专利名称：一种调节植物耐低磷胁迫的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一个植物耐低磷相关蛋白及其编码基因与应用和利用该基 因增强植物耐低磷的方法。二、 背景技术尽管土壤中磷元素含量丰富，但是大量的磷是以植物不能直接利用的形式存在， 因此植物经常处于缺磷环境中。为了提高作物产量，在传统农业中往往通过大量施用 磷肥来提高产量和品质，而磷的利用率却很低， 一般只有10% 25%，将近75 % 卯％积累在土壤中。因此，除传统的农业育种外，利用基因工程技术提高作物的耐低磷能 力具有重要的理论与经济意义，而这项工作的关键在于对植物耐低磷分子机理的认识及关键 基因的克隆。拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。 拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研: 究。因此，对拟南芥耐低磷的分子生物学机制的研究对提高作物的耐低磷能力具有重要的 理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库(www.arabidopsis.org) 寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同 国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的 功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究， 发现了一些耐低磷基因的功能，如AtPTl， AtPAPl， At4， AtPT2， AtACP5等，这些基因在 突变体和野生型中的转录水平不一样。目前，还未找到有效的具有耐低磷功能的基因。面对日益严重的农作物缺磷问题，寻找 新的耐低磷功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。根据拟南芥数据库公布的基因组序列，发现基因MJX《AT4G32810)在植物茎分化中具有调控作用。然而，其在植物耐低磷胁迫中作用未知。基因转录水平分析显示，在缺磷条件下，其转录水平显著降低。为此， 我们研究了该基因功能，并发现该基因具有调控植物耐低磷的作用。三、 发明内容本发明的目的是提供一种新的植物耐低磷相关蛋白及其编码基因。本发明所提供的植物 耐低磷相关蛋白的编码基因M4X4，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥(Col-O)，其蛋白是具有3下述氨基酸残基序列之一的蛋白质(1) 序列表中的SEQIDNo: 2;(2) 将序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与植物耐低磷相关的蛋白质。序列表中的序列2由570个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加。M^^的编码基因也属于本发明的保护范围。 MlW的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一；(1) 序列表中SEQIDNo: 1的DNA序列；(2) 编码序列表中SEQIDNo: 2蛋白质序列的多核苷酸；(3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo:l限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；(4) 与序列表中SEQIDNo: 1限定的DNA序列具有90。/。以上同源性、且编码相同功能 蛋白质的DNA序列。序列表中的序列1由1960个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'端第82位至1791 位碱基，编码序列SEQIDNo: 2的蛋白质。含有本发明M4^/的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增M4X4 中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物对低磷耐受性的方法。本发明所提供的增强植物对低磷耐受性的方法，是抑制植物耐低磷相关蛋白编码基因 的表达，该表达可通过多种方法实现。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法， 只要能抑制M4JW表达即可。利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除后，植物表现 为耐低磷性状；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的 M4X4转入植物中，植物就表现出对低磷耐受。本发明的M4^/基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前 可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及 筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等) 或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶 植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树或苜宿等。 从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物耐低磷症状来筛选转化植株。携带有本发明M4X4基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的植物经组织培育成植株。本发明的植物耐低磷相关蛋白及其编码基因为农作物耐低磷育种提供基因与技术支持。下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。四
图1为wo^-7、 wo^-S和野生型植株的在正常光照培养条件下生长五周的比较； 图2为附ox4-7、 max一S和野生型植株的对低磷的耐受性比较(A、 MS对照组和低磷组； B、主根长；C、根冠比)图3为;maW、 wo^-S和野生型的磷含量比较(A、 MS对照组；B、低磷组) 图4为m"x4突变体在低磷胁迫下相关基因的表达变化。五具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。 实施例1、 MAX4及其编码基因的获得以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提取其总 RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Ferrnentas公司)试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条 链。以提取出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应20pl反应体系，内 含10xPCR缓冲液2 pi, dNTPs (10mM)混合物0.4 pl，引物1和引物2各2 pl， Tag 酶(5U 1) 0.2 pi ， 其余加双蒸水至20 nl 。 其中，弓l物 1 : 5' -TGCCCTCTTTCCAATACACTG-3'，弓l物2: 5'-AACTGTATCCACCACAATCCG-3'。先 94。C预变性3min，再94。C 30 sec， 54。C30sec， 72 °C 60 sec，共计35个循环，最后 72'C延伸10min，将获得的PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的cDNA 片段连接于pGEM-T载体，得到含有目的片段的载体pT-MAW，进行测序鉴定，结 果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列SEQ ID No: 1的DNA序列，为 的cDNA基因，由1960个碱基组成，其编码序列为自5'端第82位碱基到第1791 位碱基，编码具有序列表中序列SEQIDNo: 2的氨基酸残基序列的蛋白质。 实施例2、培育对低磷耐受性增强的拟南芥 1、 M4Z4基因被敲除的纯合突变体wo^-7、 /wo^-S的获得从美国拟南芥种质资源中心获得了两个T-DNA插入突变体种子(SALK一072708， Awax4-7; SALK—147538， wajc4-S;http:〃www.arabidopsis.org/servlets/TairObject type=germplasm&id=4626493)。为鉴定M4X4 基因被敲除的纯合突变体，将SALK—072708和SALK_147538种子种于土培上，提取单 株植株RNA，反转录成cDNA后，以cDNA为模板，用下述引物对其进行PCR扩增/wax4-7, 引物lLBbl: 5'誦GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3，引物2: MAX4-7LP5'-AGTACGACGACGTATTGTCCG-3 ，，引物3: MAX4-7RP 5 ，-GGATTGATGCTGCACATATCC -3，；max4-8,引物lLBbl: 5，-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3,引物4: MAX4-8LP 5，-LP AGACAAACCCCATTCATCATG-3',引物5: MAX4-8RP5'-CTCTAGCGTCTCATGGTCGAC-3，。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，获得 基因被敲除的纯合突变体mo^-7浙附a;^-S。为阐明MJZ4基因功能缺失突变是否会对 发育产生影响，比较了在正常光照条件下突变体majc一7、 ;wa;^-《和WT生长发育(图 1)，发现在正常土培培养条件下突变体ma;c(7、 max(S与WT的形态没有显著差别， 表明MAW基因功能缺失突变对植株生长发育没有产生显著影响。用该基因的cDNA 序列构建35S强动子的过表达载体并转化突变体，该转基因植株形态上恢复了野生型表型， 在低磷条件下也恢复了野生型植株症状，证实了该基因确实控制对低磷耐受性状。2、 突变体max4-7、 ma^/-S与野生型植株对低磷耐受性比较 将野生型与突变体ma^-7、 wax4-S同时播种于直径为90mm的平皿中(平皿中分别加有MS和低磷半固体培养基)，4"春化3天后，置于22'C恒温光照下(光周期为16小时光照， 8小时黑暗)培养。15天后观察结果。从图2A可以看出，与野生型相比，突变体max4-7、 表现出了对低磷耐受性的性状。低磷胁迫条件下突变体ma^-7、 wax4-S的主根长明显高于 野生型(图2B)。根冠比测定结果也显示，在低磷培养条件下，突变体附ax一7、 ma^-S的根 冠比明显高于野生型(图2C)。上述结果表明ma^-7、 wax(S耐低磷能力比野生型强。3、 低磷胁迫条件下max4-7、 和野生型植株磷含量比较为进一步确定wax4-7、 /ma:S耐低磷胁迫是否与其体内磷含量有关，测定了在 正常生长和低磷胁迫条件下附ax(7、 max4-S和WT植株根和茎部磷含量。在正常生 长条件下，附w一7、mfl;^-S和WT植株的根部和茎部积累的磷没有显著差异(图3A)。 然而，在低磷胁迫条件下，/m^4-7、 mca(S的根部和茎部积累的磷明显比WT高(图 3B)，说明在磷饥饿胁迫时，突变体wax(7、 较WT更好地富集了根周围的磷，以致突变体植株受到较小的伤害，这与上述表型结果一致。4、附^￥突变体在低磷胁迫下相关基因的表达变化植物对缺磷条件的适应会涉及很多种基因表达调控。为进一步说明突变体 m^4-7、 wax4-S对低磷胁迫耐受的可能分子机理，用RT-PCR的方法检测了低磷胁迫 条件下磷诱导相关基因的表达(图4)。 J/S/Zi是植物的一种小SUMOE3连接酶，是 低磷反应的负调控因子，它是一种磷缺乏反应中的关键控制因子。从图4可以看出， 它在低磷诱导下的WT根部中转录水平很高，而在突变体中的根部转录水平非常低； 在低磷条件下突变体的J"A^/基因表达模式也发生明显改变。这些结果进一步说明 突变体wflj^-7、 wm:(S较WT更加对低磷胁迫耐受。序列表1 SEQ ID No:l (Nucleotide S叫uence，Sequence Length (bp) - 1960 )1TGCCCTCTTTCCAATACACTGAAATCCACTTCAAAATATTTATTTAATAA51AAAGAAAAGAAAAGAAAAAAACTCTGCCAGGATGGCTTCTTTGATCACAA101CCAAAGCAATGATGAGTCATCATCATGTTTTGTCGTCAACTAGAATCACT151ACTCTTTATTCCGACAATTCCATCGGCGATCAACAAATAAAAACAAAACC201TCAAGTCCCTCACCGGTTATTTGCTCGGAGGATCTTCGGTGTAACCAGAG251CTGTAATTAATTCAGCGGCACCGTCTCCGTTGCCGGAGAAAGAGAAGGTG301GAAGGTGAGAGACGGTGTCATGTTGCGTGGACAAGTGTACAACAAGAGAA351TTGGGAGGGTGAACTTACTGTCCAAGGAAAGATACCCACTTGGCTGAATG401GTACGTACCTAAGAAACGGTCCTGGTCTATGGAACATTGGAGACCACGAT451TTCCGGCATCTCTTCGACGGCTACTCCACACTCGTCAAGCTTCAATTCGA501TGGCGGTCGTATATTCGCCGCCCACCGTCTCCTTGAATCCGACGCTTACA551AAGCCGCCAAGAAACACAATAGGCTTTGTTACCGTGAATTCTCCGAGACT601CCAAAATCGGTGATCATAAACAAAAACCCTTTCTCCGGGATCGGAGAAAT651CGTCAGGCTTTTCTCCGGAGAGTCTTTAACGGACAACGCCAACACCGGAG701TGATCAAACTCGGTGACGGGCGGGTCATGTGTCTGACGGAGACTCAAAAA751GGATCGATTTTAGTCGACCATGAGACGCTAGAGACGATCGGGAAATTTGA801GTACGACGACGTATTGTCCGATCATATGATCCAATCAGCGCATCCGATAG851TGACGGAGACGGAGATGTGGACGTTGATACCGGATTTGGTTAAACCGGGT901TATCGGGTCGTGAGGATGGAAGCCGGGTCGAATAAAAGAGAGGTTGTGGG951GCGGGTGAGGTGTCGAAGTGGGTCGTGGGGACCCGGTTGGGTCCATTCGT1001TTGCGGTGACGGAGAATTATGTTGTAATACCGGAAATGCCCCTGAGATAT1051TCGGTGAAGAATCTTCTTAGAGCTGAGCCGACGCCACTTTACAAGTTCGA1101GTGGTGTCCCCAAGACGGAGCTTTTMTCATGTCATGTCCAAACTCACCG1151GAGAAGTCGTGGCTAGCGTGGAGGTTCCAGCATACGTAACGTTTCACTTC1201ATAAACGCGTATGAAGAAGATAAAAATGGCGATGGAAAAGCGACGGTCAT1251CATTGCAGATTGTTGTGAACACAACGCCGATACTCGGATACTCGATATGC1301TCCGTCTCGATACCCTACGTTCTTCCCATGGTCACGACGTTTTACCCGAT1351GCTAGGATCGGGAGATTCAGGATACCATTGGACGGGAGCAAATACGGGAA1401ACTAGAGACAGCCGTGGAGGCAGAGAAGCATGGGAGAGCGATGGATATGT1451GCAGCATCAATCCTTTGTATTTGGGTCAAAAATACCGTTACGTTTATGCA1501TGCGGTGCTCAACGACCTTGTAACTTCCCCAATGCTCTCTCCAAGGTTGA1551TATTGTGGAGAAGAAAGTGAAGAACTGGCACGAGCATGGTATGATACCAT1601CTGAACCATTCTTCGTGCCTCGACCCGGTGCAACCCATGAGGATGATGGA1651GTGGTGATATCGATAGTAAGTGAAGAAAATGGAGGAAGCTTTGCAATCTT1701GCTTGATGGGAGCTCCTTTGAAGAAATAGCAAGAGCCAAGTTTCCCTATG1751GCCTTCCTTATGGCTTGCATGGTTGCTGGATCCCCAAAGATTAACTACAA1801AGTCTCAACAAAGATACCTTCATTATACAAAACACAACATATGTATAATT1851AATACCCTCTGTGCAGGTTTTGTAAATTGTTGTCCCTTATM7VTGCTTTT1901TGTCTATATATGTGATGTACAAAACCAAAATAAAAGGAACGGATTGTGGT1951GGATACAGTT8序列表2 SEQIDNo:2MetAlaSerLeulieThrThrLysValLeuSerSerThrArglieThrlieGlyAspGinGin工leLysThrLeuPheAlaArgArgliePheGlySerAlaAlaProSerProLeuProGluArgArgCysHisValAlaTrpTrpGluGlyGluLeuThrValGinAsnGlyThrTyrLeuArgAsnGlyAspHisAspPheArgHisLeuPheLysLeuGinPheAspGlyGlyArgLeuGluSerAspAlaTyrLysAlaCysTyrArgGluPheSerGluThrLysAsnProPheSerGlylieGlyGlyGluSerLeuThrAspAsnAlaGlyAspGlyArgValMetCysLeulieLeuValAspHisGluThrLeuTyrAspAspValLeuSerAspHislieValThrGluThrGluMetTrpLysProGlyTyrArgValValArgArgGluValValGlyArgValArgProGlyTrpValHisSerPheAlalieProGluMetProLeuArgTyrAlaGluProThrProLeuTyrLysGlyAlaPhelieHisValMetSerAlaSerValGluValProAlaTyrAlaTyrGluGluAspLysAsnGlylieAlaAspCysCysGluHisAsnMetLeuArgLeuAspThrLeuArgLeuProAspAlaArglieGlyArgSerLysTyrGlyLysLeuGluThrGlyArgAlaMetAspMetCysSerGinLysTyrArgTyrValTyrAlaAsnPheProAsnAlaLeuSerLysValLysAsnTrpHisGluHisGlyPheValProArgProGlyAlaThrlieSerlieValSerGluGluAsnLeuAspGlySerSerPheGluGluTyrGlyLeuProTyrGlyLeuHisAlaMetMetSerHisHisHis15ThrLeuTyrSerAspAsnSer30LysProGinValProHis Arg45ValThrArgAlaVallieAsn60GluLysGluLysValGlu Gly75ThrSerValGinGinGluAsn90GlyLyslieProThrTrpLeu105ProGlyLeuTrpAsnlieGly120AspGlyTyrSerThrLeuVal135liePheAlaAlaHisArgLeu150AlaLysLysHisAsnArgLeu165ProLysSerVallielieAsn180GlulieValArgLeuPheSer195AsnThrGlyVallieJLysLeu210ThrGluThrGinEysGlySer225GluThrlieGlyLysPheGlu240MetlieGinSerAlaHisPro255ThrLeulieProAspLeuVal270MetGluAlaGlySerAsnLys285CysArgSerGlySerTrpGly300ValThrGluAsnTyrValVal315SerValLysAsnLeuLeuArg330PheGluTrpCysProGinAsp345LysLeuThrGlyGluValVal360ValThrPheHisPhelieAsn375AspGlyLysAlaThrVallie390AlaAspThrArglieLeuAsp405SerSerHisGlyHisAspVal420PheArglieProLeuAspGly435AlaValGluAlaGluEysHis450lieAsnProLeuTyrLeuGly465CysGlyAlaGinArgProCys480ValAsplieValGluLysLys495MetlieProSerGluProPhe510HisGluAspAspGlyValVal525GlyGlySerPheAlalieLeu540lieAlaArgAlaLysPhePro555GlyCysTrplieProLysAsp570
权利要求
1、一种植物耐低磷蛋白，其特征在于氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No2所示。
2、 根据权利要求l所述的蛋白，其特征在于SEQIDNo: 2的氨基酸残基序列包括不 超过10个氨基酸残基的取代和/或缺少和/或添加。
3、 由权利要求l所述的植物耐低磷蛋白的编码基因，其特征在于选自下列核苷酸下列 之一(1) 序列表中SEQIDNo: 1的DNA序列；(2) 编码序列表中SEQIDNo: 2蛋白质序列的多核苷酸。
4、 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于在高严谨条件下与SEQIDNo: l限定 的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5、 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于与SEQIDNo: 1限定的DNA序列具 有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
6、 由权利要求3所述的编码基因增强植物对低磷耐受性的方法，其特征在于是抑制植 物中耐低磷相关蛋白编码基因的表达。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于抑制植物中耐低磷相关蛋白编码基因表 达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，或者反义核酸技术沉默基因的方法，或者 siRNA介导的基因沉默方法。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐低磷蛋白及其编码基因与应用。植物耐低磷蛋白是序列表中SEQ ID No2，其编码基因是序列表中SEQ ID No1 DNA序列。本发明利用耐低磷蛋白的编码基因增强植物耐低磷能力，如抑制植物中上述植物耐低磷相关蛋白的编码基因的表达，为农作物耐低磷育种提供基因与技术支持。
文档编号C12N15/82GK101602800SQ20091014414
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月16日 优先权日2009年7月16日 公开号200910144143.9
发明者任永兵, 孙佳佳, 曹树青, 力 江, 洋 汪, 简红勇, 袁怀波, 边小会, 陈正义 申请人:合肥工业大学