玉米低磷响应基因ZmARF31的SNP分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了玉米低磷响应基因ZmARF31基因的SNP分子标记，该SNP标记位于玉米第10号染色体148636105bp位置，等位基因为T和G，位点侧翼序列如SEQ ID NO.1所示，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物扩增得到。该SNP分子标记在正常磷水平和低磷胁迫下与玉米总干重显著相关，位点基因型为G/G的玉米自交系在正常磷水平和低磷胁迫下总干重均高于位点基因型为T/T的自交系。本发明的分子标记可用于玉米辅助育种，加速玉米磷高效特异材料创制与新品种选育进程。
【专利说明】玉米低磷响应基因 ZmARF31的SNP分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及与玉米耐低磷性状相关的分子标记，具 体地，涉及玉米10号染色体上ZmARF31基因内的一个与总千重显著关联的SNP标记、扩^ 其的引物对以及该分子标记的应用。 '
【背景技术】
[0002]玉米是集粮、经、饲为一体的多元作物，同时也是重要的工业原料和能源作物，在 世界范围内广泛分布。20世纪末，随着全球玉米需求的快速增长，其种植面积逐渐超过水稻 和小麦，成为总产量位居世界第一的粮食作物。预计到 2〇5〇年粮食增产的50%将来自玉 米。磷是植物生长发育所必需的二大营养兀素之一，在糖分代谢、能量代谢、酶促反应及光 合作用等过程中起着至关重要的作用，很大程度上决定了作物的产量和品质。然而，由于土 壤对磷强烈的吸附导致土壤中可被植物吸收的有效无机磷浓度低至2 μ m〇l/L左右，土壤 有效磷缺乏成为限制作物产量的重要非生物胁迫因素之一。因此，加强培育和推广磷高效 品种是最为有效的措施，也是农业低碳和可持续发展的有效途径。
[0003]研究和生产实践表明，磷的吸收利用效率在玉米自交系间存在显著的基因型差 异。磷对植物根系发育的影响是复杂的，不仅表现为品种特异性和基因型依赖性，还涉及多 种激素信号通路的交叉调节。磷缺乏时主要通过抑制细胞分裂和静止中心的丢失而严重制 约初生根的生长，同时有效磷通过调控侧生根根原基的初始化，初生根和侧生根的生长以 及侧生根的生长角度，根毛的密度和伸长等改变根系的适应性形态。
[0004]玉米耐低磷相关性状作为一种复杂的数量性状，利用连锁作图进行QTL定位以解 析相关性状的遗传基础已有大量报道。但QTL定位费时费力，且大部分QTL区间宽泛，目前 玉米种质改良和分子辅助育种中尚未有耐低磷主效位点分子标记开发与利用的报道。
[0005]关联分析是一种在自然群体中基于连锁不平衡（LD)鉴定表型性状与遗传标记或 候选基因间关系的分析方法，主要包括基于全基因组扫描（GWAS)和基于候选基因的关联 分析。其中，基于候选基因的关联分析是发掘与表型变异密切相关的功能等位变异的有效 手段。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于提供玉米低磷响应基因 ZmARF31中与总千重显著关联 的SNP (单核苷酸多态性）标记。
[0007] 本发明的第二个目的是提供扩增上述SNP标记的引物对。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述SNP标记的应用。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0010] 基于以上目的， 申请人:收集了中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带 玉米自交系331份，作为本研究的关联群体，利用同源克隆方法获得其低磷响应基因 ZmARF31(GRMZM2G023813)序列，通过多序列比对，发掘该基因在331份玉米自交系中的变 异位点。本申请结合正常磷水平和低磷胁迫处理下玉米自交系苗期根系性状的表型数据， 运用TASSEL软件的一般线性模型和混合线性模型两种方法进行候选基因关联分析，并同 时检测到一个（基因组版本和位置为Maize B73AGP_v3:Chrl0:148636105)与玉米总干重 显著关联的SNP位点。该位点的等位基因为T和G，在供试自交系中有T/T和G/G两种纯合 基因型，其侧翼序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 该SNP分子标记在正常磷水平和低磷胁迫下与玉米总千重显著相关，位点基因型 为G/G的玉米自交系在正常磷水平和低磷胁迫下总干重均高于位点基因型为T/T的自交 系。
[0012] 进一步，本发明提供了上述SNP分子标记在提高玉米总干重中的应用。优选地， SNP分子标记的位点基因型G/G为优异基因型。
[0013] 本发明还提供了上述SNP分子标记在玉米育种中的应用。
[0014] 筛选到该显著关联的SNP位点后，基于该位点侧翼序列， 申请人:设计了包含上述 SNP位点的检测玉米低磷响应基因 ZmARF31基因的特异性引物对。引物对序列如下所示：
[0015] 上游（F) :GCCTCCCCACCGTCGGCGA(SEQ ID N0. 2)
[0016] 下游（R) :TGGCCATCGGGAAAGTAGTAG(SEQ ID NO. 3)
[0017] 本发明提供了上述引物对在玉米种质改良中的应用。
[0018] 本发明还提供了上述引物对在选育抗逆玉米中的应用。
[0019] 本发明提供一种检测玉米低磷响应基因 ZmARF31的方法，用上述引物对进行PCR 扩增，待检测玉米基因组DNA，如果能够扩增出SEQ ID NO. 1所示的片段，则说明该待检玉米 存在低磷响应基因 ZmARF31。
[0020] PCR程序为：98°C预变性90s ;95°C变性5s、57°C退火5s，共50个循环。
[0021] 本发明提供了上述方法在玉米育种中的应用。
[0022] 为进一步验证所开发标记的有效性，发明人在关联群体中随机挑选16份玉米自 交系，以DNA为模板，采用饱和荧光染料Eva-Green Super Mix进行基于PCR扩增的HRM(高 分辨率溶解曲线）验证，结果显示该SNP位点成功地对I6份玉米自交系进行基因分型检测 (见图1)。
[0023] 同时，发明人利用前期构建的玉米耐低磷RIL群体（P178X9782)中的198个家系 的DNA为模板，对该位点进行HRM验证（图2)。结果发现在该RIL群体中，SNP位点与正常 磷水平和低磷胁迫下总干重存在显著相关性（图3)，与ZmARF31基因在331份玉米自交系 中的关联分析结果基本一致。
[0024] 本发明还提供了一种检测玉米低磷响应基因 ZmARFl的试剂盒，其含有SEQ ID NO. 2?3所示的引物对。本发明结合ZmARF31在自然群体中的序列多样性，利用候选基因 关联分析策略揭示该基因与低磷胁迫下玉米根系性状之间的内在联系，发掘其中显著的功 能位点，并作为遗传标记应用于玉米分子育种,对提高玉米抗逆性具有重要意义。
[0025]本发明的有益效果在于：运用候选基因关联分析方法，能够快速、精确地检测与 特定性状显著关联的SNP或InDel位点。玉米10号染色体148636105bp位置的SNP位点 (Maize B73AGP_v3:Chrl0:148636105)与正常磷水平下玉米苗期总干重显著相关，解释表 型变异为 3· 〇8%。该SNP位点能够作为遗传标记，用于抗逆玉米育种，提高玉米耐低磷能 力，具有较高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为16份玉米自交系中基于PCR扩增的HRM(高分辨率溶解曲线）分析。其中 黑色和灰色曲线分别表示基因型"T/T"和"G/G"。
[0027] 图2为RIL群体中72个家系基于PCR扩增的HRM(高分辨率溶解曲线）分析。其 中黑色和灰色曲线分别表示基因型"T/T"和"G/G"。
[0028] 图3为RIL群体T/T和G/G基因型个体的总干重比较。TDW表示性状总干重；CK 和T分别表示正常磷水平对照组和低磷胁迫处理组；*表示〇· 01 < p < 05, ***表示 Ρ〈0· 001。RIL群体中具有T/T基因型和G/G基因型的家系分别为1〇1和82个。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0030] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0031] 实施例1玉米低磷响应基因 ZmARF31与总千重显著相关的一个SNP分子标记的获 得及其检测引物的确定
[0032] 本发明玉米低磷响应基因 ZMRF31与总干重显著相关的一个SNP分子标记是通过 以下方法获得的：
[0033] 1)收集获得331份来自中国、美国、墨西哥的玉米自交系，构建了作图所用的关联 群体。该群体有着丰富的遗传多样性，包含131个温带玉米自交系和200个热带/亚热带 玉米自交系。
[0034] 2)关联群体苗期根系表型鉴定。分别于2010年在四川农业大学多营农场基地 和2〇12年在四川农业大学雅安教学实验大棚对获得的331份玉米自交系进行以新鲜河沙 为基质的盆栽试验。待玉米生长至两叶一芯期后，定期浇灌改良的霍格兰营养液。其中对 照组施烧正吊的全素营养液（磷含量为In^ol/Q，低磷胁迫组施饶低磷营养液（磷含量为 Ιμπιο?/L)，培养至6叶期。每个自交系选取5株，运用Eps〇n Expressi〇n i〇〇〇〇XL扫描仪 和Regent Winrhizo Canada根系分析系统测定供试自交系的根系性状，之后将植株分装在 不同的纸袋中置于ΙΟδΓ杀青3〇 min，并75°C烘干至恒重。正常磷水平条件下总千重的平均 值为1. 1扣，低磷胁迫下总干重的平均值为〇· ?4g。方差分析表明，总干重在不同自交系和 不同处理下差异达极显著水平（表υ。
[0035]表1总干重在正常供磷水平和低磷胁迫处理的方差分析
[0036]
【权利要求】
1. 玉米低磷响应基因 ZmARF31的SNP分子标记，该SNP分子标记位于玉米第10号染色 体148636105bp位置，等位基因为T和G。
2. 如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，其位点侧翼序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
3. 权利要求1?2任一所述的SNP分子标记在玉米育种中的应用。
4. 权利要求1?2任一所述的SNP分子标记在提高玉米总干重中的应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，SNP分子标记的位点基因型为G。
6. 检测权利要求1或2所述SNP分子标记的引物对，其特征在于， 上游引物序列，5' -GCCTCCCCACCGTCGGCGA-3' ； 下游引物序列，5 ' -TGGCCATCGGGAAAGTAGTAG-3 '。
7. 权利要求6所述引物对在玉米种质改良中的应用。
8. -种检测玉米低磷响应基因 ZmARF31的方法，其特征在于，用权利要求6所述的引物 对进行PCR扩增待检测玉米基因组DNA，如果能够扩增出SEQ ID NO. 1所示的片段，则说明 该待检玉米存在低磷响应基因 ZmARF31基因。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，PCR程序为：98°C预变性90s ;95°C变性5s、 57°C退火5s，共50个循环。
10. -种检测玉米低磷响应基因 ZmARFl的试剂盒，其含有SEQ ID NO. 2、3所示的引物 对。
【文档编号】C12Q1/68GK104232764SQ201410446335
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】卢艳丽, 吴锋锴, 刘玲, 李嘉, 徐洁, 兰海, 高世斌, 吴元奇, 周树峰, 刘亚西, 曹墨菊 申请人:四川农业大学