G蛋白偶联受体融合表达蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于：来源于真核生物，其中，所述G蛋白偶联受体融合表达蛋白选自APC蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白；或RGS16蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白；或DNJ蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白。本发明涉及的G蛋白偶联受体融合表达蛋白，通过把这些融合表达蛋白与G蛋白偶联受体进行融合表达从而达到增加G蛋白偶联受体表达产率及G蛋白偶联受体的体外稳定性，本发明所涉及的G蛋白偶联受体融合表达蛋白可广泛应用于G蛋白偶联受体的研究。
【专利说明】G蛋白偶联受体融合表达蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地是涉及G蛋白偶联受体融合表达蛋白。
【背景技术】
[0002]G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor, GPCR)是一大类膜蛋白受体的统称，这类受体的共同点是每个受体结构都包含七个α螺旋组成的跨膜结构域，这些结构域将受体分割为膜外N端(N-terminus),膜内C端(C-terminus), 3个膜外环(Loop)和3个膜内环，受体的膜外部分常有糖基化修饰位点，其肽链的C端和连接第5和第6个跨膜螺旋的胞内环上共同构成G蛋白(鸟苷酸结合蛋白)的结合位点，目前已经发现的G蛋白偶联受体已超过800个，这些G蛋白偶联受体可以被划分为六个类型，分别为.Λ类(或第一类)
(视紫红质样受体)；B类(或第二类)(分泌素受体家族)；C类(或第三类)(代谢型谷氨酸受体)；D类(或第四类)(真菌交配信息素受体)；E类(或第五类)(环腺苷酸受体)；F类(或第六类)(Frizzled/Smoothened 家族)[Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.63 (6):1256-1272，2003;and Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.67(5):1414-1425，2005]。分属其中的G蛋白偶联受体的基因序列之间没有同源关系。
[0003]不同的G蛋白偶联受体通过和相应的G蛋白(G protein)偶联可以对细胞外的多种刺激信号作出反应，在细胞内产生神经传递、味觉、嗅觉、视觉及细胞的新陈代谢、分化、增殖、分泌等一 系列生理效应。
[0004]与G蛋白偶联受体相关的疾病为数众多，并且大约40%的现代药物都以G蛋白偶联受体作为Μ，上千种已上市药物中接近一半是针对G蛋白偶联受体靶标，作用于G蛋白偶联受体的药物对疼痛、认知障碍、高血压、胃溃疡、鼻炎、哮喘等各类疾病均有良好的治疗作用。
[0005]由于G蛋白偶联受体在体内具有重要的生理功能，对G蛋白偶联受体的结构和功能研究一直是一个很重要的研究热点。
[0006]然而，天然的G蛋白偶联受体在体外并不稳定，很难得到高纯度的稳定的天然G蛋白偶联受体，近年来，有多个研究小组报道了不同的方法用于解决G蛋白偶联受体的稳定性，包括①.在G蛋白偶联受体的膜内环区3(ICL3)和N-末端插入大肠杆菌T4溶菌酶，这种技术先后成功应用于腺苷A2a受体，CXCR4受体，b2肾上腺素能受体，D3多巴胺受体，SlPl受体等多个受体的研究中，通过用T4溶菌酶改造后，这些受体都能够被很好地表达，得到了较高产率的蛋白，并最终得到了高分辨率的晶体结构[Rasmussen，S.G.F.et.al.Crystal structure of the human beta2adrenergic G-protein-coupled receptor, Nature450:383-387, 2007;Wu B.et.al.Structures of the CXCR4chemokine GPCRwith small-molecule and cyclic peptide antagonists Science330:1066—1071，2010.ChienjE.Y.et.al.Structure of the human dopamine D3receptor in complex witha D2/D3selective antagonist,Science330:1091-1095，2010.XujF et.al.Structureof an agonist-bound human A2A adenosine receptor，Science332:322-327，201Land Hanson, M.A.et.al.Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptorScience335:851-855, 2012.ZoujY.et.al.N-terminal T41ysozyme fusion facilitatescrystallization of a G protein coupled receptor Plos One7:e46039_e460392012]；②.在G蛋白偶联受体的膜内环区3(ICL3)或N-末端插入细菌BriL蛋白，这种技术在腺苷A2a受体，nociceptin/orphanin FQ受体，5HTlb, 5HT2b和SMO受体的结晶研究中获得了成功[Liu, W.et.al.Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodiumions, Science337:232-236, 2012.Thompson, A.A.et.al.Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic Nature485:395-399, 2012.Wang, C.et.al.Structural Basis for Molecular Recognition at Serotonin ReceptorsScience2013.Wang, C.Structure of the human smoothened7TM receptor in complexwith an anti tumor agent Nature2013] !③.通过对G蛋白偶联受体进行突变筛选，找到不影响结构和功能但又能增加稳定性的一些突变，从而在表达过程中得到稳定的G蛋白偶联受体，这个方法在腺苷A2a受体，bl肾上腺素能受体的研究中均获得了成功，实现了受体蛋白的高表达，拿到了高纯度的受体蛋白，并最终获得了受体蛋白的高分辨率晶体结构[Lebon, G.et.al.Agonist-bound adenosine A2A receptor structures revealcommon features of GPCR activation.Nature474:521, 2011.ffarne, A.et.al.Structureof a betal-adrenergic G-prote in-coup led receptor Nature454:486, 2008.]。④.利用抗体稳定G蛋白偶 联受体构象，利用这个技术斯坦福大学的Brain实验室成功得到了 b2肾上腺素能受体的高分辨晶体结构[Bokoch, Μ.P.Ligand-specific regulation of theextracellular surface of a G-protein-coupled receptor Nature463:108-112，2010]。
[0007]由上可知，采用插入其它蛋白的方法来增加G蛋白偶联受体的稳定性的研究目前都集中在应用原核蛋白和受体进行融合表达，而没有人研究来源于真核细胞蛋白和G蛋白偶联受体的融合表达。实际上，G蛋白偶联受体基本都存在于真核生物中，因此，如果能够找到一些来源于真核生物的蛋白来稳定G蛋白偶联受体或许对于G蛋白偶联受体的某些功能研究具有一些额外的帮助。
[0008]另外，目前所广泛应用的融合表达G蛋白偶联受体的思路是尝试使用不同的融合蛋白和G蛋白偶联受体融合，最后筛选得到一个能够较好表达G蛋白偶联受体的蛋白，目前常用的几种融合蛋白如BriI和T4L蛋白等能较好的解决一些G蛋白偶联受体的表达，但对有些G蛋白偶联受体的表达则帮助不大，需要探索新的融合蛋白。
【发明内容】
[0009]本发明提供了几种新型的融合蛋白，可以被应用于G蛋白偶联受体的表达，从而，为G蛋白偶联受体的融合表达提供了更多的选择和尝试的方法。
[0010]为实现上述目的，本发明提供了一种来源于真核细胞的G蛋白偶联受体融合表达蛋白，即:APC、RGS16和DNJ蛋白片段及其成功的应用于和G蛋白偶联受体的融合表达。
[0011]本发明提供的G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:来源于真核生物，具体为APC蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白、RGS16蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白、DNJ蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白中的一种。
[0012]其中，APC蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，蛋白片段的编码基因序列如SEQ ID N0.4所示。
[0013]RGS16蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示，蛋白片段的编码基因序列如SEQ ID N0.5所示。
[0014]DNJ蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.3所示，蛋白片段的编码基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]在本发明中，为了提高G蛋白偶联受体稳定性，通过对G蛋白偶联受体进行改造，在其N-末端，C-末端或膜内环区3插入APC，RGS16和DNJ等蛋白片段片段构建融合蛋白，从而解决了 G蛋白偶联受体稳定性的问题。
[0016]针对本发明主要涉及的三种蛋白片段，在本发明中，采用腺苷A2a蛋白与所述APC蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.10所不。
[0017]采用腺苷A2a蛋白与RGS16蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.11所示。
[0018]还采用腺苷A2a蛋白与DNJ蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.12所示。
[0019]其中，上述如SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列可被应用于A2a腺苷蛋白的表达。
[0020]上述如SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.1USEQ ID N0.12所示的基因序列可被构建到表达载体pFastBacl、PcDNA3.l、PET21b中进行A2a腺苷蛋白的表达。
[0021]值得指出的是，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含APC, RGS16和DNJ等蛋白片段的G蛋白偶联受体融合表达质粒，这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等，所构建的G蛋白偶联受体融合表达基因序列可以有效地连接到不同表达载体的适当启动子上，以指导mRNA合成。
[0022]另外，上述构建好的质粒可以用本领域技术人员熟知的常规技术转染或转化到细胞，如可以用Bac-to-Bac技术把含融合表达基因的PFastBac载体转化到SF9细胞中进行表达，转化后细胞的培养和病毒的收集和传代等方法均为本领域技术人员所熟知的常规技术。
[0023]此外，本发明构建的融合蛋白既可以在昆虫细胞如SF9、SF21、HiFive中表达，还可以在酵母中和哺乳动物细胞如:293，CHO等细胞中进行表达，具有广泛的应用范围。
[0024]发明的作用与效果
[0025]本发明提供了三种来源于真核生物的G蛋白偶联受体融合表达蛋白(SP、APC, RGS16和DNJ蛋白片段)，并进一步的提供这些真核生物蛋白的氨基酸序列和基因编码序列等信息。
[0026]另外，本发明提供上述新型G蛋白偶联受体融合表达蛋白在A2a腺苷受体的应用，即、把上述APC，RGS16和DNJ等蛋白片段插入到G蛋白偶联受体的不同区域(N-末端，C-末端或者膜内环 3)构建融合蛋白，并提供这些融合白的氨基酸序列和基因编码序列等信肩、O
[0027]本发明通过把这些新型融合表达蛋白与G蛋白偶联受体进行融合表达，从而达到增加G蛋白偶联受体表达产率及G蛋白偶联受体的体外稳定性。[0028]此外，本发明所涉及的新型G蛋白偶联受体融合表达蛋白可广泛应用于G蛋白偶联受体的研究。在本发明中，构建了一个A2a腺苷受体融合表达质粒并提供了该融合表达质粒在昆虫SF9细胞中表达的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]附图1a为A2a_APC融合蛋白纯化后的电泳检测图；
[0030]附图1b为A2a_RGS16融合蛋白纯化后的电泳检测图；
[0031 ]附图1c为A2a_DNJ融合蛋白纯化后的电泳检测图；
[0032]附图2a为A2a_APC融合蛋白在底物Adenosine存在时的热稳定性检测结果；
[0033]附图2b为A2a_RGS16融合蛋白在底物Adenosine存在时的热稳定性检测结果；
[0034]附图2c为融合蛋白在底物Adenosine存在时的热稳定性检测结果；
[0035]附图3a为A2a_APC融合蛋白的UPLC检测图谱；
[0036]附图3b为A2a_RGS16融合蛋白的UPLC检测图谱；
[0037]附图3c为A2a_DNJ融合蛋白的UPLC检测图谱。
【具体实施方式】
[0038]实施例1:融合蛋白的基因合成
[0039]化学合成
[0040] (I)、APC蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.4所示。
[0041 ] (5 ’ TCCACCGGCTACCTGGAGGAGCTGGAGAAGGAGCGCTCCCTGCTGCTGGCCGACCTGGACAAGGAGGAGAAGGAGAAGGACTGGTACTACGCCCAGCTGCAGAACCTGACCAAGCGCATCGACTCCCTGCCCCTGACCGAGAACTTCTCCCTGCAGACCGACATGACCCGCCGCCAGCTGGAGTACGAGGCCCGCCAGATCCGCGTGGCCATGGAGGAGCAGCTGGGCACCTGCCAGGACATGGAGAAGCGCGCCCAGCGCCGCATCGCCCGCATCCAGCAGATCGAGAAGGACATCCTGCGCATCCGCCAG3’)，
[0042]正向引物为:(5’ TTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGTCCACCGGCTACCTGGAGG3，)，
[0043]反向引物为:(5’ CAGTGTGGACCGTGCCCGCTCCTGGCGGATGCGCAGGATGT3，)，
[0044]用PCR反应获得APC蛋白片段基因。
[0045]参考人类基因密码子，化学合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0046]正向引物(5，TATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGCGCCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0047]反向引物(5’ CCTCCAGGTAGCCGGTGGACAGCTGTCGTCGCGCCG3，)，
[0048]用PCR反应获得基因A2a (2-208)。
[0049]正向引物(5，GAGCGGGCACGGTCCACACT3’ )， [0050]反向引物(5’ TTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3 ’ )，
[0051]用PCR 反应获得基因 A2a (219-316)。
[0052]A2a (2-208) _APC_A2a (219-316)参照以上原理进行基因合成，正向引物引入限制性酶切位点EcoRI，反向引物引入限制性酶切位点XhoI和终止密码子。
[0053](2)、RGS16蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.5所示。
[0054](5，AACTTCTCCGAGGACGTGCTGGGCTGGCGCGAGTCCTTCGACCTGCTGCTGTCCTCCAAGAACGGCGTGGCCGCCTTCCACGCCTTCCTGAAGACCGAGTTCTCCGAGGAGAACCTGGAGTTCTGGCTGGCCTGCGAGGAGTTCAAGAAGATCCGCTCCGCCACCAAGCTGGCCTCCCGCGCCCACCAGATCTTCGAGGAGTTCATCTGCTCCGAGGCCCCCAAGGAGGTGAACATCGACCACGAGACCCACGAGCTGACCCGCATGAACCTGCAGACCGCCACCGCCACCTGCTTCGACGCCGCCCAGGGCAAGACCCGCACCCTGATGGAGAAGGACTCCTACCCCCGCTTCCTGAAGTCCCCCGCCTACCGCGACCTGGCCGCCCAGGCCTCCGCCGCCTCC3，),
[0055]正向引物为:(5，GAGAACCTGTACTTCCAATCCAACTTCTCCGAGGACGTGCT3’)，
[0056]反向引物为:(5’ ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGGAGGCGGCGGAGGCCTG3，)，
[0057]用PCR反应获得RGS16蛋白片段基因。
[0058]参考人类基因密码子，化学合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0059]正向引物(5’ CCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0060]反向引物(5，TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3，)，
[0061]用PCR反应获得基因A2a (2-316)。
[0062]RGS16 (54-188) _A2a (2-316)参照以上原理进行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位点EcoRI，反向引物引入限制性酶切位点XhoI和终止密码子。
[0063](3)、DNJ蛋白片段其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.6所示。
[0064](5，GGCTACTACGACGTGCTGGGCGTGAAGCCCGACGCCTCCGACAACGAGCTGAAGAAGGCCTACCGCAAGATGGCCCTGAAGTTCCACCCCGACAAGAACCCCGACGGCGCCGAGCAGTTCAAGCAGATCTCCCAGGCCTACGAGGTGCTGTCCGACGAGAAGAAGCGCCAGATCTACGACCAGGGCGGC3，)，
[0065]正向引物为:(5，GAGAACCTGTACTTCCAATCCGGCTACTACGACGTGCTGG3’)，
[0066]反向引物为:(5，ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGCCGCCCTGGTCGTAGATC3，)，
[0067]用PCR反应获得DNJ蛋白基因。
[0068]参考人类基因密码子，化学合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0069]正向引物(5，CCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0070]反向引物(5，TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3，)，
[0071]用PCR反应获得基因A2a (2-316)。
[0072]DNJ (6-68) _A2a (2-316)参照以上原理进行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位点EcoRI，反向引物引入限制性酶切位点XhoI和终止密码子。
[0073]其中，PCR反应条件为:在 50 μ L 反应体系中(PCR Buffer, 1.5mM MgS04, 200 μ MdNTPs)加入扩增引物各0.2 μ Μ。充分混匀后开始PCR循环:94°C变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，68 °C延伸2分钟，共进行30个循环，最后在68°C保温10分钟。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收后用于克隆。
[0074]实施例2:本发明融合蛋白质粒构建
[0075]将实施例1中获得的PCR片段与经过限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切的载体pFastBacl (购自Invitrogen)进行连接。连接产物转化于感受态大肠杆菌DH5 α中，体积不应超过感受态细胞的10%，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟，将管放入42°C水浴，定时60秒热休克，快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却，每管加入400 μ I LB培养基，37°C缓摇60分钟，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，低速离心2分钟，去上清，留约100 μ I培养基在离心管内，重悬菌体，用玻璃铺菌器将菌液在琼脂板上铺匀。将平板倒置于37°C恒温培养箱，12-16小时后可出现菌落。涂板后挑取阳性克隆进行鉴定。
[0076] 实施例3:本发明融合蛋白的表达
[0077]将实施例2中获得的重组质粒转化至DHlOBac E.coli感受态细胞中，体积不应该超过感受态细胞的5%，轻轻旋转几次混匀内容物。冰浴30分钟；将管放入42°C水浴，定时90秒热休克；快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却；每管加入800ulLB培养基，37°C，缓摇4小时，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；用玻璃铺菌器将30ul菌液在抗性琼脂板上铺匀；将平板倒置于37°C恒温培养箱中，30-48小时后可出现蓝白斑菌落；挑取阳性白斑单菌落接入5ml抗性LB，缓摇12-16h，取菌液进行PCR鉴定，结果显示杆粒重组正确。将重组杆粒经转染试剂转染到昆虫细胞中，4-5天后收取细胞上清液作为第一代杆状病毒。用第一代杆状病毒感染昆虫细胞72小时后，获得第二代病毒，用于组合多肽的表达；使用第二代病毒1:100体积比感染密度为2xl0~6/ml的昆虫细胞sf9，继续培养72小时后，离心收细胞，PBS洗一遍细胞。
[0078]实施例4:融合蛋白纯化
[0079]用200ml 预冷的裂解液(IOmM HEPES ρΗ7.5，IOmM MgC12, 20mMKCl)重悬 IL 细胞到200ml中，用匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后用超速离心机离心45分钟，去掉上清，重复洗涤步骤3次，再用高盐溶液重复洗涤步骤三次，提取好的细胞膜用加甘油的裂解液溶解并用液氮进行速冻，储存在-80C冰箱。在冰上融化解冻细胞膜，并入茶碱和碘乙酰胺分别至终浓度为4mM，2mg/ml，在冰上放置30分钟后按照每升细胞膜加入100mL溶膜缓冲液比例加入溶膜缓冲液，并继续在冰上放置3小时溶膜，用超速离心机在160，OOOg离心力下离心40分钟，弃掉沉淀，上清与Iml用平衡缓冲液平衡好的Talon IMAC resin 一起孵育过夜，次日，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移到自流柱里。依次用冲洗缓冲液I (25mMHepes pH7.5;800mMNaCl;10%glycerol;0.05%DDM;0.001%CHS;4mM theophylline)洗 10 个柱体积，冲洗缓冲液 2 (25mMHepes pH7.5; 800mMNaCl; 10%glycerol; 4mM theophylline;0.05%DDM;0.001%CHS;25mM Imid; IOmM MgCl2;8mM ATP)洗 10 个柱体积，冲洗缓冲液3(25mMHepes pH7.5;800mMNaCl;10%glycerol;4mM theophylline;0.05%DDM;0.001%CHS;IOmM MgC12;10mM ATP)洗5个柱体积，然后用5个柱体积的洗脱缓(缓冲液I加入300mM咪唑)冲液洗脱目的蛋白，纯化后得到的目的蛋白保存在-80°C，图1为三种融合蛋白的电泳检测结果。
[0080]从得率来看，经纯化后3种膜蛋白的得率都超过lmg/L细胞，具有较高的产率。 [0081]实施例5:融合蛋白热稳定性测试
[0082]打开Cary Eclipse荧光分光光度计，预热30分钟，吸取130ul蛋白溶液，加入
0.13ul的CPM荧光染料，充分混匀，将混匀好的样品，加入到石英比色皿，放入样品架。启动Cary Eclipse软件组中的Thermal程序,设置激发波长(387nm),光栅缝隙为2.5nm;吸收波长(463nm)，光栅缝隙为5nm，从20°C至90°C每分钟上升1°C，运行程序，导出测量数据，用软件进行Sigmanoid拟合,计算样品的Tm值。
[0083]按照上述步骤方法，分别检测了三种融合蛋白在和A2a腺苷受体相结合之后的热稳定性值，其结果如图2所示。
[0084]由图可知，A2a-APC融合蛋白，其Tm值为50.8 °C ;A2a_RGS16融合蛋白，其Tm值为55.60C ;A2a-DNJ 融合蛋白，其 Tm 值为 52。。。
[0085]3个融合蛋白和A2a腺苷受体相结合以后的热稳定性值都超过了 50°C，说明三种蛋白都具有较好的热稳定性。
[0086]实施例6:融合蛋白均一性检测
[0087]采用Waters公司的Acquity H-Class Bio UPLC系统进行检测,检测所用柱子为Sepax SEC250 分子筛柱，上样前先用平衡缓冲液(25mM HEPES, 500mM NaCl, 2%glycerol, 0.05DDM, 0.0P/oCHS, pH7.5)洗柱子至基线没有太大变化止，然后将待检测的样品加入专用的96孔板中上样，积分处理采用仪器自带的软件。
[0088]按照上述方法对三种融合蛋白分别进行了检测，结果如图3所示，三种融合蛋白均一性都很好，能够检测到融合蛋白单体峰，且单体占蛋白样品的大部分。
【权利要求】
1.一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:来源于真核生物， 其中，所述G蛋白偶联受体融合表达蛋白选自APC蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白； 或RGS16蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白； 或DNJ蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白。
2.如权利要求1所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述APC蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如权利要求2所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的编码基因序列如SEQ ID N0.4所示。
4.如权利要求2所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白与所述APC蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
5.如权利要求2所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白与所述APC蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.10所示。
6.如权利要求1所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述RGS16蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
7.如权利要求6所述 的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的编码基因序列如SEQ ID N0.5所不。
8.如权利要求6所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白与所述RGS16蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
9.如权利要求6所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白与所述RGS16蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.11所示。
10.如权利要求1所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述DNJ蛋白片段或与该片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
11.如权利要求10所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的编码基因序列如SEQ ID N0.6所示。
12.如权利要求10所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白与所述DNJ蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示。
13.如权利要求10所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白与所述DNJ蛋白进行融合表达，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.12所示。
14.如权利要求1-13任一所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:在G蛋白偶联受体的N-末端、C-末端或膜内环区3插入所述APC、RGS16或DNJ蛋白片段构建融合蛋白。
15.如权利要求14所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述融合蛋白可以在昆虫细胞中、酵母细胞中和哺乳动物细胞中进行表达。
16.如权利要求4或8或12任一所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述如SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列可被应用于A2a腺苷蛋白的表达。
17.如权利要求5或9或13任一所述的一种G蛋白偶联受体融合表达蛋白，其特征在于:所述如SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12所示的基因序列可被构建到表达载体pFastBacl、 PcDNA3.l、PET21b中进行A2a腺苷蛋白的表达。
【文档编号】C12N15/62GK104017082SQ201310577289
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】蔡建华, 沈坚, 姜帆, 李娜, 魏文韬, 曾秀红, 苏晓燕, 韩敏, 任德林, 毛晨 申请人:维亚生物科技(上海)有限公司