专利名称：大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法
技术领域：
本发明提供了大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法，属于分子遗传学领域，可 用于大豆耐低磷分子标记辅助选择育种和种质的分型鉴定。
背景技术：
大豆是我国重要的粮食作物和油料作物。然而，三分之二的耕地缺磷是限制我国 大豆生产的主要因素。因此，发掘大豆自身潜力，高效利用土壤潜在磷素资源是解决大豆缺 磷的有效途径。尽管大豆磷效率的研究也已取得了一些进展，但在磷高效基因型的筛选上存在很 大的困难，主要是因为筛选指标和筛选时期的难以确定。为了加快大豆耐低磷胁迫育种进 程，十分关键的问题是大豆种质耐低磷特性的准确鉴定，育种学家通常通过田间筛选的方 法来鉴定大豆种质的耐低磷特性，然而，这些方法在对大的群体进行选择时，尤其对于磷效 率这样数量性状具有一定的局限性。例如，数量性状受环境的影响很大，一两次的鉴定结果 难以准确可靠，多年多点鉴定又费时费力。因此，如何准确、快速、简单地对耐低磷性进行鉴 定一直是大豆耐低磷育种的难题之一。近年来，随着分子标记技术的发展，许多的研究者利用与磷效率QTL连锁的标记 对耐低磷种质进行辅助选择，这种方法在一定的程度上提高了选择的速度，且操作简单，但 是这些标记都是大豆磷效率基因的连锁标记，因此准确性一般较低。基于大豆耐低磷基因本身开发的功能分子标记可以克服以上缺点，Zhang等利用 连锁分析和关联分析相结合的方法对控制磷效率基因进行精细定位，发现并图位克隆了存 在于第八染色体上的一个控制磷效率的主效基因(GmAPt)，将该基因在184分大豆材料中 进行测序分析，发现在GmAPt基因第一内含子存在等位基因，即与不耐低磷的材料相比，耐 低磷材料在第一内含子存在着IObp的缺失。
发明内容
技术问题本发明针对上述的情况，利用大豆GmAPt基因不同材料间在第一内含 子上存在着IObp的差异，获得了 GmAPt基因的一个基因标记Indel_S170，利用这个标记进 行大豆耐低磷种质的分型鉴定可以保证92. 9%以上的准确率。技术方案鉴定大豆耐低磷基因GmAPt的基因标记引物为，InDel_S170 正向引物序列CTTGAGATCACTACAACACACCInDel_S170 反向引物序列GATAGAAGAAC AACACAAAAAC上述引物用于鉴定大豆耐低磷基因GmAPt的基因标记方法为1、大豆材料基因组DNA的提取；2、对大豆基因组DNA进行PCR扩增；PCR 扩增反应体系为EXTaqXMaster PCR Mix 5 μ L, Primer (3pmol/L) 2. 0 μ L,模板DNA (约15ng/y L)2y L，灭菌双蒸水IyL ；反应总量10 μ L. PCR反应在MJResearch PTC-200热循环仪上进行，反应程序包括94°C预变性5min，每个循环95°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸7min，12°C保存。3、反应产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。电泳结果如果有 302bp的单条谱带，则为耐低磷材料；如果有312bp单条谱带，则为不耐低磷大豆材料。有益效果本发明利用分子遗传学及分子生物学的方法获得一个大豆耐低磷基因 GmAPt的功能分子标记Indel_S170，该标记的优点具体归纳如下(1)分型和鉴定新的大豆耐低磷材料，不仅可以进一步研究耐低磷的分子和遗传 机制，同时也可以拓宽耐低磷育种的遗传背景，选育出高产、稳产、耐逆性强的优质大豆品 种。而传统的鉴定方法不仅工作量大而且花费的周期长，利用本发明的标记可以简单快速 的鉴定大豆材料的耐低磷特性。(2)本发明所获得的基因标记是依据GmAPt基因内部产生的碱基缺失，因此不存 在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。(3)育种中一些耐低磷相关性状的调查必须将植株收获或对植株造成伤害才能进 行(例如，测定生物量、磷含量、酶活性等)，而利用本发明的标记可在任何时期通过SSR标 记判断其耐低磷性，为有效选育耐低磷大豆品种提供了技术。
四
图1大豆耐低磷基因GmAPt在不同磷效率特性材料中第一内含子的序列比对图 2Indel_S170对供试14份材料的电泳检测图
五具体实施例方式(1)供试材料试验材料包括14份材料(表1，均由国家大豆改良中心对外提供)来自不同文献 报道过的大豆耐低磷特性种质(刘莹等，2007 ；崔世友等，2007 ；丁玉川等，2006)，包括6份 耐低磷种质，7份不耐低磷种质和1份中等耐性种质。表1 14份不同耐低磷相关材料
编号材料耐磷特性编号材料耐磷特性11138-2耐8波高不耐2句容大扁豆不耐9汶上滚龙珠中等3夏邑太平紫花耐1094-156耐4涡阳黑豆不耐11科丰耐5宁海晚黄豆不耐12晋_& 4号不耐6新昌六月豆耐13满仓金不耐7苏协1号不耐14惠民铁竹竿耐(2) Indel S170 标记的获得根据GmAPt基因序列内部一个的IObp缺失位点，设计了一对Indel标记引物，上 游引物为 5，-CTTGAGATCACTACAACACACC-3，，下游引物为 5，-GATAGAAGAAC AACACAAAAAC-3，
(3) DNA 的提取以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，详细步骤如下1)取大豆嫩叶3-5克左右，在液氮中研成粉末，倒入保温的CTAB提取缓冲液中，65°C水浴30_60min，其间轻摇3_5次；2)加等体积的氯仿异戊醇(24 1)溶液，并充分摇勻，放在摇床上轻摇Ih ；3)经5000rpm离心15min，将上清夜转入一个新的离心管中；4)加入IOml冰冻的异丙醇，上下摇勻；5)离心倒掉液体，加入1. 5-3mlHS-TE缓冲液，待完全溶解后，等体积氯仿异戊醇 再抽提一次；6)经8000rpm离心5min，吸取上清液转到另一个新的离心管中；7)用三倍体积的冰冻无水乙醇，在_20°C下静置20min以沉淀DNA ；8) IOOOOrpm 离心 5min，弃去上清夜；9) 70%乙醇清洗两次，真空干燥机上吹干；10)将DNA溶于TE中，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。置于_20°C待用。(4) PCR反应及电泳检测PCR 扩增反应体系为EXTaqXMaster PCR Mix 5 μ L, Primer (3pmol/L) 2. 0 μ L, 模板DNA (约15ng/yL)2yL，灭菌双蒸水IyL ；反应总量IOyL. PCR反应在MJResearch PTC-200热循环仪上进行，反应程序包括94°C预变性5min，每个循环95°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸7min，12°C保存。反应产物在8%非变性 聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。(5)电泳结果分析利用Indel_S170对14份供试材料进行基因型检测。第一内含子缺失的耐低磷材 料能扩增出302bp的DNA条带，而第一内含子不缺失的不耐低磷材料能扩增出312bp的DNA 条带，在供试材料中中等耐性的一个材料扩出312bp的DNA条带(图2)。图2中泳道编号 与表2材料编号对应。从结果可以得出，Indel_S170标记可用于分型和鉴定新的大豆耐低磷材料，并 且用于对前人通过常规方法筛选的不同磷效率特性的大豆种质进行验证，正确率达到了 92.9%。这较之常规的筛选方法省时，省力，节省成本，并具有很高的可靠性。这为以后大 豆磷高效基因型种质鉴定和大豆磷高效育种分子标记辅助选择提供了新的材料和技术。
权利要求
大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记引物，其序列为，Indel SSR正向引物序列CTTGAGATCACTACAACACACCIndel SSR正向引物序列GATAGAAGAACAACACAAAAAC；
2.权利要求1所述引物用于鉴定大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法，包括(1)大豆材料基因组DNA的提取；(2)对大豆基因组DNA进行PCR扩增；PCR 扩增反应体系为EXTaqXMaster PCR Mix 5μ L,3pmol/L Primer2. 0 μ L, 15ng/ μ L模板DNA2 μ L，灭菌双蒸水1 μ L ；反应总量10 μ L. PCR反应在MJ ResearchPTC-200热循 环仪上进行，反应程序包括94°C预变性5min，每个循环95°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸7min，12°C保存；(3)反应产物在质量比8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色，电泳结果如 果有302bp的单条谱带，则为含大豆耐低磷基因GmAPt的耐低磷材料；如果有312bp单条谱 带，则为不含大豆耐低磷基因GmAPt的大豆材料。
全文摘要
本发明涉及大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法，属于分子遗传学领域。利用大豆耐低磷基因GmAPt在大豆耐低磷材料中与不耐低磷材料中在第一内含子存在10bp的缺失，设计合成了标记Indel_S170，由于这个标记为基因本身的标记，因此和耐低磷基因GmAPt及其等位基因表现为共分离。利用该标记能够准确快速的鉴定大豆种质资源的耐低磷性，大大提高大豆耐低磷材料的选择效率和分型鉴定效率，加速大豆耐低磷分子标记辅助选择育种进程。
文档编号C12N15/11GK101921758SQ20101025852
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者喻德跃, 张丹, 程浩 申请人:南京农业大学