以红曲菌丝体为原料提取辅酶q10的工艺及生产方法
【专利摘要】本发明涉及以红曲菌丝体为原料提取辅酶q10的工艺及生产方法，红曲菌丝体是指用其他不同红曲霉菌株经固态，或液态发酵方法制备的，提取了红曲红色素后的红曲菌丝体。本发明采用大米等原料用红曲霉经液体深层发酵后，产生的红曲发酵产物，经用60～70％乙醇提取红曲红色素后，剩余的红曲霉菌丝体具有重要的人体细胞也存在的，具有重要保健功能的辅酶Q10成分，该成分通过采用超声破碎法提取后，辅酶q10的产量可以达到50～100mg/kg，具有重要的工业开发价值。
【专利说明】以红曲菌丝体为原料提取辅酶q10的工艺及生产方法
[0001]【技术领域】本发明涉及采用红曲菌丝体为原料提取辅酶qlO的工艺及生产方法。
[0002]【背景技术】
[0003]红曲在中国已有一千多年的生产、应用历史，它是生产红曲酒、红曲米、功能性红曲和天然色素的主要菌种。近年来，随着人们对合成食品添加剂和化学药物对人体毒副作用的认识，世界各国掀起了食用绿色食品和使用天然药物的热潮，红曲作为药食兼用的天然制品，引起了极大的关注。自1979年，日本学者远藤章从红曲霉(monaseusruber)中发现洛伐他汀生理活性物质后，引起全世界科学家的关注，1980~1990年代红曲功能性研究达到高峰，红曲的降血脂、降胆固醇、降血压、降血糖、抗菌性等功能相继被发现。美国默克公司开发成功第一个用于临床的洛伐他汀调血脂药物，于1987年上市，目前他汀类药物己成为高血脂、冠心病人的首选药物，降脂药已成为世界第二大治疗药物。红曲目前的生产工艺主要是为提取红曲红色素而设计，一般均是选择优质大米为原料，采用现代生物技术分离出优质的红曲霉菌，再经液体深层发酵，产生红曲发酵产物，这些产物经过脱水，压干等工艺，用60~70 %乙醇提取红色素，通常这些提取工艺提纯红色素后连红曲中降血脂成分洛伐他汀也一起提走，剩下的渣留下来的洛伐他汀极少或几乎没有，这一生产过程中会产生大量的红曲菌丝废渣，这些废渣一般视为无用废弃物丢弃掉，这不仅造成了环境的污染，更是对资源的极大浪费。我们在对东莞天益生物科技公司生产的两批红曲霉废渣的检测中发 现，其废渣虽然没有找到能特异性对抗抑制HMC-CoA还原酶活性的洛伐他汀，但红曲霉废渣中的还有脂肪酸和多糖类成分，采用这些废渣进行降血脂和预防骨质疏松的动物实验，意外发现这些废渣的提取物也有很好的降血脂作用和预防骨质疏松的作用，我们分别申请了国家发明专利《红曲渣产品在制备降血脂保健食品方面的应用》，(专利号ZL201010003099.2，授权证书号第1144784)，《红曲菌丝体提取物在制备预防骨质疏松保健食品及药品的应用》(专利号ZL201110269850.8，授权证书号第1092336)，已经获得国家知识产权局的授权。对这些红曲菌丝体的有效成分的进一步研究，我们发现这些提取了红曲红色素之后的菌丝体还含有重要成分辅酶qlO，这在目前所有的研究文献中均没有见报道。
[0004]辅酶QlO是一种脂溶性抗氧化剂，是人类生命不可缺少的重要元素之一，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上广泛用于心血管系统疾病，国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。辅酶QlO最早于1957年在美国被发现，1978年英国爱丁堡大学彼得?麦克博士因在研究辅酶QlO与细胞能源关系方面的贡献获得诺贝尔奖。二十世纪八十年代初期日本实现了从烟叶中提取茄呢醇为原料合成生产辅酶Q10，至使辅酶QlO成本大幅度下降，这对于辅酶QlO的应用、普及和推广起到了重要的推动作用。半化学合成法技术上比较成熟，已实现了工业化，产品成本低，价格适中。但是使用半化学合成法生产的产品虽然在价格上有优势，但在使用上比用生物提取法生产的产品有较大的差距。原因在于生物提取法生产的是天然的、有机的产品，易于被人体吸收转化，而化学合成法生产的是人工化学合成的有机产品，生物活性极差，不易被人体吸收，难以充分发挥辅酶QlO的药理作用。关于辅酶QlO化学合成方法一直是国内外研究的热点，近半个世纪来，发达国家已实现了微生物发酵法生产辅酶Q10，近几年微生物发酵提取法得到了长足的发展，这种全新的生物工程方法，既综合了生物提取工艺和化学合成工艺两种方法的优点，又克服了它们的缺点，因此是最令人瞩目的有希望实现工业化的方法。
[0005]目前，辅酶QlO的制备方法主要有3种:提取分离法、化学合成法、生物合成法。提取分离法提取分离法主要从动物肝脏、心肌等和植物含油种籽或嫩芽、嫩叶中提取。据文献报道.经醇碱皂化法从猪心渣和牛心肌渣中提取辅酶QlO测定含量分别为75mg/kg和73.3mg/kg，通过皂化法提取罗非鱼肝脏辅酶QlO的含量为34mg/kg。用10% KOH-甲醇醇碱皂化法提取碱蓬辅酶QlO含量为63mg/kg。用大豆油提取辅酶QlO可以达到90mg/kg。提取法是现代生物工程中较为传统的生产方法，它的生产成本较高，原料也不易得到，从废弃材料再利用提取辅酶Q以降低制备成本是目前十分热门的研究课题。辅酶QlO的化学合成法可分为全化学合成法和半化学合成法2种。全化学合成法是指不以来自烟草等的茄尼醇为原料，完全通过化学方法获得辅酶QlO侧链的合成方法。该方法原料价廉易得，产物区域选择性和立体选择性高，但是侧链的构建需要多次耦合，总收率低，难以实现工业化。半化学合成法主要有侧链直接引入法和侧链延长法，该方法均需要以天然茄尼醇为关键原料合成辅酶Q10，由于精品及纯品茄尼醇的价格十分昂贵，造成化学合成辅酶QlO成本高昂，同时具有合成步骤多、副产品多、手性物质分离困难等缺点，因此，化学合成法在工业生产中受到一定限制。生物合成法是利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需物质的技术过程。目前，辅酶QlO的生物合成方法包括利用植物细胞培养和微生物细胞发酵两种方式。植物细胞培养主要是以烟草组织为材料，通过愈伤诱导、悬浮培养，产生生长速度快、辅酶QlO含量高的烟草悬浮培养细胞。有试验结果表明，在适合的培养条件下NC89烟草细胞产量和辅酶QlO含量分别为16.653g/L和14.780mg/L。国内从事辅酶QlO植物细胞培养的单位只有少数几家，也都处于初步研究阶段，还没有进入中试和工业化生产，1977年，日本首次实现了微生物发酵法工业化生产辅酶Q10，应用于产辅酶QlO的主要菌种有光合细菌、土壤杆菌、红假胞菌、裂殖酵母等。该方法具有原料廉价丰富.产物分离过程相对简单，不存在手性问题等优点，近年来国内已有部分企业采用该方法生产，并申请了相关专利，例如安徽省丰原药业集团采用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaeiens)高密度发酵生产辅酶Q10，但是微生物发酵法在开发新的菌株以提高发酵效率、改进后期提纯等方面还需要不断发展。从每种生产方法的特点来看，生物合成法必然是未来发展的主要趋势，也是当前辅酶QlO生产方法的研究热`点。
[0006]我们的研究发现，红曲菌丝体经过我们采用超声破碎法提取以后，辅酶QlO的含量可以达到50~100mg/kg，与前面提到的猪心渣和牛心肌渣等原料提取方法相比，有十分有利的优势，是一个很有工业开发价值的新发明。
【发明内容】
[0007]发现采用大米等原料用红曲霉经液体深层发酵后，产生的红曲发酵产物，经用60~70%乙醇提取红曲红色素后，剩余的红曲霉菌丝体具有重要的人体细胞也存在的，具有重要保健功能的辅酶QlO成分，该成分通过采用超声破碎法提取后，产量可以达到50~100mg/kg，具有重要的工业开发价值。
[0008]本发明提到的可用于提取辅酶QlO的红曲菌丝体原料可以通过下述方法:方法1:取大米等原料用红曲霉经液体深层发酵7到10天后，产生的红曲霉发酵的液体产物，通过压榨机把水分压去，然后，60~70 %乙醇提取红色素，提取完红色素的渣，烤干，粉碎为细粉，即可。
[0009]方法2:取大米等原料用红曲霉经液体深层发酵7到10天后，产生的红曲霉发酵的液体产物，通过压榨机把水分压去，然后，60~70 %乙醇提取红色素，提取完红色素的渣，烤干，按每公斤加入I %的醋酸0.1~0.5升，在25°C室温下维持24小时以上，按总重量5~8倍加水提取，提取两次，每次I小时，回收两次提取液。浓缩为干膏，粉碎为细粉，室温保存即可。[0010]方法3:取大米等原料用红曲霉经液体深层发酵7到10天后，产生的红曲霉发酵的液体产物，通过压榨机把水分压去，然后，60~70 %乙醇提取红色素，提取完红色素的渣，烤干，按每公斤加入I %的碳酸氢钠0.1~0.5升，在25°C室温下维持24小时以上，按总重量5~8倍加水提取，提取两次，每次I小时，回收两次提取液，浓缩为干膏，粉碎为细粉，室温保存即可。
[0011]方法4:取大米等原料用红曲霉经液体深层发酵7到10天后，产生的红曲霉发酵的液体产物，通过压榨机把水分压去，然后，60~70 %乙醇提取红色素，提取完红色素的渣，烤干，按总重量5~8倍加水提取，提取两次，每次I小时，回收两次提取液。浓缩为干膏，粉碎为细粉，室温保存即可。
[0012]本发明提到的红曲菌丝体，也包括用其他不同红曲霉菌株经固态，或液态发酵方法制备的红曲菌丝体。
[0013]超声破碎法从红曲菌丝体提取辅酶qlO的工艺:称取上述方法获得的红曲菌丝体适量，加入丙酮，冰浴中超声破碎，6000r/min离心15min (4°C )。取上清液，35°C旋转蒸发浓缩，再加入50ml石油醚溶解；用超纯水60ml洗涤至中性，取石油醚层，加入5g无水硫酸钠，干燥至液体澄清。过滤，滤液旋转蒸发仪(37°C )浓缩至干，挥发完全，加入无水乙醇IOml溶解，放-20°C冰箱冷冻析出胆固醇等杂质，过滤，回收乙醇，即得。用HPLC检测本法提取的辅酶qlO的含量，检测条件:检测波长为275nm、进样量为10 μ 1、柱温30°C、流动相为甲醇:乙醇(1:1)、流速为lml/min，与标准品比较，用本方法每克红曲菌丝体提取的辅酶qlO为 80 ~100 μ g,即 80 ~100mg/kg。
[0014]红曲菌丝体提取辅酶qlO还可采用超临界CO2萃取工艺进行提取，当萃取温度300C，萃取压力22MPa，萃取1.5h，CO2流量4L/h时，红曲菌丝体提取辅酶qlO提取率也可达到较高的率。
[0015]本发明按上述方法提取的红曲菌丝体提取物，可作为饼干添加剂加入饼干的生产配方中，生产出含有红曲菌丝体辅酶qlO的饼干食品或保健食品，供有患有高血脂，骨质疏松疾病的患者作为健康食品应用。在饼干产品的添加量在5~30%范围，以10~20%为佳。
[0016]本发明按上述方法提取的红曲菌丝体的辅酶qlO，可作为饮料添加剂加入饮料的配方中，生产出含有红曲提取物的饮料，供有患有高血脂，骨质疏松疾病的患者作为健康食品应用。在饼干产品的添加量在5~30%范围，以10~20%为佳。
[0017]【具体实施方式】:
实施例一:[0018]取采用大米等原料用红曲霉经液体深层发酵后，产生的红曲发酵产物，经用60~70%乙醇提取红曲红色素后，剩余的红曲霉菌丝体作为提取辅酶qlO的原料，准确称取5g菌丝体，加入丙酮，冰浴中超声破碎，6000r/min离心15min(4°C )。取上清液，35°C旋转蒸发浓缩，再加入50ml石油醚溶解；用超纯水60ml洗漆至中性,取石油醚层,加入5g无水硫酸钠，干燥至液体澄清。过滤，滤液旋转蒸发仪(37°C)浓缩至干，挥发完全，加入无水乙醇1Oml溶解，放-20 V冰箱冷冻析出胆固醇等杂质，过滤，回收乙醇，即得。该产品通过HPLC检测辅酶QlO含量，检测条件:检测波长为275nm、进样量为1Ou1、柱温30°C、流动相为甲醇:乙醇(1:1)、流速为lml/min。HPLC测定辅酶QlO结果经多次重复，每克红曲菌丝体可以提取辅酶 Q1080 ~100 μ g,即 80 ~100mg/kg。
实施例二:
[0019]超声波处理不同振幅对辅酶QlO提取得率的影响:取采用大米等原料用红曲霉经液体深层发酵后，产生的红曲发酵产物，经用60~70%乙醇提取红曲红色素后，剩余的红曲霉菌丝体作为提取辅酶qlO的原料，准确称取5g菌丝体，设为5组，分别探讨超声波细胞破碎的处理条件，超声波细胞破碎处理条件为:每次辐射时间10s，间歇时间为15s，超声波工作总时间为lOmin，红曲菌丝体的量为5g，处理菌液体积为30mL条件下，振幅分别为最大功率的20、40、60、80、100% ;探讨最佳的超声波细胞破碎的不同振幅。后续处理同实施例一，结果见表1:
[0020]表1:超声振幅对红曲菌丝体提取液辅酶Ql0的影响
【权利要求】
1. 红曲菌丝体作为原料提取辅酶qlO的应用。
2.—种以红曲菌丝体为原料的提取辅酶qlO的工艺和生产方法，其特征是该方法包括以红曲菌丝体为原料，通过超声破碎法进行提取。
3.如权利要求2所述的一种以红曲菌丝体为原料的提取辅酶qlO的工艺和生产方法，其特征是超声破碎法的提取是以红曲菌丝体为原料，加入丙酮，超声破碎，离心，取上清液，35°C旋转蒸发浓缩，加入石油醚提取；用超纯水洗涤至中性，取石油醚层，加入无水硫酸钠，干燥至液体澄清，过滤，滤液旋转蒸发仪浓缩至干，加入无水乙醇溶解，放-20°C冰箱冷冻析出胆固醇等杂质，过滤，回收乙醇，即得。
4.如权利要求一所述的红曲菌丝体作为原料提取辅酶qlO的应用，其特征是红曲菌丝体提取的辅酶qlO可作为饼干添加剂加入饼干的生产配方中，生产出含有红曲菌丝体辅酶QlO的饼干食品或保健食品，供有患有高血脂，骨质疏松疾病的患者作为健康食品应用。
5.如权利要求一所述的红曲菌丝体作为原料提取辅酶qlO的应用，其特征是红曲菌丝体提取的辅酶qlO可作为饮料添加剂加入饮料的配方中，生产出含有红曲提取物的饮料，供有患有高血脂，骨质疏松疾病的患者作为健康食品应用。
【文档编号】A23L1/29GK103613494SQ201310577271
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】吴铁, 吕思敏, 丁喜生, 崔燎, 孙金影 申请人:广东医学院