人体细胞因子的表达、纯化和复性方式的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，属于生物【技术领域】，通过将人的IL-1beta基因插入到带GST的表达载体pGEx-4T-1中，在大肠杆菌中表达IL-1beta，并通过低温冻存法将包涵体大量释放，进而采用连续梯度法透析，一方面能大量制备IL-1beta，同时又能使IL-1beta很好的复性。
【专利说明】人体细胞因子的表达、纯化和复性方式
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种人体细胞因子的表达、纯化和复性方式。【背景技术】
[0002]IL-1是一类小分子的细胞因子多肽，主要有IL-1alpha和IL-1beta两种亚型。IL-1主要由活化的巨噬细胞产生，此外在几乎所有有核细胞如B细胞、NK细胞、T细胞、树突状细胞等细胞中均可产生。两种不同亚型IL-1可以以同样的亲和力与其受体结合，发挥同样的生物学功能。IL-1功能广泛:可以与抗原协同作用使CD4+T细胞发生活化；促进B细胞生长和分化；促进单核巨噬细胞的抗原递呈能力；与11^-2或正^^协同作用增强NK细胞活性等。在目前肿瘤细胞免疫治疗中，使用IL-1beta和IFNy及IL-2等共同刺激NK的活性，从而达到治疗肿瘤作用，因此大量制备IL-1beta成为市场的巨大需求，但通常的市售的IL-1beta产品存在很多不尽如人意的技术问题，如产量低，由于细胞因子在制备过程中往往碰到复性困难而使细胞因子活性受到极大的影响。
【发明内容】
[0003]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，通过将人的IL-1beta基因插入到带GST的表达载体pGEx-4T_l中，在大肠杆菌中表达IL-1beta,并通过低温冻存法将包涵体大量释放，进而采用连续梯度法透析，一方面能大量制备IL-1beta,同时又能使IL-lbeta很好的复性。
[0004]本发明的技术方案如下:
人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，主要包括以下步骤:
(I)根据基因序列表查找人IL-1beta的cDNA序列(ILl β accession numberNM_000576.2)并设计 PCR 引物:
Forward Primer 5’ CGGGATCCGCACCTGTACGATCACTGAAC 3’ (BamHI)
Reverse Primer 5，CCGCTCGAGTGGGTACAGCTCTCTTTAGG 3，(Xho I) ；(2)运用 pfu 多聚酶进行PCR，并将PCR产物运用BamHI和XhoI进行酶切，同时用相同酶对pGEx_4T_l进行酶切。将酶切产物回收后用T4连接酶连接，所述PCR的反应体系由下列物质组成:5ul的 IOXPfu Buffer with MgS04 ；5ul 的 d NTPmix, 2mM each ；2ul 的 Forward Primer ；2ul 的Reverse Primer ；5ul 的 Template DNA 和 I ul 的 Pfu DNA polymerase ;在对 pfu 多聚酶进行PCR的过程中，按照以下方式进行:首先在95°C的条件下进行3min的预变性，在95°C的条件下进行30s的变性处理，然后在58°C的条件下进行30s的退火处理，同时在72°C的条件下进行2min的延伸，如此进行30个循环过程，然后保存于4°C的环境中；(3)将连接好的质粒用热刺激法转化到感受态BL21，并涂在氨苄板中；(4)撬取阳性克隆，进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。并将鉴定为阳性的菌落保存；(5)接种步骤(4)中的阳性菌落与LB培养基中，并用IPTG诱导过 夜，放置于温度为25°C，转速为250rpm的环境中；(6)收集步骤(5)中的细菌5000g，在温度为4°C的环境中，离心20min ； (7)去上清后用PBS洗两次，然后将沉淀放置于_80°C过夜，过夜后取出，放置室温融化；(8)加入含溶菌酶的裂解液，所述裂解液的浓度为0.lmg/ml，室温裂解2h ;(9)利用超声进一步裂解细菌，所述裂解方式为:超声5s，然后间隔5s,共计30min,超声后经12000g,在4°C的环境中离心15min ; (10)用含detergen的缓冲液洗涤包涵体3-4次直到蛋白变白；(11)用含2M尿素的缓冲液B重悬包涵体，将包涵体冻存在_20°C的环境中，2-3h后取出融化，离心，上清中即为所需蛋白；(12)将蛋白放置透析袋中，透析袋放在含2M尿素的裂解液中，逐滴加入不含尿素的缓冲液，同时用蠕动泵将烧杯中缓冲液吸出，过夜透析，直到吸入和排出的缓冲液为初始双倍体积，体积约为4L，再用GST纯化柱的binding缓冲液继续透析过夜，然后将透析袋内的液体吸出，按照GST纯化试剂的步骤进行纯化；(13)将纯化的GST-1L-1beta融合蛋白用凝血酶切割，切割后的蛋白再行GST纯化，收集流出的蛋白，此时所述蛋白含有IL-1beta和凝血酶，将IL-1beta和凝血酶经过sephadex分离，收集IL-1beta端，即为纯化的IL-lbeta。
[0005]作为优选，所述detergen的缓冲液由下列物质组成:50mM Tris-HCl pH 8.0, IOOMmNaCl，ImM EDTA, 1% Triton X-100, IM urea。
[0006]作为优选，所述缓冲液B由下列物质组成:IOOmM NaH2P04，IOmM Tris.C1，2M尿素。
[0007]进一步地，所述缓冲液B中各物质的比例如下:IOOmM NaH2P04采用13.8gNaH2P04.H20，其分子量为 137.99g/mol ；10mM Tris.Cl 采用 1.2g Tris Base，其分子量为121.lg/mol，2M尿素使用120_125g，分子量为60.06g/mol，且以上物质中所含有的NaOH的PH值为8.0。
[0008]有益效果:本发明通过以上技术方案，能有效解决现有技术中存在的产量低的问题，在保证IL-1beta很好的复性，大幅度降低生产难度，提升产量。
【具体实施方式】
[0009]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
[0010]人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，主要包括以下步骤:
(1)根据基因序列表查找人IL-1beta的cDNA序列(ILlβ accession numberNM_000576.2)并设计 PCR 引物:
Forward Primer 5’ CGGGATCCGCACCTGTACGATCACTGAAC 3’ (BamHI)
Reverse Primer 5’ CCGCTCGAGTGGGTACAGCTCTCTTTAGG 3’ (Xho I)； (2)运用pfu多聚酶进行PCR，并将PCR产物运用BamHI和XhoI进行酶切，同时用相同酶对pGEx-4T-l进行酶切。将酶切产物回收后用T4连接酶连接，所述PCR的反应体系由下列物质组成:5ul 的 IOXPfu Buffer with MgS04 ;5ul 的 d NTPmix, 2mM each ;2ul 的 ForwardPrimer ；2ul 的 Reverse Primer ；5ul 的 Template DNA 和 I ul 的 Pfu DNA polymerase ;在对Pfu多聚酶进行PCR的过程中，按照以下方式进行:首先在95°C的条件下进行3min的预变性，在95°C的条件下进行30s的变性处理，然后在58°C的条件下进行30s的退火处理，同时在72°C的条件下进行2min的延伸，如此进行30个循环过程，然后保存于4°C的环境中；
(3)将连接好的质粒用热刺激法转化到感受态BL21，并涂在氨苄板中；
(4)撬取阳性克隆，进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。并将鉴定为阳性的菌落保存；
(5)接种步骤(4)中的阳性菌落与LB培养基中，并用IPTG诱导过夜，放置于温度为25°C，转速为250rpm的环境中；
(6)收集步骤(5)中的细菌5000g，在温度为4°C的环境中，离心20min；
(7)去上清后用PBS洗两次,然后将沉淀放置于_80°C过夜,过夜后取出，放置室温融
化；
(8)加入含溶菌酶的裂解液，所述裂解液的浓度为0.lmg/ml，室温裂解2h ；
(9)利用超声进一步裂解细菌，所述裂解方式为:超声5s，然后间隔5s，共计30min，超声后经12000g,在4°C的环境中离心15min ；
(10)用含detergen的缓冲液洗漆包涵体3-4次直到蛋白变白，所述detergen的缓冲液由下列物质组成:50mM Tris-HCl pH 8.0, IOOMm NaCl, ImM EDTA, 1% Triton X-100，IMurea ；
(11)用含2M尿素的缓冲液B重悬包涵体，所述缓冲液B中各物质的比例如下:100mMNaH2P04 采用 13.8g NaH2P04.H20，其分子量为 137.99g/mol ; IOmM Tris.Cl 采用 1.2g TrisBase，其分子量为121.lg/mol，2M尿素使用120_125g，分子量为60.06g/mol，且以上物质中所含有的NaOH的PH值为8.0 ;将包涵体冻存在-20°C的环境中，2_3h后取出融化，离心，上清中即为所需蛋白；
(12)将蛋白放置透析袋中，透析袋放在含2M尿素的裂解液中，逐滴加入不含尿素的缓冲液，采用逐滴添加的方式，使透析液的浓度缓慢变化，不致于由于浓度的过快改变，导致蛋白结晶，从而更好的使蛋白复性，同时用蠕动泵将烧杯中缓冲液吸出，过夜透析，直到吸入和排出的缓冲液为初始双倍体积，体积约为4L，再用GST纯化柱的binding缓冲液继续透析过夜，然后将透析袋内的液体吸出，按照GST纯化试剂的步骤进行纯化；
(13)将纯化的GST-1L-1beta融合蛋白用凝血酶切割，切割后的蛋白再行GST纯化，收集流出的蛋白，此时所述蛋白含有IL-1beta和凝血酶,将IL-1beta和凝血酶经过sephadex分离，收集IL-1beta端，即为纯化的IL-lbeta。
[0011]以上所述的仅是本发明人体细胞因子的表达、纯化和复性方式的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，主要包括以下步骤: (1)根据基因序列表查找人IL-1beta的cDNA序列(ILlβ accession numberNM_000576.2)并设计 PCR 引物: (2)运用pfu多聚酶进行PCR，并将PCR产物运用BamHI和XhoI进行酶切，同时用相同酶对pGEx-4T-l进行酶切，将酶切产物回收后用T4连接酶连接，所述PCR的反应体系由下列物质组成:5ul 的 IOXPfu Buffer with MgS04 ；5ul 的 d NTPmix, 2mM each ；2ul 的 ForwardPrimer ；2ul 的 Reverse Primer ；5ul 的 Template DNA 和 I ul 的 Pfu DNA polymerase ;在对Pfu多聚酶进行PCR的过程中，按照以下方式进行:首先在95°C的条件下进行3min的预变性，在95°C的条件下进行30s的变性处理，然后在58°C的条件下进行30s的退火处理，同时在72°C的条件下进行2min的延伸，如此进行30个循环过程，然后保存于4°C的环境中； (3)将连接好的质粒用热刺激法转化到感受态BL21，并涂在氨苄板中； (4)撬取阳性克隆，进行菌落PCR鉴定和测序鉴定，并将鉴定为阳性的菌落保存； (5)接种步骤(4)中的阳性菌落与LB培养基中，并用IPTG诱导过夜，放置于温度为25°C，转速为250rpm的环境中； (6)收集步骤(5)中的细菌5000g，在温度为4°C的环境中，离心20min； (7)去上清后用PBS洗两次,然后将沉淀放置于_80°C过夜,过夜后取出，放置室温融化； (8)加入含溶菌酶的裂解液，所述裂解液的浓度为0.lmg/ml，室温裂解2h ； (9)利用超声进一步裂解细菌，所述裂解方式为:超声5s，然后间隔5s，共计30min，超声后经12000g,在4°C的环境中离心15min ； (10)用含detergen的缓冲液洗涤包涵体3_4次直到蛋白变白； (11)用含2M尿素的缓冲液B重悬包涵体,将包涵体冻存在_20°C的环境中，2-3h后取出融化，离心，上清中即为所需蛋白； (12)将蛋白放置透析袋中，透析袋放在含2M尿素的裂解液中，逐滴加入不含尿素的缓冲液，同时用蠕动泵将烧杯中缓冲液吸出，过夜透析，直到吸入和排出的缓冲液为初始双倍体积，体积约为4L,再用GST纯化柱的binding缓冲液继续透析过夜,然后将透析袋内的液体吸出，按照GST纯化试剂的步骤进行纯化； (13)将纯化的GST-1L-1beta融合蛋白用凝血酶切割，切割后的蛋白再行GST纯化，收集流出的蛋白，此时所述蛋白含有IL-1beta和凝血酶,将IL-1beta和凝血酶经过sephadex分离，收集IL-1beta端，即为纯化的IL_lbeta。
2.根据权利要求1所述的人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，其特征在于，所述 detergen 的缓冲液由下列物质组成:50mM Tris-HCl pH 8.0, IOOMm NaCl, ImM EDTA, 1%Triton X-100, IM urea。
3.根据权利要求1所述的人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，其特征在于，所述缓冲液B由下列物质组成:IOOmM NaH2P04，IOmM Tris.C1，2M尿素。
4.根据权利要求3所述的人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，其特征在于，所述缓冲液B中各物质的比例如下:采用13.8g NaH2P04.H20，其分子量为137.99g/mol ;采用.1.2g Tris Base，其分子量为121.lg/mol，使用120_125g，分子量为60.06g/mol，且以上物质中所含有的NaOH的PH值为8.0。
5.根据权利要求1所述的人体细胞因子的表达、纯化和复性方式，其特征在于，所述PCR引物为:
Forward Primer 5，CGGGATCCGCACCTGTACGATCACTGAAC 3，(BamHI)
Reverse Primer 5’ CCGCTCGAGTGGGTACAGCTCTCTTTAGG 3’ (Xho I)。
【文档编号】C12N15/25GK104004766SQ201410262846
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】张进平 申请人:苏州景美生物科技有限公司