专利名称：OsLIS-L1基因控制水稻株高和花粉育性的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及利用水稻T-DNA随机插入突变体库，通过突变体表型的筛选鉴定，采用正向遗传学的方法，分离克隆一种控制水稻株高和花粉育性的新基因OsLIS-Ll，并通过等位突变体分析，转基因互补实验及RNAi (RNA干渉)抑制实验证明了 OsLIS-Ll基因的功能。同时还涉及利用该基因在水稻制种上的应用。
背景技术：
水稻作为重要的粮食作物，世界上约一半的人口以其为主食。同时，由于水稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的共线 性，而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入功能基因组时代，而高通量、高效率的研究基因功能的方法是构建饱和的突变体库(SpringerP S. Gene traps tools for plant development and genomics. Plant Cell,2000,12 1007—1020 ；Ramachandran S, Sundaresan V. Transposons as tools for functionalgenomics. Plant Physiol Biochem, 2001, 39 :243-252)。通过先找目标基因的突变体再观察其突变表型来研究基因的功能或先筛选突变表型再找突变的基因并验证两者之间的必然关系来研究基因的功能，也即是所谓的反向遗传学及正向遗传学两种方法。目前构建饱和突变体库的方法有以下两种ー是利用射线辐射或化学诱变剂处理种子等物理或化学的方法；ニ是利用反转座转座子或转座子或T-DNA的遗传转化的方法。其中由于T-DNA的插入拷贝数低、插入位点的稳定遗传及插入位点的随机等特性，采用T-DNA的遗传转化创造突变体的方法是目前构建水稻饱和突变体库的常用方法(Wu等，Development ofennancer trap lines for iunctional analysis of the rice genome. Plant J，200j，35 :418-427 ；Jeon J S 等，T-DNA insertional mutagenesis for functional genomicsin rice. Plant J，2000，22 :561-570 ;Sallaud C 等，Highly efficient production andcharacterization of T-DNA plants for rice(Oryza sativa L.) functional genomics.Thero Appl Genet，2003，106 :1396-1408)。对已有的突变体库开展表型突变体的筛选，通过正向遗传学的方法来鉴定重要的发育调控研究基因是开展基因功能研究的有效方法之一。基于水稻全基因组测序已完成，筛选突变体库来阐释基因的功能已显端倪(Lee S Y等，Functional analysis of the flowering time gene 0sMADS50,the putative SUPPRESSOROF OVEREXPRESSION OF C01/AGAM0US-LIKE20(S0C1/AGL20)ortholog in rice. Plant J，2004,38 :745-764 ；Jung K H 等，Rice Undeveloped Tapetuml Is a Major Regulator ofEarly Tapetum Development. PlantCell，2005，17 :2705-2722 ;Kumar M 等，A candidategene 0sAPC6 of anaphase-promoting complex of rice identified through T-DNAinsertion.Funct Integr Genomics，2010，10 :349-358 ;Li X 等，FLEXIBLE CULMlencoding a cinnamyl—alcohol dehydrogenase controls culm mechanical strengthin rice. Plant Mol Biol, 2009,69 :685-697 ；Yuan W 等，Mutation of the rice genePAIR3results in lack of bivalent formation in meiosis. Plant J，2009，59 :303-315 ;Chang Y 等，Replication protein A(RPAla) is required for meiotic and somatic DNArepair but is dispensable for DNA replication and homologous recombination inrice.Plant Physiol，2009，151 :2162-2173)0株高是水稻的重要农艺性状之一，它可以提高植株的丰产潜力，抗倒伏和肥料的耐久性。20世紀60年代以矮化育种为标志的“绿色革命”和70年代的水稻杂种优势利用，使水稻产量有了前所未有的突破。自此以后，株高的遗传基础得到了广泛研究。造成植株矮化的因素有很多，其中赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)是决定株高的2个最重要因素。目前，已经在水稻中克隆了与赤霉素(GA)有关的植株矮化突变体，如sdl，dl，dl8 (SasakiA 等，Green revolution a mutant gibberelI in-synthesis gene in rice. Nature，2002，416 :701-702 ;Ueguchi_TanakaM，等，Rice dwarf mutant dl, which is， defective inthe alpha subunit of the heterotrimeric G protein， affects gibberellin signaltransduction. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97 :11638-11643 ；Itoh H，等，Modificationof rice plant height by suppressing the height-controlling gene， D18， in rice. Breed Sci，2002，52 :215-218)等。已经在水稻中克隆了与油菜素内酯(BR)有关的植株矮化突变体，如 brdl，brd2，d2 (Mori M，NomuraT 等，Isolation and characterization of arice dwarf mutant with a defect in brassinosteroid biosynthesis. Plant Physiol,2002，130 :1152-1161 ;Hong Z等，The rice brassinosteroid-deficient dwarf2 mutant，defective in the rice homolog of Arabidopsis DIMINUT0/DWARF1,is rescued by theendogenously accumulated alternative bioactive brassinosteroid,dolichosterone.Plant Cell，2005，17 :2243-2254 ;Hong Z 等，A rice brassinosteroid-deficientmutant，ebisu dwarf (d2)，is caused by a loss of function of a new member ofcytochrome P450. Plant Cell，2003，15 :2900-2910)等。这些基因的突变或失活会影响赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)的生物合成和信号传导，造成不同程度的植株矮化。最近的研究表明，細胞分裂和細胞膨胀过程中的缺失造成的細胞大小和細胞数目变异也是造成植株矮化的重要因素。比如DTH8/0sHAP腹合体主要就是通过调控茎节间的細胞延长来控制水稻株高的(Wei X 等，DTH8 suppresses flowering in rice，influencing plantheight and yield potential simultaneously. Plant Physiol，2010，153 :1747-1758)；在oshl5突变体中，莖节间的细胞数目减少导致植株变矮(Sato Y等，Loss-of-functionmutations in the rice homeobox gene 0SH15affect the architecture of internodesresulting in dwarf plants. EMBO J，1999，18 :992-1002);而在 osapc6 突变体中，莖节间的细胞大小和细胞数目都减少导致植株变矮(Kumar M等，A candidate gene 0sAPC6ofanaphase-promoting complex of rice identified through T-DNA insertion. FunctIntegr Genomics，2010，10 :349-358)。这些基因的突变或失活会影响水稻的株高，造成不同程度的植株矮化。植物花药的发育是ー个多层次多步骤的过程，它包括花粉囊壁的发育、花粉母细胞的发育、小孢子的产生、花粉粒的成熟等过程，其中任何ー个步骤发育不正常，都有可能影响整个植株的育性。花粉发育是ー个非常复杂的过程，它涉及到许多基因，了解这些基因在其发育过程中所起的生理生化方面的功能，将对花粉的发育有更为清晰的认识，这将有很大的理论和实际应用价值。目前，通过对雄性不育突变体的研究，已在拟南芥、玉米、水稻等植物中克隆了一些影响雄蕊发育的基因。如玉米中的MSCAl基因调控花粉囊壁細胞的分裂和转化；拟南芥的NOZZLE基因参与调控性器官早期发育过程中的孢子形成；拟南芥的TPDl基因在花粉囊绒毡层细胞的分化过程中起重要作用；拟南芥的EMSl基因控制花粉嚢中生殖細胞及其邻近体細胞的命运；水稻的Udtl基因是花粉囊绒毡层早期发育过程中的主要调节子(Chaubal R 等，The transformation of anthers in themscal mutant of maize. Planta,2003, 216 :778-788 ；Schiefthaler U 等，Molecularanalysis of NOZZLE，a gene involved in pattern formation and early sporogenesisduring sex organ development in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad.Sci.USA，1999,96 :11664-11669 ;Yang S L 等，TAPETUM DETERMINANT! is required forcell specialization in the Arabidopsis anther. Plant Cell，2003，15 :2792-2804 ;Zhao D Z 等，The excess microsporocytesl gene encodes a putative leucine-richrepeat receptor protein kinase that controls somatic and reproductive cellfates in the Arabidopsis anther.Genes Dev,2002,16 :2021-2031 ；Plant Cell，2003,15 :1281-1295 ；Plant Cell，2004，16 :1008-1020 Jung K H 等，Rice UndevelopedTapetuml Is a Major Regulator of Early Tapetum Development. Plant Cell，2005，17 2705-2722)。这些基因的突变或失活会影响花药的发育，造成植株雄性不育。我国既是水稻生产大国，又是水稻消费大国，提高水稻产量和品质是水稻生产遗传改良的主要性状。20世纪60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育是水稻增产的两次革命，但近几年来水稻的增产幅度不显著。纵观水稻矮化育种，矮杆基因利用単一化现象严重，这是影响新育成品种产量潜力进ー步提高的主要原因之一，因此发现和利用新的矮杆基因很重要。杂交育种是提高水稻产量的重要途径，杂交水稻技术的应用在提高水稻产量方面发挥了重要作用。雄性不育系为杂交育种提供了极大的便利和可能。利用雄性不育系进行杂交制种，既能节约劳力、财力，又保证杂交种的纯度，因此在雄性不育的基础上开展杂交优势的利用是水稻作物育种的主要方向之一。目前，获得雄性不育系材料主要有以下几种途径寻找和利用自然界产生的雄性不育变异株；通过种间或种内杂交和连续多代回交的方法创造不育系；用人工诱变的方法创造不育系；用基因工程的方法创造不育系。因此，矮杆基因和雄性不育在水稻育种过程中发挥着重要作用。本发明通过筛选T-DNA突变体库，分离并克隆了控制水稻株高和花粉育性的基因，丰富了可供利用的基因资源，通过基因工程的方法创造矮杆植株和雄性不育系，对生产矮杆水稻和雄性不育水稻及其在水稻育种上的应用都有非常重要的意义。WD40蛋白含有约40个氨基酸的保守序列。该序列以色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp，WD)结尾，因此称为TO40基序，而含有此种基序的蛋白称作MD40蛋白。TO40蛋白质中一般含有4-10个串联的WD40基序来形成功能结构(Neer等,The ancient regulatory-proteinfamily of WD-repeat proteins. Nature, 1994, 371 :297-300)。W)40 蛋白广泛存在于所有真核生物中，研究表明WD40蛋白具有广泛的生物化学和细胞生物学功能，如參与细胞分裂和胞质移动、细胞程序性死亡、光信号感受和传导、细胞运动、花发育、开花等过程(Smith等,The WD repeat a common architecture for diverse functions. Trends Biochem Sci, 1999,24 :181-185 ；van Nocker and Ludwig, The WD-repeat protein superfamilyin Arabidopsis -conservation and divergence in structure and function. BMCGenomics，2003，4 :50)。例如，拟南芥中的 CONSTITUTIVELY PH0T0M0RPH0GENIC I (COPl)基因，该蛋白的N末端有一个卷曲的螺旋(coiled-coil)结构域，接着有ー个锌指结构域，C末端有7个WD40重复单元，COPl是光形态建成和开花期的重要调控子(von Arnim等，benetic and developmental control of nuclear accumulation of COPI, a repressorof photomorphogenesis in Arabidopsis. Plant Physiol,1997,114 :779-788 ;Holm 等，Two interacting bZIP proteins are direct targets of COPl—mediated control oflight-dependent gene expression in Arabidopsis. Genes Dev,2002,16 :1247—1259 ;Liu 等，COPl-mediated ubiquitination of C0NSTANS is implicated in cryptochromeregulation of flowering in Arabidopsis. Plant Cell, 2008, 20 :292-306)。水稻中发现的Rice Immature Pollen I(RIPl)基因，编码含有5个保守WD40基序的蛋白。研究发现RIPl在花药发育的晩期大量表达，该基因丧失功能突变体表现雄性不育(Han等，RiceImmature Pollen I (RIPl) is a regulator of late pollen development. Plant Cel丄 Physiol,2006,47 :1457-1472)。本发明采用T-DNA标签的技术在水稻中分离获得OsLIS-Ll基因，该基因编码ー个类似于类型I的人类致无脑回畸形的基因编码蛋白(lissencephalytype-l-like homology motif protein),该蛋白在C末端含有9个WD40重复单兀,突变体表型分析、基因表达分析和基因功能验证实验表明OsLIS-Ll基因能调控水稻株高和花粉育性。
发明内容
本发明的目的采用T-DNA插入法分离克隆水稻功能基因技木，从水稻T-DNA随机插入突变体oslis-11中克隆的新的控制水稻株高和花粉育性基因OsLIS-Ll及其编码蛋白，通过遗传转化方法将所述的基因OsLIS-Ll转化到水稻植物体内，以调控水稻水稻株高和花粉育性。所述的OsLIS-Ll基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示，它编码的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 2所示。本发明克隆的水稻OsLIS-Ll基因的T-DNA插入失活突变体表现为半矮和育性低(见实施例I)，我们得到了 OsLIS-Ll基因的两个等位突变体体，分别表示为oslis-11-l和oslis-11-2，它们具有非常相似的突变表型，并且突变表型也与在OsLIS-Ll基因内的T-DNA插入共分离(见实施例2)。通过观察野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间和不同时期花药的半薄切片，得到了株高变矮和低育性的细胞学证据。野生型的OsLIS-Ll基因转化突变体oslis-11-2后植株恢复正常的表型(见实施例4)，此外，通过RNAi (RNA干涉)抑制该基因的表达得到和突变体相似的半矮和低育性表型(见实施例4)。OsLIS-Ll基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达，但在茎和穗中表达量相对要高些(见实施例5)。本发明克隆的OsLIS-Ll基因是控制水稻株高和花粉育性的新基因，有利于理解水稻茎和花粉的发育过程；通过基因工程的方法创造矮杆水稻和水稻雄性不育系，开拓了矮杆基因和雄性不育的资源。实现本发明的具体技术步骤如下I.利用已有的水稻T-DNA插入突变体库(该水稻T-DNA插入突变体库的构建方法參见 Wu 等，Development of enhancer trap lines for functional analysis ofthe rice genome. Plant J, 2003 :418-427 ;Zhan 等，Non-random distribution of T-DNAinsertions at various levels of the genome Hierarchy as revealed by analyzing13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer—trap mutant library. Plant J,2007 :947-959)，表型筛选得到一个半矮和低育性的突变体(该突变体命名为oslis-11-l，其在水稻T-DNA插入突变体库中的原始编号为03Z11AI23)，突变体的筛选鉴定方法见实施例I第I部分中详细描述。2.米用 Tail-PCR 方法(Zhang 等，Non-random distribution of T-DNAinsertions at various levels of the genome Hierarchy as revealed by analyzing13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer—trap mutant library. PlantJ，2007 :947-959)分离oslis-ll_l突变体的侧翼序列，通过序列分析显示T-DNA插入OsLIS-Ll 基因(L0C_0s08g06480, http://rice.plantbiology.msu.edu/)的第 21 个内含子中(实施例I第2部分)。
3.通过T-DNA插入与突变性状的共分离验证(按实施例I的第3部分T-DNA插入与突变表型的共分离检测执行)证明本发明获得的候选基因OsLIS-Ll的突变表型与T-DNA插入共分离。4.索取OsLIS-Ll基因的韩国等位突变体oslis-11-2，通过表型分析及共分离检测进ー步证明OsLIS-Ll家系的突变表型与T-DNA插入共分离。(见实施例2)。5.分析了野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间和不同时期花药的半薄切片，结果显示突变体变矮是由于茎第一节间细胞数目变少所致，而突变体的低育性是由于花粉败育导致的(见实施例3)。6.基因功能互补实验和RNAi (RNA干涉)抑制实验(见实施例4)证明了本发明获得的候选基因OsLIS-Ll的失活是引起oslis-11突变表型的原因，OsLIS-Ll基因控制水稻的株高和花粉育性。7.利用 RT(Reverse transcription 反转录)-PCR 研究 OsLIS-Ll 基因的表达模式，证明OsLIS-Ll基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达，但在茎和穗中表达量相对要高些(见实施例5)。更详细的技术发明细节将由下述实施例给出。本发明的优点在于I.本基因的成功克隆进一步证实了采用T-DNA标签法克隆基因的可行性，而且该方法克隆基因速度快，效率高。2.本发明提供了一个调控水稻株高和花粉育性的基因OsLIS-Ll及其编码蛋白，有利于理解水稻茎和花粉的发育过程。3.利用本基因构建的不同载体，通过基因工程的方法创造矮杆水稻和水稻雄性不育系，拓展了矮杆基因和雄性不育基因在水稻育种中的应用。
SEQ ID NO 1是本发明克隆的OsLIS-Ll基因的cDNA序列，序列全长为3402bp。SEQ ID NO 2是OsLIS-Ll基因编码的氨基酸序列，编码1133个氨基酸。
图I.水稻oslis-11-l突变体的表型。图中图IA :左边野生型植株(WT)与右边oslis-11-l突变体抽穗期的表型，oslis-11-l突变体与野生型(WT)相比半矮。图IB :抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，显微观察，左边为oslis-11-1突变体，大部分不着色，右边为野生型植株(WT)，花粉着色正常。图2. OsLIS-Ll基因与突变表型的共分离验证。图中图2A :0sLIS_Ll基因的结构和T-DNA插入位点分析。蓝色方框表不5’末端,浅蓝色方框表3’末端,红色方框表OsLIS-Ll基因的外显子。LI，Rl表示跨oslis-11-l家系T-DNA的两条基因组引物，NTLB5表示位于oslis-11-l家系T-DNA上的边界引物；L2，R2表示跨韩国等位突变体oslis-11-2家系T-DNA的两条基因组引物，iAPLl表示位于韩国等位突变体oslis-11-2家系T-DNA上的边界引物。图2B T1代共分离实验胶图。植株基因型的确定=OsLIS-Ll纯合T-DNA插入植株当LI和NTLB5配对时可以扩增出目标产物约O. 7kb，由于T-DNA插入片段太大，LI与Rl配对无扩增产物；野生型植株由于无T-DNA插入，故LI和NTLB5配对无扩增产物，但LI与Rl配对扩增能得到目标产物约Ikb ;而OsLIS-Ll杂合T-DNA插入转基因植株用LI和Rl 配对以及LI和NTLB5配对时都可以得到目的产物。植株表型20个Tl代单株中第8、9、10、20株为突变表型。由图可知突变植株的基因型均为OsLIS-Ll纯合T-DNA插入，而正常植株的基因型为野生或杂合型，这ー结果表明突变表型与OsLIS-Ll基因内的T-DNA插入共分离。图3. oslis-11-l 等位突变体 oslis-11-2 的表型。图中图 3A :左为 oslis-11-2突变体，右为野生型植株(WT)，突变体与野生型相比半矮。图3B :抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，显微观察，左边为oslis-11-2突变体，花粉大部分不着色，右边为野生型植株(WT)，花粉着色正常。图3C T1代共分离实验胶图。植株表型20个Tl代单株中第2、7、13、17株为突变表型。图4.野生型和oslis-11-2突变体茎各节间长度统计和茎第一节间半薄切片观察。图中图4A :野生型和oslis-11-2突变体在成熟期茎各节间长度显示。图片显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间长度差距明显，而其它茎节间长度差距不明显。从左自右分别为oslis-11-2突变体的第一、第二、第三、第四和第五茎节间，野生型的第一、第二、第三、第四和第五茎节间。图4B :野生型和oslis-11-2突变体在成熟期茎各节间长度统计结果。结果显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间长度差距明显，而其它茎节间长度差距不明显。图4C和图4D :野生型(C)和oslis-11-2突变体(D)茎第一节间半薄切片横切。结果显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间细胞层数无差別。图4E和图4F :野生型(E)和oslis-11-2突变体(F)茎第一节间半薄切片纵切。结果显示野生型和oslis-11-2突变体茎第一节间细胞大小无差別。注从穗往下为第一节间。图5.野生型和oslis-11-2突变体不同时期花药的半薄切片观察。图中(A)、(C)、(E)、(G)、(I)、(K)、(M)和(O)分别表示野生型花药在减数分裂早前期、小孢子母细胞时期、減数分裂时期、四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期、有丝分裂时期和成熟花粉期的花药横切片。(B)、(D)、(F)、⑶、(J)、(L)、(N)和(P)分别表示oslis-11-2突变体在減数分裂早前期、小孢子母细胞时期、減数分裂时期、四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期、有丝分裂时期和成熟花粉期的花药横切片。E，表皮细胞；En，药室内壁；ML，中层；T，绒毡层；Ms，小孢子母细胞；Tds，四分体；Msp，小孢子；MP，成熟花粉；SPC，第二层壁细胞；SC,造孢细胞。Bars = 50 μ m。图6.本发明设计的功能互补载体pC2301-0sLIS-Ll结构示意图。图7.本发明设计的RNAi (RNA干涉)载体pDS-0sLIS_Ll结构示意图。图8.基因功能互补实验和RNAi (RNA干渉)抑制实验。图中图8A :基因功能互补实验。左边为转基因阴性植株，表现为oslis-11-2突变表型，右边为转OsLIS-Ll基因阳性恢复野生型表型的植株。图8B =RT-PCR检测了 3株恢复正常表型(前3个)和I株阴性植株(最后I个)中OsLIS-Ll基因的表达量，结果显示3株恢复正常表型的植株中OsLIS-Ll基因的表达量也恢复到正常水平，而I株阴性植株中OsLIS-Ll基因的表达量和突变体ー样几乎检测不到。以GAPDH做为内标。图8C : RNAi (RNA干渉)抑制实验。左边为阳性植株，表现为突变表型，右边为阴性植株，表现为野生型。图8D :抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，显微观察，左边为阳性植株，花粉大部分不着色，右边为阴性植株，花粉着色正常。图9. RT (Reverse transcription 反转录)-PCR 分析 OsLIS-Ll 基因的表达模式。 抽穗期时OsLIS-Ll基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达，但在茎和穗中表达量相对要高些。另外，该基因在突变体中的表达量几乎检测不到，表明T-DNA的插入严重影响了该基因的正常表达。以GAPDH做为内标。
具体实施例方式实施例I :0sLIS-Ll基因的分离克隆I. oslis-11-l突变体的获得所用的水稻T-DNA插入突变体库由湖北省武汉市华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室利用载体pFX_E24. 2-15R构建而成(Wu等，Development of enhancer traplines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 :418-427 ;Zhang 等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of thegenome hierarchy as revealed by analyzing 13,804T-DNA flanking sequences froman enhancer-trap mutant library. Plant J, 2007,49 :947-959)。2005 年，从 TO 代突变体洋(见 http://rmd. ncpgr. cn/, Zhang 等，RMD :a rice mutant database for functionalanalysis of the rice genome. Nucl Acids Res, 2006, 34 :D745_D748)挑选出 3000 份水稻转基因品种“中花11号(为中国农业科学院作物科学研究培育的常规水稻品种)”的种子，经浸种、催芽后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料种两行，每行10株，为ー个家系。种植密度为5寸X8寸，种植地点为武汉华中农业大学的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。在水稻整个生育期田间记载突变体的表型，对于同一家系内突变植株的表型一致、符合典型的3 I分离的家系并及时抽提DNA进行PCR阳性检测，对于ー个家系内的所有突变体单株PCR均为阳性的家系作为后续研究的材料。PCR阳性检测的引物位于T-DNA区段上，ー对引物的序列分别是GV-F 5-GGCATCGGTAAACATCTG CT-3，GV-R 5-GCCTCAAGAAGCTCAAGTGC-3, PCR 产物大小为 61 lbp，反应体系的总体积为20μ 1，具体包含DNA模板I μ L ;10倍体积的Taq酶反应缓冲液2μ I ；2mM dNTP I. 5 μ L ;25mM 镁离子 I. 2 μ L ; 10 μ M 引物(GV-F+GV-R) O. 2 μ L ;0· 3 单位 Taq 酶，加双蒸水至20 μし反应程序为94°C变性5分钟，94°C 45秒、55°C 45秒、72°C I分钟，共进行30个循环，72 °C延伸5分钟。
通过实施例I得到一个突变体,该突变体从外观上看植株半矮和低育性如图IA所示，申请人将这个突变体命名为oslis-11-l。取抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，显微观察如图IB所示，野生植株的花粉正常着色，且花粉粒呈正常的圆形，突变体的花粉染色結果，大部分都不着色，显示该突变体是雄性育性降低的突变体。至成熟吋，考种发现突变体oslis-11-l结实率仅为11. 3%，株高为野生型株高的56. 0%。水稻oslis-11突变体和野生型考种结果见表I所示。表I水稻oslis-11突变体和野生型考种结果
权利要求
1.OsLIS-Ll基因控制水稻株高和花粉育性的应用，其特征在于，所述的OsLIS-Ll基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻植株株高和育性基因OsLIS-L1的DNA片断的分离克隆、功能验证和应用。所述的DNA片断突变体后导致水稻植株半矮，大部分花粉败育。本发明揭示了该基因在控制水稻株高及育性等农艺性状分子机理等方面的应用。
文档编号C12N15/29GK102676536SQ20111005794
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者吴昌银, 郜新强 申请人:华中农业大学