特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种特异响应外界胁迫抗性的nfiS基因的用途及其使用方法。本发明基于发现了nfiS基因为可转录的有功能性的非编码RNA基因，以及该基因可作为功能元件转入其他微生物并提高受体菌株的氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性这一成果，提供了特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法，该方法构建的具有携带nfiS基因的重组工程菌株，在高浓度的氧胁迫和高浓度的盐胁迫下，相对于不含有nfiS基因的菌株相同条件下具有更高的生存率；nfiS基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性方面具有很大的应用前景。
【专利说明】特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种特异响应外界胁迫抗性的基因 的用途及其使用方法。 【背景技术】
[0002] 非编码RNAs (non-coding RNAs, ncRNAs)是一类非常重要的调节子，此类调节子 能够使细胞调节它们的生理特性而适应环境的改变。已有的研究表明ncRNAs在细菌的蔗 糖代谢、细胞外膜应激反应、群体感应和细菌毒力等方面发挥了重要的调节作用，其调控模 式已经成为细菌调控网络中的重要"分支"。
[0003] 生物固氮是固氮微生物的一种特殊的生理功能，已知具固氮作用的微生物约近50 个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌（即蓝藻)，它们在生活方式、固氮作用类型等发面都有着 较大区别。由于固氮条件本身是一个对碳、氮和氧要求较为严格的胁迫环境，而固氮微生物 中开展非编码RNA功能研究的报道不多，因此非编码RNA在固氮微生物环境适应性方面发 挥着怎样的作用目前仍未知。
[0004] 固氮施氏假单胞菌的非编码RNA/7/沉序列(基因序列为SEQ ID NO: 1)中，没有起始 密码子和终止密码子，现有技术中没有发现其能转录成非编码RNA，也没有其用途方面的相 关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种特异响应抗性的/7/沉基因的用途及其使用方法。发明人在进行施 氏假单胞菌基因组研究过程中，首次发现了 基因为可转录的 有功能性的非编码RNA基因，并发现该基因可用于提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性， 为获得具有高效固氮活性和胁迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理论基础。
[0006] 本发明中，所述/7/沉基因即为参与固氮施氏假单胞菌胁迫应答反应的非编码RNA 基因，其是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的DNA转录而成的非编码RNA基因。
[0007] -种特异响应逆境信号的/7/沉基因的用途，所述/7/沉基因用于提高菌株氧化胁迫 抗性和/或盐胁迫抗性。
[0008] 上述方案优选的是，所述基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的DNA转录而成 的非编码RNA基因。
[0009] 上述任一方案优选的是，所述菌株为固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌 株。
[〇〇1〇] 一种利用基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，包括克隆完 整的/?々；?基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步 骤。
[0011] 上述任一方案优选的是，所述/7/沉基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的DNA转录 而成的非编码RNA基因。
[0012] 上述任一方案优选的是，所述克隆完整的/7/沉基因的DNA序列包括从施氏假单胞 菌Μ?&--ΓΥ)基因组中通过PCR扩增出完整的/?//；?基因的DNA片段序列。
[0013] 上述任一方案优选的是，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌 株的步骤为： (1) 将克隆出的完整的基因的DNA片段序列进行酶切； (2) 将酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处； (3) 将步骤（2)中的载体通过热激转化的方法转化到菌株中，构建重组表达菌株，即具 有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株。
[0014] 上述任一方案优选的是，所述酶切是用及?ΗΙ和历ii/III酶进行双酶切。
[0015] 上述任一方案优选的是，所述表达载体是pLAFR3载体。
[0016] 上述任一方案优选的是，所述菌株为固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌 株。
[0017] 上述任一方案优选的是，在步骤（2)中，还包括在表达载体的多克隆位点处插入验 证基因。
[0018] 上述任一方案优选的是，包含所述验证基因的表达载体为四环素抗性。
[0019] 一种通过利用/7/7；?基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法构建的重 组菌株。
[0020] 本发明中未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规技术条 件。
[0021] 本发明所述的特异响应逆境信号的/7/沉基因的发明途径为： 1、非编码RNA对特异信号的响应体外表达分析表明/7/沉基因能够特异的响应氧胁迫信 号。
[0022] 固氮施氏假单胞菌A1501 0°. A1501)中/7/7；?基因对氧胁迫信号的响应， 实验步骤如下： (1) 将施氏假单胞菌A1501菌在LB液体培养基中活化，30° C过夜培养； (2) 次日4000 rpm离心lOmin收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次； (3) 用生理盐水悬浮菌体，调0D6QQ ~ 1. 0 ; (4) 分别将菌体在以下几个时相中培养：有氮好氧条件（CN0，K培养基)、无氮微好氧条 件（CN_0_，K培养基中不添加氮源，并且充氩气排空气三分钟，然后注入0. 5%的氧气)、氧限 制条件（CK0_，K培养基中不添加氮源，并且充氩气排空气三分钟)、好氧条件（CN_0, K培养 基不添加氣源)，调〇D6(i(i 0. 5 ; (5) 培养液30°C震荡培养0· 5 h后，8000 rpm离心5 min，收集菌体； (6) 采用Promega大量提取RNA试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样品 RNA进行单链DNA (cDNA)反转。
[0023] (7)通过qRT-PCR方法对/7/沉基因在不同胁迫条件下的表达水平进行了分析，结 果如图1所示，图1中：纵坐标表示基因在mRNA水平上的相对表达量，横坐标代表/?形 基因。其中黑色柱状图代表氧充足条件下/7/沉基因的表达量；网格柱状图代表氧限制条件 下/7/沉基因的表达量；灰色柱状图代表有氮有氧条件下/7/沉基因的表达量；斜格柱状图代 表无氮微好氧条件下基因的表达量. 本实验结果分析：固氮施氏假单胞菌A1501的全基因组中含有/7/沉基因的DNA序列，从 图1中可以看出，氧限制条件下（CND/7形基因的转录水平显著提高，与好氧条件（CO)相 比提高了 338倍；此外，与有氮好氧条件（CNO)相比，在无氮微好氧条件下（CN^n/7/沉的转 录水平也显著提高了近8倍，表明/7/沉基因能够特异的感应氧胁迫信号。
[0024] 2、/?//；?生物信息学分析Rfam数据库和GenBank数据库中的BLASTN比对分析表明 （DNA序列如SEQ ID NO: 1所示）基因属于一类具有种特异性的功能仍未确定的RNA家 族(如图2所示)。
[0025] 基因生物信息学分析： 在NCBI数据库中下载了/7/7；?基因的编码序列（DNA序列如SEQ ID N0:1所示)，将/7/7；? 的核苷酸序列在Rfam数据库中进行了比对，发现/7/沉的序列与数据库中的RNA家族中 的任何成员不存在同源性，这表明可能属于一类新的功能仍未确定的RNA家族；而 GenBank数据库中的BLASTN比对则进一步显示/?形的同源序列仅仅在四株施氏假单胞菌 0°· stoizeriDSIMiee，/7· ATCC17588，/7· CCUG29243 和/"· RCH2) 中存在(如图2)，这说明/7/沉是一类功能未知的具有种特异性的非编码RNA。
[0026] 3、/7/沉突变株的构建分别将包含该非编码RNA上下游同源基因序列的自杀载体转 至A A1501中，利用同源重组的原理获得/?//；?的缺失突变株A15 Λ/?，/；?。
[0027] 4、/?形表达载体的构建：首先PCR扩增获得完整的/?形DNA片段，然后将克隆片 段进行和沒双酶切，插入到广宿主表达载体pLAFR3的多克隆位点处，最后 将/7/7；?表达载体转入到大肠杆菌TranslO中获得具有四环素抗性的重组表达菌株凡coh Trans 10 (/?形)。
[0028] 5、氧化胁迫抗性的影响H202冲击实验显示/7/7；?基因的缺失能够降低A1501菌在氧 化胁迫条件下的生存率，与野生型相比菌株生存率降低了一个数量级，而qRT-PCR结果进 一步证明/7/沉的缺失能够降低氧化胁迫相关基因的转录水平，推测/7/沉可能通过对氧信号 的响应参与到了固氮施氏假单胞菌A1501氧化胁迫抗性的调控过程。此外，/7/沉基因的重 组表达能够显著提高大肠杆菌TranslO的氧化胁迫抗性，说明该基因在提高菌株氧化胁迫 抗性方面具有很大的应用前景。
[0029] 6、盐胁迫抗性的影响盐冲击实验表明/7/7；?基因的缺失也能够降低A1501菌株在盐 胁迫条件下的生存率，与野生型相比生存率降低了一个数量级，表明除了影响固氮施 氏假单胞菌A1501氧化胁迫抗性以外，也可能参与到了菌株渗透调节机制的反应过程。
[0030] 发明人通过上述途径发现了 /7/沉基因为可转录的有功能性的非编码RNA基因，该 基因可作为功能元件转入其他微生物并提高受体菌株的氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性， 为获得具有高效固氮活性和胁迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理论基础，同 时填补了现有技术中没有发现基因能转录成非编码RNA的空白。本发明中构建的具有 /?，/；?基因的重组菌株，在高浓度的氧胁迫下和/或高浓度的盐胁迫下，生存率较高，相同条 件下，不含/?々；?基因的菌株存活率低了很多;/?々；?基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗 性方面具有很大的应用前景。 【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为按照本发明特异响应逆境信号的/7/沉基因的用途及其使用方法中/7/沉基因 对特异信号响应的分析。
[0032] 图2为按照本发明特异响应逆境信号的/7/沉基因的用途及其使用方法中固氮施氏 假单胞菌A1501中/7/沉基因的比对分析。
[0033] 图3为按照本发明特异响应逆境信号的/7/沉基因的用途及其使用方法一优选实施 例中施氏假单胞菌A1501和/7/沉缺失突变株A15 Λ/7/7；?对氧化胁迫敏感性的比较。
[0034] 图4为按照本发明特异响应逆境信号的/7/沉基因的用途及其使用方法一优选实施 例中/7/沉基因缺失对施氏假单胞菌A1501氧化胁迫相关基因转录水平的影响。
[0035] 图5为按照本发明特异响应逆境信号的/7/沉基因的用途及其使用方法一优选实施 例中大肠杆菌Trans 10和重组表达菌株凡co/iTrans 10 (/7/Z?)氧化胁迫敏感性的比较。
[0036] 图6为按照本发明特异响应逆境信号的/7/沉基因的用途及其使用方法一优选实施 例中施氏假单胞菌A1501〇°. A1501)和/?//；?缺失突变株Α15Λ/7/7；?在高浓度盐冲 击条件下存活率的比较。 【具体实施方式】
[〇〇37] 为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明做更为详细地阐述；实施 例仅用于举例说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本发明属于基因工程【技术领域】，具 体操作过程中，在发明的基础上，本领域的技术人员可以根据实际需要做一些非实质性地 修改，这些修改都应属于本发明保护的范围。
[〇〇38] 实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条 件，例如 Sambrook 等分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0039] 实施例1 一、固氮施氏假单胞菌A1501 (A A1501)中/7/7；?基因缺失突变株的构建： 首先利用融合PCR技术将目的基因的上游片段、壮观霉素抗性盒基因以及目的基因的 下游片段融合成一大小约为2. 3 kb的长片段，然后将克隆片段进行和双酶 切，连接到自杀载体pK18mobSacB上。将构建好的自杀重组质粒通过三亲结合的方法导入 到野生型A1501菌中，通过与染色体上基因的同源重组将自杀质粒整合到了染色体上，利 用抗性筛选和PCR验证得到单交换菌株，然后根据基因在10%蔗糖选择压下致死的特 性，将经过PCR验证的单交换克隆按照10'ΚΓ 4和ΚΓ5的稀释梯度分别涂布在含有10%蔗 糖的壮观霉素抗性的LB平板，进行双交换的筛选，经PCR验证得到目的基因/7/沉的缺失突 变菌株 Α15 Λ/7/7；?。
[0040] 二、利用/7/7；?基因提高大肠杆菌TranslO菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的 方法，包括克隆完整的基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗 性的突变菌株。
[0041] 本实施例中，所述基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的DNA转录而成的非编 码RNA基因。
[0042] 本实施例中，所述克隆完整的/?形基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌 Μ?&--ΓΥ)基因组中通过PCR扩增出完整的/?形基因的DNA片段序列，PCR扩 增特异性引物序列为：ncRNAOICBF -SEQ ID Ν0:2 和 ncRNAOlCHR -SEQ ID Ν0:3。
[0043] 本实施例中，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的大肠杆菌TranslO 重组菌株的步骤为： (1) 将克隆出的完整的基因的DNA片段序列进行酶切； (2) 将酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处； (3) 将步骤（2)中的载体通过热激转化的方法转化到菌株中，构建重组表达菌株，即具 有较高氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的大肠杆菌TranslO重组菌株。
[0044] 本实施例中，所述酶切是用和Λ?/^ΙΙΙ酶进行双酶切，所述表达载体是 PLAFR3 载体。
[0045] 本实施例中，在步骤（2)中，还包括在表达载体的多克隆位点处插入验证基因。含 有所述验证基因的表达载体为四环素抗性。
[0046] 三、基因对施氏假单胞菌Α1501和大肠杆菌TranslO菌株胁迫抗性的影响： 所用的菌液：野生型施氏假单胞菌A15 01、本实施例中制备的缺失突变菌株 Α15Δ/?々5、本实施例中制备的大肠杆菌重组菌株凡coJ7TranslO (/?形)、野生型大肠杆菌 E. coli Trans 10 〇
[0047] 在固体平板上挑取单菌落在液体LB培养基中分别过夜培养，次日转接到LB培养 基中使〇D 6(l(l约为0. 1，30°C培养2-3 h，至0D6(KI约0. 6左右。首先各取1 ml菌体，稀释到10_4 为空白对照，然后再各取1 ml菌体加入终浓度为20 mM H202冲击10 min，或加入终浓度1. 5 MNaCl冲击60min，最后将每个处理稀释至10_4,取8 μ 1点到LB固体平板上，30°C或37°C 过夜培养。
[0048] 本发明首先收集20 mM H202冲击10 min的A1501、A15 Λ/?形菌株，然后采用 Promega大量提取RNA试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样品RNA进行单链 DNA(cDNA)反转，最后利用qRT-PCR技术对菌株中氧化胁迫相关基因的转录水平进行分析。
[0049] 氧化胁迫抗性的影响H202冲击实验显示： 1、/?々；？基因的缺失能够降低A1501菌在氧化胁迫条件下的生存率，与野生型相比菌株 生存率降低了一个数量级，如图3所示。
[0050] 2、qRT-PCR结果进一步证明/?//；?的缺失能够降低A1501菌中氧化胁迫相关基因 的转录水平，如图4所示。表明/7/沉可能通过对氧信号的响应参与到了固氮施氏假单胞菌 A1501氧化胁迫抗性的调控过程。
[0051] 3、/7/沉基因的重组表达能够显著提高大肠杆菌TranslO的氧化胁迫抗性，如图5所 示。表明该基因在提高菌株氧化胁迫抗性方面具有一定的应用前景。
[0052] 4、施氏假单胞菌Α1501〇°. Μ?&--τΥΑΙδΟΙ)和/?形缺失突变株Α15Λ/?形在高浓度 盐冲击条件下存活率的比较，如图6所示。从图中可以得出，/7/沉缺失突变株Α15 Λ/7/沉在 高浓度盐冲击条件下存活率低于施氏假单胞菌A1501〇°. ste&eriAlSOl)的存活率，说明 /?，/；?基因的缺失也能够降低A1501菌株在盐胁迫条件下的生存率，与野生型相比生存率降 低了一个数量级，这表明除了影响固氮施氏假单胞菌A1501氧化胁迫抗性以外，也参与 到了菌株渗透调节机制的反应过程，可见，该基因在提高菌株盐胁迫抗性方面具有一定的 应用前景。
[0053] 实施例2 一种特异响应逆境信号的基因的用途，所述基因用于提高固氮施氏假单胞菌 A1501菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性；所述/7/沉基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1 的DNA转录而成的非编码RNA基因。
[0054] -种利用形基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，包括克隆完 整的/?々；?基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步 骤；所述/?/沉基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的DNA转录而成的非编码RNA基因。
[0055] 本实施例中，所述克隆完整的/?形基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌 Μ?&--ΓΥ)基因组中通过PCR扩增出完整的/?//；?基因的DNA片段序列。
[0056] 本实施例中，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤 为： (1) 将克隆出的完整的基因的DNA片段序列进行酶切； (2) 将酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处； (3) 将步骤（2)中的载体通过热激转化的方法转化到野生型大肠杆菌Trans 10中，构建 重组表达菌株，即具有较高氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株。
[0057] 本实施例中，所述酶切是用和Λ?/^ΙΙΙ酶进行双酶切；所述表达载体是 PLAFR3 载体。
[0058] 本实施例中，在步骤（2)中，还包括在表达载体的多克隆位点处插入验证基因；包 含所述验证基因的表达载体为四环素抗性。
[0059] 本实施例中，野生型固氮施氏假单胞菌Α1501菌株中具有/7/沉基因，其本身具有较 高氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性，通过本发明的利用/?々；?基因提高菌株氧化胁迫抗性和/ 或盐胁迫抗性的方法，制备的重组菌株，相比于野生型大肠杆菌TranslO,其耐氧化胁迫和 /或盐胁迫抗性得到了很大的提高。
[0060] 本发明中发明人发现了/7/沉基因为可转录的有功能性的非编码RNA基因，且该基 因可作为功能元件转入其他微生物并提高受体菌株的氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性，为获得 具有高效固氮活性和胁迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理论基础，填补了现 有技术中没有发现/?/沉基因能转录成非编码RNA的空白。本发明中构建的具有/7/沉基因 的重组菌株，在高浓度的氧胁迫下和高浓度的盐胁迫下，生存率较高，相同条件下，不含/?，/；? 基因的菌株存活率低了很多;/?/沉基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性方面具有很 大的应用前景。
【权利要求】
1. 一种特异响应逆境信号的基因的用途，所述基因用于提高菌株氧化胁迫抗 性和/或盐胁迫抗性。
2. 如权利要求1所述的特异响应逆境信号的/7形基因的用途，其特征在于，所述/7形基 因是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的DNA转录而成的非编码RNA基因。
3. 如权利要求1所述的特异响应逆境信号的形基因的用途，其特征在于，所述菌株为 固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌株。
4. 一种利用/7/沉基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，包括克隆完整 的/7/7；?基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步 骤。
5. 如权利要求4所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方 法，其特征在于，所述/?々；?基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的DNA转录而成的非编码RNA 基因。
6. 如权利要求4所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方 法，其特征在于，所述克隆完整的/7/沉基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌基因组中通过 PCR扩增出完整的/7/沉基因的DNA片段序列。
7. 如权利要求4所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方 法，其特征在于，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤为： (1) 将克隆出的完整的基因的DNA片段序列进行酶切； (2) 将酶切后的/7/沉基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处； (3) 将步骤（2)中的载体通过热激转化的方法转化到菌株中，构建重组表达菌株，即具 有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株。
8. 如权利要求7所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方 法，其特征在于，所述酶切是用SaMH和Λ?/^ΙΙΙ内切酶进行双酶切。
9. 如权利要求7所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方 法，其特征在于，所述表达载体是PLAFR3载体。
10. 如权利要求7所述的利用/7/沉基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方 法，其特征在于，所述菌株为固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌株。
【文档编号】C12N1/21GK104046635SQ201410262604
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】燕永亮, 战嵛华, 邓志平, 陆伟, 林敏 , 张新雄, 王亚君 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 东莞市保得生物工程有限公司