专利名称：水稻OsSPX1蛋白及其编码基因在调控植物抗氧化性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻OsSPXl蛋白及其编码基因在调控植物抗氧化性中的应用。
背景技术：
非生物胁迫是影响水稻产量的ー个重要因素，包括干旱、盐碱、极端温度、养分缺乏、紫外射线和大气污染。这些胁迫的伤害作用都和对生物大分子如脂类、酶、核酸的氧化损伤有关，因此在水稻中挖掘具有抗氧化作用的优异基因，并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻抗逆育种的一条行之有效的途径。本发明人研究小组在研究耐低温和响应低磷胁迫相关的水稻SPX基因功能时发现该基因同时具有提高水稻抗氧化性的效能，在农业生产上具有较强应用价值的基因。已有ー些研究表明含有SPX (SYGl/Pho81/XPRl)结构域的基因參与磷的信号转导和调节途径。SPX是约180个氨基酸长，存在于3种已知蛋白(SYGl、Pho81和XPRDN末端的一个结构域，其名称来源于这三种蛋白的首字母。早在1995年，Spain等人研究发现酵母SYGl的N末端可与G-蛋白结合从而抑制交配信息素(mating pheromone)的信号转导；在磷饥饿条件下，有报导CDK抑制子Pho81可抑制PH080-PH085及Pcl7_Pho85复合体的酶活性；Poleg等人(1996),在真菌Neurospora crassa中发现，与PH081结构相似的NUC-2蛋白可感知磷的存在并參与磷转运的调节途径。2002年，Hamburger等人在拟南芥中亦发现ー类SPX基因，即PHOl (具有SPX结构域和EXS结构域)基因和PHOl类似蛋白，它们可參与磷由根到茎的运输，并在根的微管束细胞中特异表达。本发明人研究小组经研究发现水稻的SPX基因OsSPXl还可提高植物的耐冻性。
发明内容
本发明的ー个目的是提供水稻OsSPXl蛋白的新用途，该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列3所示，所述新用途为序列表序列3所示蛋白可用于调控目的植物的抗氧化性，或调节序列表序列3所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物的抗氧化性。本发明的另ー个目的是提供一种培育低抗氧化性转基因植物的方法，该方法是降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达，得到抗氧化性低于所述目的植物的转基因植物。在上述方法中，所述降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达是通过将序列表序列3所示蛋白编码基因的反向互补序列导入目的植物中实现的。
本发明还提供另ー种培育高抗氧化性转基因植物的方法，该方法是将序列表序列3所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗氧化性高于所述目的植物的转基因植物。在上述两种方法中，所述序列表序列3所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)的基因
I)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列3所示蛋白的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列3所示蛋白的DNA分子；所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. 1%SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, O. 1%SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，O. 5XSSC,O. 1%SDS 中漂洗； 还可为50°C，在 7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，O. I X SSC,O. 1%SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，O. 1XSSC,0. 1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, O. 1%SDS 和 1XSSC,0. 1%SDS 各洗膜一次。在上述应用和方法中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。在上述应用和方法中，所述单子叶植物具体可为水稻。在上述应用和方法中，所述抗氧化性表现为所述目的植物经氧化剂(如甲基紫精，MV)处理后其叶绿素和/或过氧化物含量；即所述抗氧化性高于所述目的植物的转基因植物表现为经氧化剂处理后，所述转基因植物的叶绿素含量高于所述目的植物，和/或所述转基因植物的过氧化物含量低于所述目的植物；所述抗氧化性低于所述目的植物的转基因植物表现为经氧化剂处理后，所述转基因植物的叶绿素含量低于所述目的植物，和/或所述转基因植物的过氧化物含量高于所述目的植物。实验证明，经10 μ M甲基紫精溶液处理后，转pCOU OsSPXl_antisense的水稻株系植株叶片变黄较明显、叶绿素相对含量最低(为O. 86-7. 89SPAD)且过氧化物的积累最多，其次是非转基因日本睛(叶绿素相对含量为11.04SPAD)，_pC0U OsSPXl的水稻株系植株叶片颜色较绿、叶绿素相对含量最高(为14. 69— 22. 09SPAD)且过氧化物的积累最少。本发明在研究植物抗氧化性进而提高植株抗逆性方面具有重要应用价值。
图I为水稻OsSPXl基因的正反义重组表达载体T-DNA区的结构示意图。其中，图A为正义重组表达载体，图B为反义重组表达载体，图A和B中的LB和RB分别代表T-DNA的左臂和右臂，Nos代表胭脂碱合酶终止子，Hpt II代表潮霉素磷酸转移酶基因，CaMV35s代表花椰菜花叶病毒35s启动子，Ubi代表玉米泛素启动子，OsSPXl代表序列表序列2所示的水稻OsSPXl编码基因。图2为转基因水稻株系的PCR鉴定电泳图。其中，图A为转pCOU 0sSPXl_antisense的Ttl代转基因水稻株系的鉴定结果，泳道M为分子量标准，从上到下的片段依次为5kb，3kb, 2kb, lkb, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp，泳道8为非转基因日本睛，泳道1-7为待鉴定的Ttl代转pCOU 0sSPXl_antisense水稻株系；图B为转pCOU OsSPXl的Ttl代转基因水稻株系的鉴定结果，泳道M为分子量标准，从上到下的片段依次为5kb，3kb，2kb, lkb, 750bp，500bp, 250bp, lOObp,泳道9为非转基因日本睛，泳道1_8为待鉴定的Ttl代转pCOU OsSPXl水稻株系。图3为实时定量RT-PCR检测转pCOU OsSPXl水稻株系中OsSPXl基因的相对表达水平。其中，CKl代表对照组，低温代表实验组。图4为实时定量RT-PCR检测转pCOU 0sSPXl_antisense水稻株系中OsSPXl基因的相对表达水平。其中，CKl代表对照组,低温代表实验组。图5为转基因水稻株系植株幼苗经甲基紫精(MV)溶液处理后的表型。其中，上一 排为实验组，下一排为对照组。图6为转基因水稻株系植株幼苗经甲基紫精溶液处理后叶片的叶绿素含量測定結果。其中，CK2代表对照组，MV代表实验组。图7为转基因水稻株系植株幼苗经甲基紫精溶液处理后叶片进行DAB (3，3’ - ニ氨基联苯胺)染色后的表型。其中，图A为整株的表型，图B为对叶尖进行显微拍照图(标尺长度为Icm ；Anti-2的结果与Anti-I相同，Οχ-4和0χ_5的结果与Οχ-l相同)；CK2代表对照组，MV代表实验组。在上述图中，WT代表非转基因日本睛，Anti-I和Anti_2分别代表转pC0U0sSPXl_antisense的水稻株系，0χ-1、0χ-2、0χ-3、0χ_4和0χ_5分别代表转pCOU OsSPXl的水稻株
系O
具体实施例方式下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。日本睛(Oryza sativa L. cv. Nipponbare):中国农业大学保证向公众提供；參考又献bene expression profiles deciphering rice phenotypic variation betweenNipponbare(Japonica) and 93-11 (Indica) during oxidative stress. PLoS One. 2010 Jan8,5(1)。根癌农杆菌EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHAlO5):中国农业大学保证向公众提供；參考文献Toki S，Hara N, Ono K, Onodera H, Tagiri A, Oka S，TanakaH. 2006. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speedtransformation of rice. Plant. J. 47(6):969-76。实施实例I、水稻OsSPXl基因及其蛋白的获得以4°C低温处理12h的水稻日本睛(Oryza sativa L. cv. Nipponbare)芽期(发芽7-10天的幼苗)植株为材料，利用TRIZOL试剂提取总RNA，并以总RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，再以此cDNA为模板，在引物⑶S-PF和引物⑶S-PR的引导下，用常规PCR法扩增水稻SPX基因的cDNA序列，反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约900bp的DNA片段，对该片段进行测序。引物CDS-PF :5’ -ATAGATCTATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3> (带下划线部分序列为限制性内切酶Bgl II识别位点及保护碱基)；引物CDS-PR :5’ -GCGGTACCTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3’ (带下划线部分序列为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基)。测序结果表明，上述约900bp的DNA片段含有序列表序列2所示的888bp核苷酸序列，该888bp核昔酸序列为OsSPXl基因的编码序列，编码具有序列表序列3所不的由295个氨基酸组成的蛋白，将该蛋白命名为OsSPXl，该蛋白自氨基端(N端)第1-169位氨基酸残基为SPX蛋白结构域。OsSPXl的基因组DNA定位于水稻第六号染色体的23，875，408bp至23，879，965bp (其序列如序列表序列I所示)，其NCBI定位号为NP_001058013，NCBI基因号(GENEID)为0s06g0603600，TIGR 号为 L0C_0s06g40120。实施例2、水稻OsSPXl基因正反义重组表达载体的构建将步骤I中PCR扩增得到的约900bp的含有序列表序列2所示核苷酸序列的DNA片段用Bgl II和KpnI进行双酶切，回收纯化后插入到植物表达载体PCambial301-UbiN(GenBank号AF234297)多克隆位点的Bgl II和KpnI酶切位点之间，得到OsSPXl基因的正 义重组表达载体，将该正义重组表达载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有序列表序列2所示核苷酸序列的正义重组表达载体命名为pCOU OsSPXl，其T-DNA区的结构示意图如图I中的A所示。同时，构建OsSPXl的反义重组表达载体，具体方法如下设计引物5’ -GCGGTACCATGAAGTTTGGGAAGAGCCTG-3’ (带下划线部分序列为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基)和5’ -ATAGATCTTCATTTGGCGGCCTGCTCAAT-3’ (带下划线部分序列为限制性内切酶Bgl II识别位点及保护碱基)，按照实施例I相同的方法进行PCR扩增，回收纯化约900bp的PCR产物，用Bgl II和KpnI进行双酶切，回收纯化后插入植物表达载体pCambial301-UbiN多克隆位点的Bgl II和KpnI酶切位点之间，得到OsSPXl基因的反义重组表达载体，将该反义重组表达载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有与序列表序列2所示核苷酸序列互补的序列的反义重组表达载体命名为pCOU OsSPXl_antisense，其T-DNA区的结构示意图如图I中的B所示。实施例3、转基因水稻的获得将实施例2构建的水稻OsSPXl的正义重组表达载体pCOU OsSPXl、反义重组表达载体pCOU OsSPXl_antisense用农杆菌转化法转化水稻日本睛(Oryza sativa L. cv.Nipponbare)的成熟胚诱导的愈伤组织,具体方法如下I、将pCOU OsSPXl和pCOU 0sSPXl_antisense分别用电击法转化根癌农杆菌EHA105 得到含有 pCOU OsSPXl 的重组农杆菌 EHA105/pC0U OsSPXl 和含有 pCOU 0sSPXl_antisense的重组农杆菌EHA105/pC0U 0sSPXl_antisense共两种重组农杆菌。将上述两种重组农杆菌分别接种于YEB液体培养液(含100μ g/ml卡那霉素和75 μ g/ml利福平)中，28°C振荡培养至OD600为0. 6-0. 8 ;以10，OOOrpm室温离心Imin,用MS盐溶液(pH 5. 8)重悬菌体并稀释至原培养液菌浓度的20-50倍，得到两种重组农杆菌的菌悬液。上述MS 盐溶液的配方=NH4NO3 I. 65g、KN03 I. 9g,KH2PO4 0. 17g、MgS04 ·7Η20 O. 7g、CaCl2 · 2Η20 0· 44g、MnSO4 · 4Η20 22. 3mg、ZnSO4 · 7Η20 8. 6mg、H3BO3 6. 2mg、KI 0. 83mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg、CoCl2 · 6H20 0. 025mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、肌醇 100mg、烟酸(B5)O. 5mg、盐酸吡哆醇(维生素 B6) 0. lmg、盐酸硫胺素(维生素1^)0. 5mg、甘氨酸2. Omg,用水定容至1し
2、将灭菌后的水稻日本睛(WT, Oryza sativa L. cv. Nipponbare)种子接种于N6D培养基(PH5. 8)上，32°C培养1-5天，去除芽和残留胚乳后再继代培养10-20天，得到成熟胚愈伤组织。上述N6D 培养基的配方KN03 2. 83g/L、(NH4)2SO4 O. 463g/L,MgSO4 · 7H20 0. 185g/L、CaCl2 0. 166g/L、KH2PO4 0. 4g/L ；MnSO4 · 4H20 4. 4mg/L、ZnSO4 · 7H20 I. 5mg/L、KI 0. 8mg/L、H3B03 I. 6mg/L、FeS04 · 7H20 27. 8mg/L, Na2EDTA · 2H20 37. 3mg/L ；2, 4_D 2mg/L, CH: 0. 3g/L, L-脯氨酸2. 878g/L，蔗糖30g/L，固化剂4g/L。3、将步骤2得到的成熟胚愈伤组织平均分成2组，每组分别浸于步骤I得到的两种农杆菌菌悬液中，轻轻晃动约I. 5min，接种于含有10-20mg/Lこ酰丁香酮的N6D培养基(ρΗ=5· 2)上，该培养基上预先垫有一层浸有O. 5毫升AAM培养基(Hiei，Y.，S. Ohta, TKomari ana T. Kumashiro. 1994. Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T—DNA. Plant J. 6:271-282.)的无菌滤纸，25°C黑暗条件下共培养3天。4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于含有50mg/L潮霉素(hygromycin B)和250mg/L羧苄青霉素(carbenicillin)的RE分化培养基(pH 5. 8)中培养1-2周后，选取生长旺盛的抗性愈伤组织进行分化、壮苗，获得分别转pCOU OsSPXl和pC0U0sSPXl_antisense的Ttl代转基因水稻株系。上述RE 分化培养基的配方=NH4NO3 I. 65g/L、KNO3 I. 9g/L、KH2PO4 0. 17g/L、MgSO4 · 7H20 0. 7g/L、CaCl2 · 2H20 0. 44g/L、MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、H3BO3 6. 2mg/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸(B5)O. 5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素Β6)0· 5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1) 0. lmg/L，蔗糖30g/L，山梨醇30g/L，酸水解酪蛋白2g/L，a-萘こ酸0. 02mg/L,激动素2mg/L，呋喃甲基腺嘌呤2mg/L，植物凝胶4g/L。T0代表示转基因当代植株，T1代表示Ttl代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。5、转基因水稻株系的PCR鉴定将步骤4获得的两种水稻转基因株系内的所有植株叶片分别提取基因组 DNA，进行 PCR 扩增，引物为 HPT-F :5’ -TACTTCTACACAGCCATC-3 ’ 和 HPT-R :5’ -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’，靶序列为潮霉素磷酸转移酶基因的部分序列，预测目的产物片段长度947bp，含有目的产物的为阳性转基因植株，部分植株扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。共获得阳性转pCOU OsSPXl的Ttl代转基因水稻株系8个，阳性转pCOU0sSPXl_antisense的Ttl代转基因水稻株系9个。实施例4、转基因水稻的实时定量RT-PCR检测随机取非转基因日本睛(WT)、按实施例3中步骤5的PCR鉴定方法鉴定为纯合转 pCOU OsSPXl 的 T3 代水稻株系(Οχ-1、0χ_2、0χ_3、Οχ-4, 0χ-5)和纯合转 pC0U0sSPXl_antisense的T3代水稻株系(Anti_l、Anti_2、Anti_3)的种子,进行如下两种处理(姆个株系每种处理3次重复，每个重复20-30粒种子)
处理I (实验组，低温)28°C 12小时光照12小时黑暗发芽I周，取芽长5mm的幼苗置于4-5°C低温处理24h ；处理2 (对照组，CKl) :28V 12小时光照12小时黑暗发芽I周，取芽长5mm的幼苗继续在该条件下处理24h ；将经过上述两种处理的幼苗利用TRIZOL试剂提取总RNA，以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，利用表I所示的专用引物，进行实时定量RT-PCR检测。表I、水稻各转基因株系的实时定量RT-PCR扩增引物
权利要求
1.序列表序列3所示蛋白在调控目的植物抗氧化性中的应用。
2.一种培育低抗氧化性转基因植物的方法，是降低目的植物中序列表序列3所示蛋白编码基因的表达，得到抗氧化性低于所述目的植物的转基因植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中序列表序列3所示蛋白的编码基因的表达是通过将序列表序列3所示蛋白编码基因的反向互补序列导入目的植物中实现的。
4.一种培育高抗氧化性转基因植物的方法，是将序列表序列3所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗氧化性高于所述目的植物的转基因植物。
5.根据权利要求I所述的应用或权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述序列表序列3所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)的基因 1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子； 2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列3所示蛋白的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列3所示蛋白的DNA分子。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述单子叶植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种水稻OsSPX1蛋白及其编码基因在调控植物抗氧化性中的应用。该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列3所示，可用于调控目的植物的抗氧化性，或调节序列表序列3所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物的抗氧化性。实验证明，经氧化剂甲基紫精处理后，转pCOU OsSPX1_antisense的水稻株系植株叶片变黄较明显、叶绿素含量最低且过氧化物的积累最多，其次是非转基因日本晴，转pCOUOsSPX1的水稻株系植株叶片颜色较绿、叶绿素含量最高且过氧化物的积累最少。本发明在研究植物抗氧化性进而提高植株抗逆性方面具有重要应用价值。
文档编号C07K14/415GK102675440SQ20121016681
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者于静娟, 刘凤霞, 徐文英, 王玲, 苏震, 谭远军, 赵琳娜, 魏强 申请人:中国农业大学