一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌。所述内生真菌为丝葚霉（Papulospora?sp.）AJ14，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC?No.9187。通过应用该菌株的菌液，进行杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地浇根。本发明涉及的菌株通过接种后植株的磷胁迫试验，得出菌株的苗高地径、生物量以及叶绿素含量均较大程度高于对照，表明其对于缓解植株磷胁迫具有较大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进杉木在磷胁迫条件下的生长发育。
【专利说明】一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌。
【背景技术】
[0002]植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌[1]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。
[0003]前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌[2]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为:固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌[3_4]、具有抗病虫害的生防菌[5_7]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。
[0004]谢卿媚和黄建河(1985) [8]对杉木内生菌根的形态特征及菌根真菌的鉴定，主要以杉根皮层组织与内生菌根真菌的共生结构作解剖学分析及以湿筛一倾析法从根际土中获得的菌丝与厚垣孢子进行观察。结果表明，根据杉木内生菌根的解剖学分析与根际土壤中厚垣孢子的形态结构特征，确定杉木内生菌根是属于泡囊一丛枝型内生菌根(简称VA菌根)。进一步研究杉木内生菌根对杉木的生长发育及抗性方面的效应，充分合理的利用内生菌根制剂促进杉木生长的问题，具有重大的经济价值。特别是在我国南方养分瘠薄的红壤地区，研究内生菌根增强土 壤中磷素的吸收，是当前南方红壤地区杉木速生丰产中亟待解决的重要问题。综上可知，关于杉木的内生真菌方面的研究仅从根部位进行鉴定研究，而对杉木叶部位和茎部位均未涉及内生真菌的研究。此外，有关内生真菌对杉木自身生长的影响研究还存在空白。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌。
[0006]本发明提供的一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌，为丝葚霉iPapulospora sp.)AJ14，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.9187。
[0007]该菌的分离、纯化包括:
A、材料:将采集得到不同年份的杉木根、茎段、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——无菌水浸洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法[9_11]；
C、接种部位的选择:叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝条:上中下分为3部位，其中第3部位为枝莖交接处；根部:分为根尖和根基2个部分；D、接种:将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28°C恒温培养箱内培养5— 7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。
[0008]固体培养:使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值
6.4±0.2，培养温度为28°C，培养方式为平板培养，培养时间为48h ；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的杉木内生真菌；
其无性孢子缺乏，菌丝淡色，产生小的细胞紧结成类菌核结构的球状，黑色；参照真菌鉴定手册将其鉴定为丝葚霉属iPapulospora sp.)。
[0009]上述的一种能缓解磷胁迫的的杉木内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48~72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106cfu/ml即为成品备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
[0010]上述的一种能缓解磷胁迫的的杉木内生真菌的应用方法，是应用该菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地浇根。
[0011]上述的一种能缓解磷胁迫的的杉木内生真菌的应用方法，是用9.0X 105cfu/ml菌液，按每株100mL在林地浇 于每株杉木的根际。
[0012]上述的一种能缓解磷胁迫的的杉木内生真菌的应用方法，是应用该菌株的菌液
5.0X105cfu/ml在杉木水培苗栽植前将苗蘸根IOmin。
[0013]本发明涉及的菌株是从杉木植株中分离纯化得到的，经接种于杉木组培苗，根据光合作用的各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解磷胁迫的的作用，寻找到对促进植株生长的有益的功能内生真菌可应用于生产。通过接种后植株的磷胁迫试验，得出菌株的苗高地径、生物量以及叶绿素含量均较大程度高于对照，表明其对于缓解植株磷胁迫具有较大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进杉木在磷胁迫条件下的生长发育。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为不同磷胁迫下AJ14菌株对杉木幼苗苗高的影响。
[0015]图2为不同磷胁迫下AJ14菌株对杉木幼苗地径的影响。
[0016]图3为不同磷胁迫下AJ14对杉木幼苗生物量的影响。
[0017]图4为不同磷胁迫下AJ14对杉木幼苗叶绿素含量的影响。
【具体实施方式】
[0018]一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌，菌种命名为AJ14，分类命名:丝葚霉(.Papulospora sp.)，其保藏编号:CGMCC N0.9187，保藏日期:2014年5月20日，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。[0019]I水培繁殖中的应用
取配制好的上述内生真菌的应用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在杉木水培苗栽植前蘸根lOmin。可提高植苗成活率10%以上。
[0020]2根际土壤浇施应用
本试验采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省林科院提供的杉木组培苗。选择长势一致的苗木于2013年5月定植于直径15cm，高IOcm的塑料盆中。所用土壤是严格经过熏蒸消毒的黄心土。经过称量，每盆放入等量的3kg 土壤。经过两个月的恢复性生长，连续三天(7月5日、7月6日和7月7日)分别于杉木根际(R)和树冠(G)施入相同浓度的IOOmL菌液。利用上述试验获得的共5个优势菌种，每种菌液4个重复，用蒸馏水作为空白对照。接种60天后进行各项指标的测定。
[0021]菌液制备:将供试菌株接入50mL的液体培养基，在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5X106cfu/mL。
[0022]2.1苗高地径测定
钢尺测定苗高，数显游标卡尺测定地径。
[0023]2.4生物量测定
将植株的不同部位分别标号放入已知重量(Wl)的铝盒中，放入烘箱105°C烘干半小时(钝化酶)，在70°C下烘干，经过IOh后，取出铝盒放入干燥箱中冷却至室温，称重后再放入烘箱中，重复测定直至恒重为止。称得铝盒和样品的总重量(W2)，则样品干重为W2-W1。
[0024]本试验中根冠比指标采用植株干物质的质量比。地面以下，主要是根系，为地下部分；地面以上，主要是茎和叶，为地上部分。
[0025]2.2叶绿素含量测定
叶绿素含量测定参考张宪政(1986) [12]的方法，采用丙酮乙醇提取法。取相近位置叶片，洗净并吸干水分后，准确称取0.1g鲜叶放入小试管中，加混合液(丙酮:乙醇=l:l)10mL盖塞。在室温下暗处提取12h后去清液分别在663nm和645nm下测定光吸收值。
[0026]结果计算:
【权利要求】
1.一株能缓解磷胁迫的杉木内生真菌，其特征在于:所述内生真菌为丝葚霉(Papulospora sp.)AJ14,已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCN0.9187。
2.一种如权利要求1所述的杉木内生真菌的应用菌液，其特征在于:所述应用菌液的制备方法，是将所述的丝葚霉sp.) AJ14接入液体培养基,摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48~72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106cfu/ml，备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
3.—种如权利要求1所述的杉木内生真菌的用途，其 特征在于:应用该菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地浇根。
【文档编号】C12N1/14GK104004665SQ201410246079
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】吴承祯, 谢安强, 徐彩瑶, 洪伟, 林勇明 申请人:福建农林大学