专利名称：：鞣花酸化合物及其制备和在抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗癌药物及其制备方法，具体地说是以九牛造为原料提取分离得到的两种具有抗癌活性鞣花酸类化合物及其制备方法和在抗癌药物中的应用。
背景技术：
：癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症的高发区域，癌症死亡率居高不下。癌症给患者的身心都造成了难以修复和治愈的创伤。目前尚无有效的药物可以治愈大多数癌症患者，化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，疗效均不理想。目前临床应用的抗癌药物大多为细胞毒性药物，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，机体正常细胞的增殖也被抑制，如造血干细胞等，从而导致骨髓造血机能受损，红细胞或白细胞水平低下，往往是抑制了肿瘤的增殖，但也破坏了患者的免疫力，最终很难取得良好的治疗效果，也限制了化疗药物的临床应用。因此，开发高效低毒、靶向性强的抗肿瘤药物成为抗肿瘤药物开发的热点。经资料查阅目前还没有文献报道这两种鞣花酸化合物3，3'-di-0-methylellagicacid禾口3，3'-di-0—methylellagicacid-4—O—P-D-xylopyroside用于抗肝癌、胃癌等癌症的治疗。
发明内容本发明的目的是提供一种鞣花酸化合物，是一种高效、抗癌谱广的抗癌单体化合物，具体地说是以九牛造为原料提取分离得到的两种鞣花酸类化合物及其在制备治疗肝癌胃癌药物方面的应用。本发明的技术方案是这样实现的本发明九牛造的浸膏中其抗癌的活性物质主要是本发明的鞣花酸类物质。本发明从九牛造(又名五朵云、翻天印、震天雷，EuphorbiahylonomaHand-Mazz.)中提取分离了两种鞣花酸化合物，它们是3，3'-di-0-methylellagiGacid^i3，3'画'di一O一methykllagiGadd一4一0一3-D—xylopyroside，其分子式分别为C16H1()08或C21H18012，结构分别如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>或3，3'誦di一O一methylellagicacid一4一0一P-D一xylopyroside本发明两种鞣花酸类化合物3，3'-di-O-methylellagicacid和3，3'-di-O-methylellagicacid—4'-0-P-D—xylopyroside的制备方去，其步骤是a、将九牛造粉碎后用体积浓度为50100%乙醇浸泡312h,回流提取15次，每次16h,合并提取液，减压浓縮至浸膏；b、向浸膏中加入110倍量水，再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分；c、将氯仿部分进行硅胶柱层析，先用石油醚-乙酸乙酯后用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，中间洗脱下来的化合物即为3，3'-di-O-methylellagicacid—4，一O-(3-D-xylopyroside;d、将乙酸乙酯部分也进行柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，中间洗脱下来的化合物即为3，3'-di-O-methylellagicacid。所述的C步骤洗脱剂石油醚-乙酸乙酯梯度变化为100:11:100，氯仿-甲醇梯度变化为100:11:100。所述的D步骤洗脱剂氯仿-甲醇梯度变化为100:11:100。3，3'-di-O-methylellagicacid或3，3'-di-O-methylellagicacid-4'-0—3-D—xyl叩yroside在制备抗肝癌或胃癌药物中的应用。采用MTT法。取对数生长期SMMC-7721肝癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3XK)4个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200ul，常规培养24h后加入化合物终浓度为10，25，50，80，IOOpg/ml,另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于C(V恒温箱37'C培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20u1质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h，吸弃上清，每孔加入DMS0150ia，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。抑制率(％)=(1—处理组0D值/对照组0D值)X100%试验结果表明，随着3，3'國di-O-methylellagicacid和3，3'-di-O-methylellagicacid—4'—O-P-D-xylopyroside各自、浓度的升高，其对人肝癌细胞的抑制率也升高，当3，3'-di-O-methylellagicacid的浓度为100Ug/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达75.3%,当和3，3'-di—O-methylellagicacid—4'—0—P曙D—xylopyroside的浓度为100ug/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达64.9%。本发明中两种鞣花酸类化合物在治疗胃癌的药物方面的应用。采用MTT法。取对数生长期SGC—7901胃癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3X104个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200ul，常规培养24h后加入化合物终浓度为10，25,50，80，100ug/ml,另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于C(V直温箱37'C培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20u1质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h,吸弃上清，每孔加入DMS0150y1，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(0D)值。抑制率(％)=(l—处理组0D值/对照组0D值)X100%试验结果表明，随着3，3'-di-O—methylellagicacid和3，3'-di-O-methylellagicacid—4'-0-P-D—xylopyroside各自浓度的升高，其对人胃癌细胞的抑制率也升高，当3，3'-di-O-methyldlagicacid的浓度为100ug/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达75.5%，当和3，3'-di-O-methylellagicacid-4'一0—P-D-xylopyroside的、浓度为100ug/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达70.5%。本发明的两种鞣花酸化合物3，3'-di-O-methylellagicacid和3，3'醫di—O—methylellagicacid-4'-O—P國D-xylopyroside是从中药材九牛造中提取分离出来的抗癌单体化合物，毒副作用小，抗癌谱广，对癌细胞有很明显的抑制作用。本发明的两种鞣花酸化合物3，3'-di-O-methyldlagicacid禾口3,3'-di—O—methylellagicacid-4—0—P-D—xylopyroside经抗癌药理试验，结果表明其抗癌活性高。3，3'-di-O-methylellagicacid和3，3'-di—O—methylellagicacid—4'-0—钐國D—xylopyroside的浓度均为lOOpg/ml时对人肝癌细胞的抑制率分别高达75.3%和64.9%，对人胃癌细胞的抑制率分别高达75.5%和70.5%。据文献报道，鞣花酸类物质具有很强的抗肿瘤和抗突变作用，小鼠体内实验和人组织体外实验都表明鞣花酸类物质对各种肿瘤细胞都有很好的抑制作用，特别是对结肠癌、食道癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和皮肤癌等肿瘤细胞效果显著。SehrawatAnuradha等研究表明3,3'-di-O-methylellagicacid以50mg/kgbodywt.的剂量灌喂小鼠后产生肝癌肿瘤启动抑制作用，据此推断该化合物的木糖苷3，3'-di-O-methylellagicacid—4'—O-P-D—xyl叩yroside在动物体内也同样具有较好的抗癌活性，因此初步推断本发明中的两种鞣花酸类化合物3，3'-di-O-methyldlagicacid和3,3，-di-O-methylellagicacid—4'—O-3-D—xylopyroside对各种癌症尤其是肝癌和胃癌具有较好的作用，从而这两种鞣花酸化合物与药学上可接受的载体及辅料结合后可以用于制备抗肝癌或抗胃癌药物。'图l是本发明3，3'-di—O—methylellagicacid的^-NMR图谱；图2是本发明3，3'-di—O—methylellagicacid的13C-NMR图谱；图3是本发明3，3'-di—O—methylellagicacid-4'-O—P-D-xylopyroside的^-NMR图谱；图4是本发明3，3'-di—O—methylellagicacid—4'—O—P-D—xylopyroside的13C-NMR图谱；图5是本发明3，3'-di-O-methylellagicacid-4'-0—P-D-xylopyroside的DEPT图谱；图6中A是空白对照组作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图；图6中B是3，3'-di-O-methylellagicacid在浓度为10ng/mL时作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图6中C是3，3'-di-O-methylellagicacid在浓度为50ng/mL时作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图6中D是3，3'-di—O—methylellagicacid在浓度为lOO^g/mL时作用48h后SMMC-7721细胞的光镜下形态图7中A是空白对照组作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图；图7中B是3，3'-di-O-methylellagicacid-4，一O-P-D-xylopyroside在浓度为10pg/mL时作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图；图7中C是3，3'-di—O—methylellagicacid-4，-0-P-D-xylopyroside在浓度为50ng/mL时作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图7中D是3，3'-di-O-methylellagicacid-4'—O—P画D-xylopyroside在浓度为lOO^g/mL时作用48h后SGC-7901细胞的光镜下形态图。下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。具体实施方式实施例1:两种鞣花酸化合物3，3'-di-O-methylellagicacid和3，3'-di-O-methylellagicacid—4'-0—P-D-xylopyroside的提取分离方法①九牛造药材于2005年10月采自陕西省太白县境内，经自然风干后粉碎，将粉碎的九牛造9kg用85%乙醇浸泡12h,回流提取3次，每次4h，合并提取液，减压浓縮至浸膏；②向浸膏中加入适量水，再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分各20g、89g、170g;③将氯仿部分进行硅胶柱层析，先用石油醚-乙酸乙酯后用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，等量收集洗脱液每份150ml，共收集324份，将洗脱液分别做硅胶薄层层析，薄层板喷以10%硫酸乙醇溶液显色，合并相同的洗脱液，从其中合并的212240份中析出了晶体，再以甲醇重结晶得到针状结晶，即为本发明的3，3'國di-O-methylellagicacid-4'—O—卩-D-xylopyroside;④将乙酸乙酯部分也进行柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，等量收集洗脱液每份150ml，共收集350份，将洗脱液分别做硅胶薄层层析，薄层板喷以10%硫酸乙醇溶液显色，合并相同的洗脱液，从其中合并的87-142份中析出了晶体，再以丙酮重结晶得到的晶体即为本发明的3，3'-di-O-methylellagicacid。实施例2:两种鞣花酸化合物3，3'-di-O-methylellagicacid和3，3'國di-O-methylellagicacid-4'—O—P-D—xylopyroside的结构鉴定乙酸乙酯部分柱层析时洗脱液中析出的晶体为淡黄色粉末状结晶，熔点为332-334"C，MS显示分子量为344，分子式为C16H1()08。通过iH-NMR和"C-NMR图谱(见附图1和附图2)提示得其为鞣花酸类物质，其化学结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>附图1iH-NMR图谱中波谱数据及归属如下'H-NMR(DMSO-d6)Sppm:4.05(6H,s，2xOCH3)，7.54(2H，s，H-5,H-5')，10.79(2H，s，0H-4，OH國4，)。附图213C-NMR图谱波谱数据及归属如下"C画NMR(DMSO誦d6)5ppm:111.46(s，C-l,C-l，)，141.25(s，C國2，C陽2')，140.23(s，C-3，C-3，)，152.23(s，C-4，C画4，)，U1.69(d,C國5，C-5，)，112.18(s，C曙6，C-6，)，158.52(s，C-7，C-7，)，61.00(q，2xOCH3)。'H-NMR、13C-NMR图谱数据经与文献对照基本一致，根据波谱数据确定此化合物为3，3，國di-o國methylellagicacid。氯仿部分柱层析时洗脱液中析出的晶体为白色粉末状结晶，熔点为227-229°C，MS显示分子量为462，分子式为C21H18012。通过1H-NMR，13C-NMR和DEPT图谱提示得其为鞣花酸类物质，其化学结构式如下3，3'画di-O-methylellagicacid-4一0-0-D-xylopyroside附图3'H-NMR图谱中波谱数据及归属如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>^誦NMR(DMSO)5ppm:S7.48(1H，d，J=5.3，H國5)，S7.73(1H，d，J=3.2，H画5)，54.05(1H,s，3-OCH3)，54.08(1H，s，3，-OCH3)，S10.8(1H，s，4國OH)。附图413C-NMR图谱波谱数据及归属如下13C-NMR(DMSO)Sppm:111.07(C画l)，140.94(02)，140.19(C國3)，151.26(04)，m.65(C画5)，111.82(C-6)，158.37(C画7)，114.19(C-1，)，141.58(C画2')，141.98(C-3，)，152.84(C-4,)，112.02(C-5，)，112.72(C-6，)，152.40(C-7，)，101.94(C-r)，73.09(C-2"),76.17(C-3，，)，69.31(C-4"),65.84(C-5，，)，61.48(3-OCH3)，61.02(3，-OCH3)。附图5DEPT图谱波谱数据及归属如下DEPT谱提示该化合物有S111.89，111.60,101.84，76.18,73.08，69.28，61.68，61.02处为甲基或次甲基碳原子信号，S65.84为亚甲基碳原子信号，其余的均为季碳信号。'H-NMR、"C-NMR及DEPT图谱数据经与文献对照基本一致，根据波谱数据确定此化合物为3，3'-di-O-methylellagicacid-4'-O-P-D-xylopyroside。实施例3:3，3'-di-0-methylellagicacid禾口3，3'-di-O-methylellagicacid-4'-0-P-D—xylopyroside抗肝癌作用1.细胞培养与单体化合物人肝癌细胞株SMMC-7721由西安交通大学医学研究试验中心提供，细胞培养于含1(F。小牛血清的RPMI-1640培养基中，培育在37。C、5%0)2的饱和湿度培养箱中，每23天细胞汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于试验。两个单体化合物是经化学结构鉴定的九牛造中鞣花酸物质3，3'-di—O—methylellagicacid禾卩3,3'-di—O—methylellagicacid—4一0-P陽D-xyiopyroside。2.试验方法采用MTT法测定九牛造中鞣花酸类物质3，3'-di-O-methylellagicacid和3，3'-di-O-methylellagicacid—4'—O—P-D—xyiopyroside(用DMSO溶解)对肝癌细胞生长抑制作用。取对数生长期SMMC-7721肝癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3X104个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200ul，常规培养24h后加入化合物终浓度为IO，25，50，80，100ug/ml,另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于C02恒温箱37。C培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20ul质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h，吸弃上清，每孔加入DMS0150"1，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。抑制率(％)=(l—处理组OD值/对照组OD值)X100%3.试验结果结果如表l所示，随着3，3'-di—O-methylellagicacid和3，3'-di-0—methylellagicacid-4'-0-e曙D-xylopyroside各自浓度的升高，其对人肝癌细胞的抑制率也升高，当3，3'-di-O-methylellagicacid的浓度为100ug/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达75.3%，当和3，3'-di-O-methylellagicacid—4'—0-P-D-xylopyroside的浓度为100yg/ml时对人肝癌细胞的抑制率高达64.9%。表1样品1、2对SSMC-7721细胞的生长抑制率样品浓度(|ig/ml)24h48h72h1010.2±0.8413.9±1.0215.8±U32517.3±1.0518.3±0.8519.5±0.8615020.6±1.2523.5±0.1332.2±1.278027.1±0.6732.7±0.3862,4±0.9310030.3±0.5835.6±1.5475.3±1.561010.2±0.2813.6±0.6722.3±1.07<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>其中3，3'-di-O-methylellagicacid在不同浓度时作用于人SMMC-7721肝癌细胞后肝癌细胞的光镜下形态可见附图6。由附图6可以看出，在空白对照组中基本上都为活细胞，而在给药组中都有不同比例的死细胞，并且随着药液浓度的增大，死细胞所占的比例越大，其中当药液浓度达到IOOUg/ml时，死细胞的比例高达约3/4。实施例4:3，3'-di-O-methylellagicacid禾口3，3'-di-O-methylellagicacid-4'-0—P-D-xylopyroside的抗胃癌作用1.细胞培养与单体化合物人胃癌细胞株SGC-7901由西安交通大学医学研究试验中心提供，细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，培育在37。C、5%(:02的饱和湿度培养箱中，每23天细胞汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于试验。两个单体化合物是经化学结构鉴定的九牛造中鞣花酸物质3，3'-di—O—methylellagicacid禾口3，3'-di—O—methylellagicacid—4—O—P-D—xylopyroside。2.试验方法采用MTT法测定九牛造中鞣花酸类物质3，3'-di-O-methylellagicacid禾口3，3'-di-O—methylellagicacid-4'—O—3-D—xylopyroside(用DMSO溶解)对胃癌细胞生长抑制作用。取对数生长期SGC—7901胃癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为3x104个/ml，接种于96孔培养板内，每孔接种200ti1，常规培养24h后加入化合物终浓度为10，25，50，80，100pg/ml，另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔，每个药物浓度设5个复孔。加药后将96孔板置于C02恒温箱37。C培养。在24、48、72h不同时间点，分别取出细胞板，每孔加入20^1质量浓度为5mg/ml的MTT，常规培养4h,吸弃上清，每孔加入DMSO150pl，充分振荡混匀，使沉淀结晶充分溶解，以490nm为检测波长，利用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。抑制率(％)=(l—处理组OD值/对照组OD值)xioo%3.试验结果结果如表2所示，随着3，3'國di-O-methylellagicacid和3，3'-di-O—methylellagicacid—4'—O—3-D—xylopyroside各自浓度的升高，其对人胃癌细胞的抑制率也升高，当3，3'-di-O-methylellagicacid的浓度为100ug/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达75.5%,当和3，3'-di-O-methylellagicacid-4'-0-P-D—xylopyroside的浓度为100ug/ml时对人胃癌细胞的抑制率高达70.5%。表2样品l、2对SGC-7901细胞的生长抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>1—3，3'-di—O—methylellagicacid2—3，3'-di—O-methylellagicacid—4—O—P-D—xylopyroside其中3，3'-di-O-methylellagicacid-4_0-|3-D—xylopyroside在不同浓度时作用于人SGC-7901胃癌细胞后胃癌细胞的光镜下形态可见附图7。由附图7可以看出，在空白对照组中基本上都为活细胞，而在给药组中活细胞数下降，并且随着药液浓度的增大，活细胞的比列越来越小，对应的死细胞所占的比例越来越大，其中当药液浓度达到10(^g/ml时，死细胞的比例可达到7/10左右。权利要求1.抗癌鞣花酸类化合物，其特征在于，它们是3，3’-di-O-methylellagicacid或3，3’-di-O-methylellagicacid-4‘-O-β-D-xylopyroside，分子式分别为C16H10O8或C21H18O12，其化学结构分别为id="icf0001"file="S2008100182305C00011.gif"wi="77"he="35"top="82"left="79"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>3，3’-di-O-methylellagicacid或者id="icf0002"file="S2008100182305C00012.gif"wi="112"he="38"top="144"left="69"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>3，3’-di-O-methylellagicacid-4-O-β-D-xylopyroside2、一种制备权利要求1所述的抗癌鞣花酸类化合物制备方法，其特征在于，包括下列步骤a、将九牛造粉碎后用体积浓度为50100%乙醇浸泡312h，回流提取15次，每次16h,合并提取液，减压浓縮至浸膏；b、向浸膏中加入110倍量水，再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分；c、将氯仿部分进行硅胶柱层析，先用石油醚-乙酸乙酯后用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，中间洗脱下来的化合物即为3，3'-di-O-methylellagicacid—4一0-(3-D—xylopyroside;d、将乙酸乙酯部分也进行柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，中间洗脱下来的化合物即为3，3'-di-0-methylellagicacid。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的C步骤洗脱剂石油醚-乙酸乙酯梯度变化为100:11:100，氯仿-甲醇梯度变化为100:l1:亂4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的D步骤洗脱剂氯仿-甲醇梯度变化为100:11:100。5、一种如权利要求1所述的3，3'-di-O-methylellagicacid或3，3'-di—O—methylellagicacid_4'—O—P-D—xylopyroside在帝U备抗肝癌或胃癌药物中的应用。全文摘要本发明公开了鞣花酸化合物及其制备和在抗癌药物中的应用，该化合物都是从九牛造(大戟属植物湖北大戟的根及地上部分)提取分离得到的抗癌单体化合物，其制备方法是首先将风干的九牛造粉碎后用乙醇提取，浓缩得浸膏；其次，再用氯仿和乙酸乙酯萃取，分别经过柱层析，再用洗脱剂洗脱分别得到两种鞣花酸化合物，经抗癌药理实验对人肝癌细胞和胃癌细胞的生长有明显的抑制作用，并具有抗癌谱广抗癌活性较强等优点，从而这两种鞣花酸化合物与药学上可接受的载体及辅料结合后可以用于制备抗肝癌或抗胃癌药物。文档编号A61K31/7048GK101289453SQ200810018230公开日2008年10月22日申请日期2008年5月16日优先权日2008年5月16日发明者卜筱茜,颖徐,林谭,郭增军申请人:西安交通大学