专利名称：一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。属食品、医药、化工领域。
背景技术：
鞣花斷2 ， 3 ， 7 ， 82tet rahydroxybenzopyrano[ 5 ， 4 ， 3cde ]benzopyran一5 ， lO—dione)，是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分，它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。它不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以縮合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界。纯鞣花酸是一种黄色针状晶体，熔点(妣啶)大于36(TC，微溶于水、醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚。鞣花酸分子式CmH60s，分子量为302，其结构如下
、o
近十年来，由于发现了鞣花酸的抗突变、抗癌变效应，以及对化学致癌物质的抑制作用，引起了人们广泛的关注。鞣花酸的制备方法主要有以下几种方法
一种是从植物中提取鞣花酸。自然界中，红木莓、草莓、石榴以及蕨类等植物中含有少量鞣花酸(1 %)。目前，国际上约有四五家工厂在以草莓、石榴为原料，可生产出含量为5 %左右的天然鞣花酸提取物，用于食品添加剂；用此工艺可生产高纯度的鞭花酸，但由于原料成本较高、且原料中鞣花酸含量的限制而实际意义不大。
一种是通过倍酸(或其酯)的氧化聚合。没食子酸在过氧化物酶的氧化作
用下，(见Nrusingha C.Mishra and Barry Gold. Synthesis of 13c-and 14c-labrleddllagic acid[J]. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1990，8: 927-94)其主要产物是鞣花酸。此工艺过程中，鞣花酸的产率为20% 30%。但没食子酸(酯)的制备过程繁琐复杂，酶也需要精制纯化，而且产物中还有一种未知的醌类物质，其与鞣花酸的比例为l : 2.4，给产品的分离纯化带来了一定的困难，目前较少用此法进行鞣花酸的生产。
微生物法生产鞣花酸是利用橡碗单宁为原料，在发酵过程中产生鞣花酸，由于鞣花酸不溶于水，发酵过程中有大量的菌丝体产生，并且这种方法反应时间长，为后续的分离纯化带来了很大的困难。也不易于得到高纯度的鞣花酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。通过发酵获得含降解鞣花单宁的酶的菌体，经过超声破碎，得到粗的单宁酶，与石榴皮中提取的鞣花单宁发生酶促反应，分离纯化获得纯度较高的鞣花酸。实现降低成本，废物利用，提高鞣花酸产量和纯度的目的。
本发明的以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法，通过可降解鞣花单宁的单宁酶与輮花单宁进行酶促反应，得到鞣花酸粗产品，经溶剂结晶纯化获得纯鞣花酸，具体步骤和条件为
A鞣花单宁的提取
将烘干的石榴皮粉碎后，加入到体积浓度为20 60%的乙醇水溶液中，置于功率为80-100W的超声波作用下超声处理2-3次，每次25-40分钟，得到鞣花单宁的乙醇水溶液，浓縮回收乙醇后，得到鞣花单宁浓縮液；
B单宁酶的发酵培养
将黑曲霉Aspergillus niger3.316接种于发酵种子培养基中，25-3(TC下培
5养20-24小时，移至产酶培养基中，25-3(TC下培养4-6天，离心并用去离子 水洗涤，获得含单宁酶的菌体，加入pH-5.0的柠檬酸缓冲液后得到菌悬液， 菌悬液于冰浴中在功率400-600W的超声波作用下进行20-30分钟超声破碎， 得到粗的单宁酶；
C酶促转化反应
将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液，加水稀释至原来体积的1-2倍，用 NaOH水溶液调节pH至5.0-5.5，将步骤B得到的粗酶液加入其中，粗酶液 与稀释后的鞣花单宁溶液的体积比为1: 2-3， 25-3(TC下酶促转化反应40-48 小时，反应液经过滤，得到粗鞣花酸产品；
D溶剂结晶纯化
将步骤C得到的鞣花酸粗产品加入甲醇，在70 80。C温度下萃取3 9 小时后，将萃取液浓縮至饱和，降至室温结晶，反应液过滤后，滤饼经水洗、 干燥，得到淡黄色鞣花酸产品，纯度为95%以上。
所述的发酵培养基的组成和含量是NaN03 1.5-2.5 g/1 ， K2HP04 0.5-1.5g/l， MgS04-7H20 0.4-0.8 g/l， KC1 0.4-0.8 g/l， FeS04 0,008-0.015 g/l， 蔗糖25-35 g/l，其余为水。
所述的产酶培养基的组成和含量为鞣花单宁10-16g/l，KH2PO40.5-1.5 g/l， K2HPO40.5-1.5g/l， NaN031.5-2.5 g/l， KC1 0.4-0.8 g/l， MgS04'7H20 0.4-0.8 g/l， FeS04 0.008-0.015 g/1 ，乳糖5-15g/1，吐温-80 1.5-3ml/l，用NaOH水溶液调节 pH值为4-4.5。
为了提高产品的纯度在步骤D的溶剂结晶纯化中，萃取分二至三次完成， 每次1 3小时。
本发明的方法实质是利用酶的催化效率高，选择性强，作用条件温和等 特点，通过发酵并提取可降解鞣花单宁的单宁酶后，与鞣花单宁发生酶促反 应生成鞣花酸，经分离纯化后获得高纯度的鞣花酸。
本发明的优点是工艺简单，制备过程绿色化，三废排放少，适合大规模的生产，产品品质好。我国是石榴种植大国，其果皮除被部分用于中药材 以外，大部分都被人们抛弃，造成了很大的浪费。本发明以石榴皮为原料， 原材料成本低，可提高农产品的附加值。本发明采用酶法生产鞣花酸，由于 酶的反应条件温和，无需高温，高压等操作，改善了生产环境，大大节约化 学物质的消耗量，且三废污染小，容易治理。采用酶促反应，其特异性高， 专一性的降解鞣花单宁中的酯键，具有转化效率高、反应时间短，副产物少 的特点。
具体实施例方式
A鞣花单宁的提取
将烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L体积浓度为40%的乙醇的 水溶液中，于功率80W的超声波作用下，超声处理25分钟，取出收集滤液， 剩余的残渣再重复上述超声处理二次，得到的鞣花单宁的乙醇水溶液，浓縮 回收乙醇后，得到鞣花单宁浓縮液240L。 B单宁酶的发酵培养
发酵种子培养基的组份和含量为NaN03 2 g/l， K2HP04 lg/1 ， MgS04.7H20 0.6 g/l， KC10.6g/1， FeS04 0.01 g/l，蔗糖30g/l，其余为水。灭 菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在30。C， 165rpm下摇床培养 24小时，以5%接种量移至产酶培养基中，产酶培养基的组份和质量含量 鞣花单宁I6g/1， KH2P04 1 g/l， K2HP04 1 g/l， NaN03 2 g/l， KC1 0.6 g/l， MgS04'7H20 0.6g/l， FeS04 0.01 g/l，乳糖10g/l，吐温-80 2ml，用5mol/L 的NaOH溶液调节pH值为4。在28。C， 165rpm下摇床培养4天，离心并用 去离子水洗涤至洗出液为pH=7，收集菌体，按每克湿菌体5ml的比例加入 0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH=5.0)后得到菌悬液，菌悬液于400w的功率下 于冰浴中进行破碎，破碎时间为30分钟，离心，得到的上清液为粗酶液。 C转化反应将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液，加水稀释至350L，用5mol/L的NaOH 调节pH:5.2，将步骤B得到的粗酶液加入其中，粗酶液与稀释后的鞣花单宁 溶液的体积比为l: 3。在3(TC， 90rpm下用摇床转化反应48小时。反应液 经过滤，得到粗鞣花酸。 D溶剂结晶
将得到的粗产品用甲醇75t:萃取，萃取次数为3次，每次1小时，固液 分离，合并液体，蒸发浓縮，冷却结晶，过滤晶体，干燥，得到淡黄色鞣花 酸粉末。原料含鞣花单宁为10.13%，得率为原料的4.1% ，纯度为96.5%。
实施例2:
A鞣花单宁的提取
将烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L体积浓度为60%的乙醇水 溶液中，功率100W的超声波作用下，超声处理30分钟，取出收集滤液，剩 余的残渣再重复上述超声处理二次，得到鞣花单宁的乙醇水溶液，浓縮回收 乙醇后，得到鞣花单宁浓縮液200L。 B单宁酶的发酵培养
所述的发酵种子培养基的组份和含量为NaN03 1.5g/l， K2HP04 0.5g/l， MgSO4.7H2O0.5g/l， KC10.5g/1， FeS04 0.01 g/l，蔗糖25 g/l，其余为水。灭 菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在28。C， 165rpm下摇床培养 22小时，以5%接种量移至产酶培养基中，产酶培养基的组份和含量鞣花 单宁10g/l， KH2PO40,5g/l， K2HPO40.5g/l， NaN03 1.5 g/l， KC1 0.4 g/l， MgSO4.7H2O0.4g/l， FeS04 0.008 g/l，乳糖5g/l，吐温-80 3ml/l，用5mol/L的 NaOH调节pH值为4.3。在28。C， 165rpm下摇床培养6天，离心并用生理 盐水洗涤至洗出液为pH=7，收集菌体，按每克湿菌体5ml的比例加入O.lmol/L 柠檬酸缓冲液后(pH=5.0)得到菌悬液，菌悬液于500W的功率下于冰浴中 进行破碎，破碎时间为25分钟，离心，得到的上清液为粗酶液。 C转化反应
8将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液，加水稀释至300L,用5mol/L的NaOH 调节pH-5.5，将步骤B得到的粗酶液加入其中，粗酶液与稀释后的鞣花单宁 溶液的体积比为l: 2.5。在28r， 100rpm下用摇床转化反应40小时。反应 液经过滤，得到粗鞣花酸。 D溶剂结晶
将得到的粗产品用甲醇75'C萃取，萃取次数为2次，每次2小时，固液 分离，合并液体，蒸发浓縮，冷却结晶，过滤晶体，干燥，得到淡黄色鞣花 酸粉末，原料含鞣花单宁为11.5%，得率为原料的4.3%，纯度为98%。
实施例3:
A鞣花单宁的提取
将烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L体积浓度为50%的乙醇水 溶液中，于功率90W的超声波作用下，超声处理40分钟，取出收集滤液， 剩余的残渣再重复上述超声处理一次，得到的单宁酸的乙醇水溶液浓縮回收 乙醇后，得到鞣花单宁浓縮液200L。 B单宁酶的发酵培养
发酵种子培养基的组份和含量为NaN03 2.5 g/l， K2HP041.5g/l， MgS04.7H20 0.8g/l， KCL0.8g/1， FeSO40.015g/l，蔗糖35 g/l， 其余为水。 灭菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在25。C， 165rpm下摇床培 养24小时，以5%接种量移至产酶培养基中，产酶培养基的组份和含量:鞣花 单宁13g/l， KH2P04 1.5g/l， K2HP04 1.5 g/l， NaN032.5 g/l， KC1 0.8 g/l， MgSO4.7H2O0.8g/l， FeSO40.015g/l，乳糖15g/l，吐》显-80 1.5ml/l，用5mol/L 的NaOH调节pH值为4.5。在25。C， 165rpm下摇床培养5天，离心并用生 理盐水洗涤至洗出液为pH=7，收集菌体，按每克湿菌体5ml的比例加入 0.05mol/L拧檬酸缓冲液(pH=5.0)后得到菌悬液，菌悬液于600W的功率下 于冰浴中进行破碎，破碎时间为20分钟，离心，得到的上清液为粗酶液。 C转化反应
9将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液，加水稀释至400L，用5mol/L的NaOH 调节pH-5.0，将步骤B得到的粗酶液加入其中，粗酶液与稀释后的鞣花单宁 溶液的体积比为l: 2。在25'C， 110rpm下用摇床转化反应44小时。反应液 经过滤，得到粗鞣花酸。 D溶剂结晶
将得到的粗产品用甲醇75。C萃取，萃取次数为3次，每次2小时，固液 分离，合并液体，蒸发浓縮，冷却结晶，过滤晶体，干燥，得到淡黄色鞣花 酸粉末，原料含鞣花单宁为9.1%，得率为原料的3.9%，纯度为98.8%。
权利要求
1. 一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法，通过单宁酶与鞣花单宁的酶促反应，得到鞣花酸粗产品，经溶剂结晶纯化获得纯鞣花酸，具体步骤和条件为A鞣花单宁的提取将烘干的石榴皮粉碎后，加入到体积浓度为20～60％的乙醇水溶液中，置于功率为80-100W的超声波作用下超声处理2-3次，每次25-40分钟，得到鞣花单宁的乙醇水溶液，浓缩回收乙醇后，得到鞣花单宁浓缩液；B单宁酶的发酵培养将黑曲霉Aspergillus niger3.316接种于发酵培养基中，25-30℃下培养20-24小时，移至产酶培养基中，在25-30℃下培养4-6天，离心并用去离子水洗涤，获得含单宁酶的菌体，加入pH＝5.0的柠檬酸缓冲液得到菌悬液，菌悬液于冰浴中在功率400-600W的超声波作用下进行超声破碎，破碎时间为20-30分钟，得到单宁酶的粗酶液；C酶促转化反应将步骤A得到的鞣花单宁浓缩液，加水稀释至原来体积的1-2倍，用NaOH水溶液调节pH至5.0-5.5，将步骤B得到的粗酶液加入其中，粗酶液与稀释后的鞣花单宁溶液的体积比为1∶2-3，在25-30℃下酶促转化反应40-48小时，反应液经过滤，得到鞣花酸粗产品；D溶剂结晶纯化将步骤C得到的鞣花酸粗产品加入甲醇，在70～80℃温度下萃取3～9小时后，将萃取液浓缩至饱和，降至室温结晶，反应液过滤后，滤饼经水洗、干燥，得到淡黄色鞣花酸产品。
2.根据权利要求1的方法，其特征是发酵种子培养基的组成和含量 是NaN03 1.5-2.5 g/l， K2HP04 0.5画1.5g/1， MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l， KC1 0.4-0.8g/l， FeS04 0.008-0.015 g/1 ，蔗糖25-35 g/1 ，其余为水。
3. 根据权利要求1的方法，其特征是产酶培养基的组成和含量为鞣花单宁10-16g/l， KH2P04 0.5-1.5 g/l， K2HP04 0.5-1.5g/l， NaN031.5-2.5 g/l， KCI 0.4-0.8 g/l， MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l， FeS04 0.008-0.015 g/l，乳糖5画15g/1， 吐温-80 1.5-3ml/l,用NaOH水溶液调节pH值为4-4.5。
4. 根据权利要求l的方法，其特征是步骤D的溶剂结晶纯化中，萃 取分二至三次完成，每次1 3小时。
全文摘要
本发明涉及一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。属食品、医药、化工领域。本发明以我国大量被人们废弃的石榴皮为原料提取鞣花单宁，利用酶的催化效率高，选择性强，作用条件温和等特点，通过发酵，获得含降解鞣花单宁的单宁酶，与鞣花单宁发生酶促反应，生成鞣花酸，经过溶剂结晶纯化，获得价格昂贵的医用高纯度的鞣花酸。本发明可降低原料成本，废物利用，并提高鞣花酸产量和纯度，适合大规模的生产。
文档编号C12P17/18GK101481714SQ20081005600
公开日2009年7月15日 申请日期2008年1月11日 优先权日2008年1月11日
发明者倩 张, 艳 程, 袁其朋 申请人:北京化工大学