菜豆耐低磷胁迫重要基因PvSPX1的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程和生物【技术领域】，具体涉及菜豆耐低磷胁迫重要基因PvSPX1的应用。本发明公开了菜豆中一个低磷诱导表达的基因PvSPX1的功能和应用，该基因的表达受外源磷浓度的调控。在菜豆离体毛根中超量表达该基因，还能增强一系列低磷响应基因的表达，并且该基因的表达受转录因子PvPHR1的正调控；该基因的功能研究对于解析豆科作物适应低磷胁迫的分子机理有着深远的研究意义。
【专利说明】菜豆耐低磷胁迫重要基因PvSPXI的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程和生物【技术领域】，具体涉及菜豆耐低磷胁迫重要基因PvSPXl的应用。
【背景技术】
[0002]磷是植物生长必需的营养元素之一，参与了植物体内众多的生理生化反应和新陈代谢，是维持植物生命活动的关键物质。但是，土壤中的磷肥极容易被土壤固定，从而难以被植物吸收和利用，造成磷肥利用效率低，低磷效已经成为限制作物生长和产量提高的主要因素(Vance et al., 2003; Richardson et al., 2009)。研究表明，植物在长期进化中形成了一套应对低磷胁迫的机制，如:改变根的形态构型(Liao et al.，2001; Liao etal., 2004);增加氢离子和有机酸的释放(Wang et al., 2010; Tian et al., 2012);增加酸性磷酸酶的分泌和提高根际酸性磷酸酶活力(Liang et al.，2010)等。研究表明，这些生理机制由磷信号网络调控，一系列低磷响应基因参与其中。
[0003]以往的研究表明，在磷信号网络中，含SPX结构域的蛋白被认为是重要的调控因子。SPX蛋白家族包含SPX结构域，其成员在磷信号传导网络中的功能陆续被报道。在拟南芥中和在磷信号传导网络中处于下游，分别正调控和负调控一些低磷诱导基因(Duan et al.，2008)。此外，J的敲除突变体主根缩短，地上部磷浓度增加，根部磷浓度降低，表明参与调控了根的形态和磷的动态平衡(Duan et al.，2008)。最近的研究表明，水稻OsSPXl是磷信号网络中的负调控因子，抑制了 0smR2对0sPT2的正调控作用(Liu et al., 2010)。同时，也参与了磷动态平衡的调节。实验证明，在磷充足情况下，过量表达的植株生长矮小，并且在叶部出现磷中毒斑点(Wang etal., 2009a; Wang et al., 2009b)。
[0004]H iPhaseolus vulgaris.L.)是重要的豆科作物之一，同时也是重要的食用豆类之一，占全球食用豆产量的50%(张晓艳等，2007)。菜豆原产于美洲，是当地的重要粮食作物；菜豆营养价值也很高，不仅富含蛋白质，还含有多种维生素和微量元素(王鹏等，2009)。另外，菜豆还是一种高钾、高镁和低钠食品，是调节膳食结构的优质食品(张晓艳等，2007;王鹏等，2009)。随着生物技术的发展，关于模式植物拟南芥和水稻中的磷信号传导网络的研究已经逐渐清晰，但豆科作物的磷信号网络却鲜有报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有豆科作物磷信号网络研究和应用技术的不足，提供一种菜豆耐低磷胁迫重要基因的应用。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
本发明通过实验研究发现:菜豆耐低磷胁迫重要基因不仅影响了菜豆根系的生长和菜豆根系周围的磷浓度，而且超量表达该基因，还能增强一系列低磷响应基因，如 PvPHTl, PvPHT2, Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3, PvPAP4, PvPAP5, PvPS2:l 和PvLPRl-1ike基因的表达，并且该基因的表达受转录因子的正调控。
[0007]因此，本发明提供了菜豆耐低磷胁迫重要基因在制备促进植物适应酸性土壤制剂中的应用。优选地，所述植物为双子叶豆科植物；更优选地，所述双子叶豆科植物为菜豆。
[0008]本发明还提供了菜豆耐低磷胁迫重要基因在制备增加植物根部磷浓度的制剂中的应用。优选地，所述植物为双子叶豆科植物；更优选地，所述双子叶豆科植物为菜豆。
[0009]本发明还提供了菜豆耐低磷胁迫重要基因在制备加强PvPHT2,Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3, PvPAP4, PvPAP5,和 / 或基因表达的制剂中的应用。
[0010]本发明还提供了菜豆耐低磷胁迫重要基因在制备抑制基因表达的制剂中的应用。
[0011]其中，所述基因的表达受转录因子/的正调控。
[0012]本发明有益效果:
PvSPXl基因所属的5ΚΤ基因家族在拟南芥和水稻等虽已被克隆及报道，但其在豆科作物磷信号网络方面的生物学功能并不清楚。本发明的基因对菜豆根系生长和磷浓度有显著的影响，这对阐明5KT基因在豆科作物适应酸性土壤低磷胁迫的生物学功能有着
重要意义。
[0013]本发明通过研究发现:菜豆耐低磷胁迫重要基因不仅影响了菜豆根系的生长和菜豆根系周围的磷浓度，而且超量表达该基因，还能增强一系列低磷响应基因，如 PvPHTl, PvPHT2, Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3, PvPAP4, PvPAP5, PvPS2:l 和PvLPRl-1ike基因的表达，并且该基因的表达受转录因子的正调控；该基因的功能研究对于解析豆科作物适应低磷胁迫的分子机理有着深远的研究意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1.PvSPXl融合GFP蛋白在洋葱表皮细胞的亚细胞定位分析；图中第一排为转化空载体的洋葱表皮质壁分离前后；紧接着第二排是转化载体的洋葱表皮质壁分离前后；图为共聚焦显微镜下观察拍摄GFP和-β〒的荧光信号；标尺=50 Mm。
[0015]图2.不同磷浓度对PvSPXl基因表达的影响；图A为根部PvSPXl基因的相对表达量；图B为叶部基因的相对表达量；数据采用四次重复的平均值和标准误；不同字母表示显著水平/X0.05时，差异显著。
[0016]图3.PvSPXl响应低磷胁迫的时空表达模式；图A为叶部基因的相对表达量；图B为根部基因的相对表达量；数据采用四次重复的平均值和标准误；不同字母表示显著水平/X0.05时，差异显著。
[0017]图4.PvSPXl在转基因毛根的表达量检测；用定量PCR检测基因表达微-PvSPXl表示过量表达的转基因毛根；CK表示转化空载体的转基因株系；数据采用四次重复的平均值和标准误；星号表示基因的相对表达量在过量表达株系和对照之间差异性比较(t-检验);**: 0.001^7<0.010
[0018]图5.过量表达对转基因毛根鲜重和磷浓度的影响；图A为对照和过量表达PvSPXl转基因毛根在高低磷条件下的表型，标尺=I Cm ;图B为菜豆毛根在高低磷处理下的鲜重；图C为菜豆毛根在高低磷处理下的磷浓度；数据采用三次重复的平均值和标准误；星号表示同一性状中过量表达和对照之间差异性比较(t-检验)；*: p<0.05;**: 0.001^7<0.01 ；ns:差异不显著微-PvSPXl表示过量表达的毛根；CK表示转化空载体的对照菜豆毛根。
[0019]图6.菜豆毛根在高低磷处理下的形态和根毛区比例；图A为菜豆毛根在高低磷处理下的图像；图B为高低磷处理下根毛区占侧根百分比；每个重复选取10条侧根作进一步分析微-PvSPXl表示过量表达的毛根，CK表示转化空载体的对照菜豆毛根；星号表示显著水平/X0.05时，差异显著；ns:差异不显著。
[0020]图7.PvSPXl下游基因在对照和过量表达转基因毛根中的表达；图A为PvPHT2、PvPHTU在对照和过量表达转基因毛根中的相对表达量；图 B 为 PvPAP3、PvPAP4、PvPAP5、PvLPRl-like、PvPDR2~like 在对照和过量表达转基因毛根中的相对表达量；0X-1和0X-2表示两个过量表达的转基因菜豆毛根株系；CK表示转化空载体的对照菜豆毛根；数据采用四次重复的平均值和标准误；星号表示下游基因的相对表达量在过量表达毛根株系和对照之间差异性比较(t_ 检验)p<S).05; **: 0.001</7<0.01; ***: p<S).0Ol0
[0021]图8.PvSPXl在对照和超量表达转基因毛根中的表达微-PvPHRl-l、Ol-PvPHRl-2, 0X-/V/%K7-J表示三个过量表达的转基因菜豆毛根株系；CK表示转化空载体的对照菜豆毛 根；数据采用四次重复的平均值和标准误；星号表示基因的相对表达量在过量表达毛根株系和对照的平均值之间差异性比较(t-检验)；**:0.0014〈0.01。
【具体实施方式】
[0022]下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。
[0023]实施例1
发明人在前期的研究中已经克隆得到了菜豆耐低磷胁迫重要基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。
[0024]1.载体的构建
过量表达载体的构建:以菜豆基因型G19833低磷cDNA为模板，用基因特异引物-PYL-F (SEQ ID NO: 3)和-pYL-R (SEQ ID NO:4)扩增出的编码区片段，反应条件为94°C，4分钟；94°C，45秒；58°C，45秒；72°C，I分钟；35个循环。将所得片断插入pMD18-T载体，在16°C连接一小时后转化DH10B，12小时后将阳性克隆摇菌，抽提得到重组质粒。用BernH I和#々/ I双酶切重组质粒和pYLRNAi载体，回收酶切片段，将目的基因片段和载体片段用连接试剂盒在16°C进行连接反应，两小时后转化DH10B，12小时后将阳性克隆摇菌，送样测序无误后抽提质粒在_20°C保存待用。
[0025]SEQ ID NO:3:GGATCCTATGAAATTCGG
SEQ ID NO:4:ACGCGTTTACTTGGCTGTCTGTTCC
亚细胞定位分析表达载体的构建:以菜豆基因型G19833低磷cDNA为模板，用基因特异引物A^SKO-GFP-F (SEQ ID NO:5)和A^SdZZ-GFP-R (SEQ ID NO:6)扩增出除去终止密码子的PvSPXl编码区片段，反应条件为94°C，4分钟；94°C，45秒；58°C，45秒；72°C，I分钟；35个循环。将所得片断插入连接到PMD18-T载体，在16°C连接一小时后转化DH10B，12小时后将阳性克隆摇菌，抽提得到重组质粒。用油a I取BamH I双酶切重组质粒和pBEGFP载体，回收酶切片段，将目的基因片段和载体片段用连接试剂盒在16°C进行连接反应，两小时后转化DH10B，12小时后将阳性克隆摇菌，送样测序无误后抽提质粒在_20°C保存待用。
[0026]SEQ ID NO:5:TCTAGATATGAAATTCGGAAAGAGTC
SEQ ID NO:6:GGATCCCGCTTGGCTGTCTGTTCCAG
2.亚细胞定位及其基因表达模式分析
(I )PvSPXl亚细胞定位分析:通过基因枪转化法，将装载A^SdZZ-GFP载体和pBEGFP空载体导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达。然后用共聚焦显微镜观察洋葱表皮细胞的GFP荧光信号。结果如图1所示。由结果可知，-GFP的荧光主要分布于细胞核中，说明蛋白定位于细胞核中。
[0027](2 ) PvSPXl基因的表达模式分析 不同磷浓度对PvSPXl基因表达的影响:
挑选种皮无破损，大小均一的菜豆G19833种子,用3%过氧化氢(H2O2)表面消毒一分钟，随后用去离子水冲洗2次，用1/4 Hoagland营养液浸泡半小时，进行纸培催芽。5天后，转移到分别含500 μ MUOO μΜ、50 μ M和5 μ M KH2PO4的营养液。试验中所用营养液配方为1/2 Hoagland营养液配方，-P处理用K2SO4补充全营养液中KH2PO4的K元素。样品处理10天后收取RNA样品和生理指标测定样品，收样部位分为地上部和根部，提取根部和叶部RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测PvSPXl的表达模式。
[0028]荧光定量PCR参照TAKARA公司(日本)SYBR Green定量试剂盒说明书的方法进行，用 Rotor-Gene 3000 qRT-PCR 系统(Corbett Research,澳大利亚)运行。将 cDNA样品稀释100倍作为实时定量PCR反应模板，选取四个待测基因一定会表达的cDNA原液稀释4倍作为I倍标样制作标准曲线。20 μ L反应体系为，2X SYBR Green PCR master mix10 μ L，Mili_Q水6.4 yL, 10 μ M正反向引物各0.8 μ L，稀释的cDNA模板2 μ L0反应程序为95 °C变性I min，然后94 V 15 s，60 V 15 s，72 V 30 s，进行40次循环。用Real-Time Analysis Software 6.0 (Corbett Research,澳大利亚)计算分析每个样品的表达量。菜豆的看家基因处’-办子(SEQ ID NO: 7)取EF-1a-R (SEQ ID NO: 8)作为内参。
基因的定量引物为(SEQ ID NO:9)与(SEQ ID NO: 10)。
[0029]SEQ ID NO:7:TGAACCACCCTGGTCAGATT
SEQ ID NO:8:TCCAGCATCACCATTCTTCA
SEQ ID NO:9:GGCAACTCCCCAAGCTGAG
SEQ ID NO:10:AAACCACCCATCTGCAGCG
结果如图2所示，随着磷浓度的增加，的相对表达量逐渐降低，的相对表达量在营养液中的磷浓度为5 μΜ时达到最大值，并随着磷浓度的增加而逐渐降低。当营养液的磷浓度达到500 μΜ时，几乎检测不到的表达。说明受低磷胁迫而增强表达。
[0030]不同低磷处理时间对基因表达的影响:挑选种子，进行表面消毒和纸培催芽，具体操作如上所述。5天后，幼苗转移到1/2Hoagland营养液，生长7天后，幼苗转入含5 μ M KH2PO4的低磷营养液，按试验设计在塑料面包箱中盛入营养液，盖上聚苯乙烯泡沫板，将幼苗用海绵条固定在聚苯乙烯泡沫板相应的孔中。样品分别于低磷处理0、4和8天后收取RNA样品和生理指标测定样品，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测的表达模式。荧光定量PCR检测方法同步骤(2)所述。
[0031]结果如图3所示，的表达量在低磷处理第四天的叶部显著增加，的转录水平在低磷处理第八天的根部和叶部显著上升，达到检测时间段的最高值。这些结果表明PvSPXl能较早地对低磷胁迫作出响应。
[0032]实施例2
1.转基因材料的获得
将构建好的超量表达载体质粒用冻融法转入发根农杆菌K599。挑取阳性克隆接种于相应抗性的YEP培养液，25°C，200 rpm摇菌16小时。用沾有菌液的解剖刀切去胚根，留约3 mm胚轴，将子叶连带胚轴用沾菌液的解剖刀纵切，用沾菌液的刀口在子叶节和胚轴轻轻点几下。子叶切口朝上置于湿润的灭菌滤纸上，25°C光照培养。3天后将子叶转移到毛根诱导培养基培养。毛根长出后，将长度大于I cm的毛根切下转移到毛根生长培养基，每星期继代一次。
[0033]2.转基因材料的检测
转基因毛根的检测:转基因毛根经潮霉素抗性筛选后，提取该转基因系植株的RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测超量表达基因的效果。菜豆看家基因处Wa作为参照基因，相对表 达量为目的基因的表达量与看家基因表达量的比值。看家基因的检测引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的检测引物为SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。
[0034]反应体系:包含10 μΜ 上下游引物各 0.6 μ?, 2 X SYBR Green PCR master mix 10μ?，然后用Mil1-Q水补足20 μ?。PCR反应程序为:95 V I分钟；95 V 15秒，58 V 15秒，72 V 30秒，扩增35个循环。
[0035]PvSPXl在转基因毛根的表达量检测如图4所示，结果表明在转基因毛根中已经被显著地超量表达。
[0036]3.转基因植物中过量表达的功能分析 Cl)过量表达对转基因毛根生长的影响
在磷浓度处理的实验时，每皿接种约0.2 g鲜重的毛根到+P(l.25 mM KH2PO4)或者-P (O μ M KH2PO4)的MS培养基。每星期继代一次，生长14天后收样。毛根鲜重用万分之一天平测量。每个处理有四个独立的生物学重复。
[0037]转基因毛根用显微镜(LEICA，德国)观察，用LEICA DFC 480相机进行拍照(LEICA,德国)。转基因毛根的单条侧根扫描后用Win-Rhizo软件(R6gent Instruments,加拿大)分析根长，每皿取不少于10条侧根。根毛区标准为I mm根长内不少于10条根毛。
[0038]过量表达对转基因毛根鲜重和磷浓度的影响如图5所示，过量表达的转基因毛根的生物量在高磷和低磷条件下分别降低了 60%和40%，此结果表明过量表达PvSPXl能显著抑制根系生长。此外，过量表达的转基因毛根的磷浓度在高磷和低磷条件下分别比对照增加47%和33%，表明是显著增加根部磷浓度的重要基因。
[0039]菜豆毛根在高低磷处理下的形态和根毛区比例如图6所示，低磷处理下，所有毛根的根毛区比例都超过80%。但在高磷处理下，CK的根毛区比例降低超过50%。但是，过量綠PvSPXl的转基因毛根的根毛生区比例不受增加磷的影响。以上结果表明，超量表达PvSPXl能增加高磷时根毛区的比例，PvSPXl参与调控了低磷胁迫下根系形态的改变，以适应低磷胁迫。
[0040](2)过量表达对低磷响应基因表达的影响
收获生长14天后的转基因毛根，提取RNA，反转录成cDNA，以此cDNA为模板进行低磷响应基因表达量的定量PCR检测。选取11个低磷响应基因iPSI)作为候选基因，包括PvPHTl (菜豆高亲和磷转运子，参与磷吸收，TC27368)，PvPHT2{菜豆低亲和磷转运子，参与地上部和根部磷的转运，TC30856)，Pv4{与At4同源，参与调控地上部和根部磷的转运，CV536419)，五个紫色酸性磷酸酶/^故没、PvPAP3, PvPAP4 和 /^/W^(BAD05166、CAA04644、AC025293、AAF60317 和 ADK56125)，PvPS2:l (蛋白磷酸酶，EF472460)，PvLPRl-HkeiAtLPRl功能缺失的突变体产生对磷胁迫不敏感，长根的表型，FE710903)和PvPDR2~like ipdr2突变体对低磷胁迫超敏感,产生更短的根，并且在低磷情况下比野生型有更高的磷浓度，TC44308)。
[0041]结果表明，作57叹7加强PvPHT2, Pv4, PvPAPl, PvPAP2, PvPAP3,PvPAP4, PvPAP5, PvPS2:l PvLPRl-1ike 的表达，并且负调控了 PvPDR2_like 基因的表达(图7)。该结果表明，在磷信号网络中是一个正调控因子，在低磷时
的表达增强，进而通过增强下游基因的表达，加强对低磷胁迫的适应性。
[0042](3 )过量表达PvHIRI对PvSPXl表达的影响 为进一步分析在磷信号网络中的作用，本实验在菜豆毛根中过量表达了并通过qRT-PCR技术，分析了 PvPHRl与PvSPXl在转录水平上的互作关系。结果显示，过量表达能显著增强基因在转基因毛根中的表达，表明在磷信号网络中处于飞澉，哽PvPHRl的正调控，初步确定了基因在磷信号网络中
的位置(图8)。
【权利要求】
1.菜豆耐低磷胁迫重要基因在制备促进植物适应酸性土壤制剂中的应用。
2.菜豆耐低磷胁迫重要基因在制备增加植物根部磷浓度的制剂中的应用。
3.菜豆耐低磷胁迫重要基因PvSPXl在制备加强PvPHTl，PvPHT2,Pv4, PvPAPl，PvPAP2, PvPAP3,PvPAP4,PvPAP5, PvPS2:l 和 / 或PvLPRl-like 基因表达的制剂中的应用。
4.菜豆耐低磷胁迫重要基因在制备抑制基因表达的制剂中的应用。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于，所述基因的表达受转纖子PvPHRl的正调控。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶豆科植物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述双子叶豆科植物为菜豆。
【文档编号】C12N15/82GK103789342SQ201410004568
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】田江, 廖红, 姚祝芳 申请人:华南农业大学