceicati 1500 ggccicgcig gcaiggcggg i tgigecaici cicaigacca icgcgc-iagc acigciggag 1560 cagctaccct ggatgiccla ielgagcaic giggccalcl tiggeiligi ggccilcilt 1620 gaaglgggic ciggccccai c-ccaigglic aiegiggeig anciclic^ig ccagggiccci 1680 cgtccagctg ccailgccgi igcaggctic tccaactgga- ccicaaail1 caligtgggc 1740 aigigciicc agiatgtgga gcuacigigi ggicc-ciacg icucalcai, c-iicac-tgig 1800 cicciggtlc tgttcilcat c-?icacclac licaaagiic cigagaciaa aggccggacc 1860
[0110] ttcgitgiga tcgcltocgg cttccggcag gggggageca gccasagtga caagacactc 1920 caecaicacc accatcacca ccatcaitaa 1950 <210> 13 <211〉 69 <212> DNA <213> fj物 <400> 13 cccaccatcg ggegeggate catgcatcac catcatcacc accatcacgc tgatctggaa 60 gacaa tIgg 69 <210〉 14 <211> 42 <212> 臟 <213> 引# <400> 14 cccctgaaag lacaggt111 ccaggiacti cigaatgiat gc 42 <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213>引物 <400> 15 gaaaacctgt actttcaggg gtccacactg cacggcctgg cccaca 46 <21()> 16
[0111] <211> 46 <212> IWA <213>引物 <400> 16 cu gguccg eaigccicga gi lac it gig oi laaigacc icgt ag 46 <2I0> 17 <211> 66 <212> WA <213> 麵 <400> 17 cccaccaLcg ggegcggale caLgcaLcac caicaicacc accalcacga aaaccigmc 60 ? i. l cag ?6 <210> 18 <2]l> 46 <212〉_.4 <213>引物 <400> 18 cuggiaccg caigccicga gi taciigig cl iaa igucc tcgiag 4ti <2HI> 19 <211> 69 <212> _A <213> 51* <_> 19 cccticca leg ggcgcgga It* ealgcalxae caicaicacc aeea 〖caeaa calcl iegag 60
[0112] atgetccgt 69 <21l)> 20 <211〉 43 <212> mk <213>引物 <400> 20 ccccigaaag tacaggtlit caiaigcgtc ccaagiaccg gig 43 <210> 2t <2il> 46 <212> imh <213〉引物 <4(J0> 21 gaaaaccigt aclitcaggg glccacactg cacggccigg cccaca 46 <210> 22 <2U> 46 <212> QU <213>引物 <400> 22 ctlggiaccg caigcclcga giincuglg cttaaigacc icglag 46 <210> 23 <211> 66 <212> 腸 <213>引物 <400> 23
[0113] ccetcctteg ggegcggtte cacgettetc citcatcaec ftceaceaega aateetgtte 60 iticag M <210> 24 <211> 46 <2J2> DMA <213> f_ <400> 24 citggtaeeg oaigceicga gtiaoitgig ciimigmc tcgtag 46 <210〉 25 <21I> 51 <212> DN'A <213>引物 <_> 25 cccgtttctg ctagcaagct taccatgaac atcttcgaga tgctccgtat c 51 <210> 26 <211> 4? <212> WA <213> fl# <400> 26 cagcttcttg ctgctgggct ccatatatgc gtcccaagta ccggtgc 47 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213>引物
[0114] <_0> 27 alggagccca gcagcaagaa gctg 24 <210> 28 <211> 53 <212> Wk <2]3>引物 <4m> 21 aigytggtgg tgatggtggt gatggtggtg tgtcttgtcs sttlggetgg etc 53 <210> 29 <211> 51 <212> 腦 <213>引物 <棚> 29 cccgtilcig ctagcaagci taccatgaac aiclicgaga tgctccgial c 51 <210> 30 <21i> 46 <212> DM <213>引物 <400> 30 ggtcgaggic gggggaicct laaigaiggi ggigaigglg gigaig 46 <210> 31 <211> 26 <212> 腦 <213>引物
[0115] <400> 31 gctgaictgg aagacaattg ggaaac 26 <2I0> 32 <211> 25 <212> DNA <2I3> 引物 <400> 32 cagglact ic tgaaip.taig ca t ic 25 <210> 33 <211> 48 <212> DNA <213>引物 <400> 33 cccgtticig ciagcaagci taccaiggag cccagcagca agaagctg 48 <210> 34 <211> 48 <212> DKA <213>引物 <400> 34 glttcccaat tgtcttccag aicagcctig gcccgglLcl cctcgttg 48 <210> 35 <211> 50 <212> 腦 <213>引物
[0116] <400> 35 gaalgcaiac attcagaagt acctggagaa gaagglcacc atcctggagc 50 <210〉 36 <211> 50 <212> DNA <213>引物 <400> 36 Higatggtgg igatggiggt gatggiggig cactigggaa tcagccccca 50 <210> 37 <211> 48 <212> DNA <213>引物 <400> 37 cccgittctg ciagcaagci taccaiggag cccagcagca agaagcig 48 <210> 38 <2U> 46 <212> DNA <213>引物 <400> 38 ggicgaggtc gggggaicci taatgatggt ggtgatggtg gtgatg 46
【权利要求】
1. 用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特征在于：为一种Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白；或 为一种T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白。
2. 如权利要求1所述的用于融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的蛋白片段，其特征在 于：所述Bril蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列和编码基因 序列分别如SEQ ID NO. 1. 1和SEQ ID NO. 2. 1所示； 所述T4L蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列和编码基因 序列分别如SEQ ID NO. 1. 2和SEQ ID NO. 2. 2所示。
3. 融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于：将如权利要求1或所述的 蛋白片段的氨基酸序列插入到离子通道蛋白或运输蛋白的N-末端、C-末端或者膜内环区 构建融合蛋白。
4. 如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于： 将所述Bri 1蛋白片段与ASIC1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO. 3. 1所示；或将所述T4L蛋白片段与ASIC1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO. 3. 2 所示。
5. 如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于： 采用所述Bril基因构建的ASIC1融合表达质粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 1所示； 或采用所述T4L基因构建的ASIC1融合表达质粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 2所示。
6. 如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于： 所述Bril蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ IDNO. 3. 3所示；或所述T4L蛋白片段与GLUT1进行融合表达，得到的融合白蛋氨基酸序列如SEQ ID NO. 3. 4 所示。
7. 如权利要求3所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于： 采用所述Bril基因构建的GLUT1融合表达质粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 3所示； 或采用所述T4L基因构建的GLUT1融合表达质粒，其基因序列如SEQ ID NO. 4. 4所示。
8. 如权利要求5或7所述的融合表达质粒，其特征在于：可以在昆虫细胞中表达或在 哺乳细胞中表达。
9. 如权利要求5所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于： 将权利要求5中SEQ ID NO. 4. 1或SEQ ID NO. 4. 2所示的基因序列的构建到表达载体 pFastBacl，PcDNA3. 1，PET21b上进行不同表达系统的蛋白质表达。
10. 如权利要求7所述的融合表达离子通道蛋白及运输蛋白的方法，其特征在于： 将权利要求7中SEQ ID NO. 4. 3或SEQ ID NO. 4. 4所示的基因序列的构建到表达载体 pFastBacl，PcDNA3. 1，PET21b上进行不同表达系统蛋白质表达。
【文档编号】C12N15/85GK104151401SQ201410247582
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】钱冬明, 蔡建华, 胡亮, 王萍, 王黎荣, 俞小波, 王丹晶, 曾秀红, 毛晨, 任德林 申请人:维亚生物科技(上海)有限公司