肝癌相关的亮氨酸富集不育阿尔法模体1基因甲基化位点及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了与肝癌相关的亮氨酸富集不育阿尔法模体1(leucine rich repeat and sterile alpha motif containing 1,LRSAM1)基因甲基化位点及其应用，特点是利用一种焦磷酸测序法定量检测与肝癌相关的人LRSAM1基因特异性位点cg05840553甲基化水平，设计了其独有的引物，包括PCR扩增引物和甲基化测序引物，其中，所述PCR上游引物序列为：5，-GGGAAGTTAGTAGTTGTTTAGTAGGTATG-3，，下游引物序列为：biotin-5，-ACTTAAAAACATTAAACAACCAACATCTA-3，，甲基化测序引物序列为：5，-ATATTTATAATATAGTTGGAA-3，。本发明在原发性肝细胞癌患者中筛查LRSAM1基因的特异性位点，并设计了针对该位点的焦磷酸测序PCR引物和甲基化测序引物，通过焦磷酸测序技术能对该特异性位点的甲基化水平进行快速准确的定量检测。
【专利说明】肝癌相关的亮氨酸富集不育阿尔法模体1基因甲基化位点及应用
【技术领域】
[0001]本研究涉及亮氨酸富集不育阿尔法模体I ( leucine rich repeat and sterilealpha motif containing I, LRSAMI)基因特异性DNA (脱氧核糖核酸)甲基化位点在肝癌中的甲基化定量信息的改变，具体的说是应用焦磷酸测序技术发现LRSAMl基因特异性DNA甲基化位点(cg05840553)在肝癌中甲基化程度减少，为了解肝癌的发病机理，寻找到有潜在临床意义的肿瘤预防及治疗靶点提供支持。
【背景技术】
[0002]肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是我国位居第二的癌症“杀手”。目前对肝癌的治疗主要以手术、放化疗为主，同时结合其它治疗方法，如免疫治疗、中医等；但由于对于肝癌的发病机制不太清楚及缺乏有效的治疗靶点，对于中后期的病人治疗效果不佳。研究表明，肝癌发生发展是一个表观遗传学调控的过程。DNA甲基化是目前表观遗传学研究的热点之一，它是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)介导下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，将甲基基团转移到DNA某些碱基上的过程。DNA甲基化异常被认为是发生肿瘤(包括肝癌)的一个重要原因。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。
[0003]LRSAMl基因编码一个指环状的蛋白，该蛋白参与多种重要的生物学功能，包括信号通路调节、细胞粘附、泛素化、细胞内吞作用等。LRSAM基因异常，与部分肿瘤具有相关性。LRSAM特异性DNA位点甲基化与肝癌的关系目前国内外未见研究报道。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测人LRSAMl基因特异性位点的甲基化水平及特异性引物，利用该引物可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平。
[0005]本发明的技术内容是:
1.肝癌相关的亮氨酸富集不育阿尔法模体I ( leucine rich repeat and sterilealpha motif containing I, LRSAM1)基因甲基化位点,其特征在于:甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的DNA中，LRSAMl基因的一个位点cg05840553的甲基化水平明显低于癌旁组，差异具有显著性，该特异性位点所在的核酸序列为:GGCATGAGACACAGCCTGCCACATTAACTGCTAGGTTTACATCTACAACACAGCTGGAAA应CTCACTGGATCTTCACCCACACCCCGTTTAATCTCCCAACAACGCCATGCCCACTTCCTG，下划线处碱基为该甲基化位点的确切位置，该位点距LRSAMl基因转录起始位点1157个碱基。
[0006]2.肝癌相关的LRSAMl基因甲基化位点的应用，其特征在于:焦磷酸测序法定量检测人LRSAMl基因特异性甲基化位点cg05840553，特异性甲基化位点的引物，包括PCR引物和甲基化测序弓丨物，其中，所述PCR上游引物序列为:5’ -GGGAAGTTAGTAGTTGTTTAGTAGGTATG-3’，下游引物序列为:b1tin-5’ -ACTTAAAAACATTAAACAACCAACATCTA-3’，甲基化测序引物序列为:5’ -ATATTTATAATATAGTTGGAA-3’ ；利用该引物可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平。
[0007]3.所述肝癌相关的LRSAMl基因甲基化位点的应用，其特征在于:应用焦磷酸测序对LRSAMl基因cg05840553位点甲基化程度检测中，原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织存在显著性差异；cg05840553在肝癌中甲基化程度显著降低；通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。
[0008]本发明利用Infinium HumanMethylat1n27 BeadChip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，LRSAMl基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为:cg05840553)的甲基化水平明显低于癌旁组。
[0009]为了避免甲基化芯片的筛测结果偏差，及保证筛测结果的准确性，本发明采用焦磷酸测序对该位点(cg05840553)的甲基化水平进行检测。检测方法包括如下步骤:
1)分别提取原发性肝细胞癌组织及癌旁组织的基因组DNA，分别对所有样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；
2)以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，针对位点(cg05840553)的上下游序列设计所述的PCR引物和测序引物。
[0010]3)以重亚硫酸盐转化后的人基因组DNA为模板，利用所述的PCR引物和测序引物进行焦磷酸测序，分析(cg05840553 )位点的甲基化水平。
[0011]经检测，原发性肝细胞癌组中cg05840553位点的甲基化水平明显低于同一标本来源的癌旁组织，与甲基化芯片的筛测结果一致。表明(cg05840553)位点是LRSAMl基因中的特异性位点。
[0012]与已有技术相比，本发明的有益效果为:本发明发现了与原发性肝细胞癌人群相关的LRSAMl基因的特异性DNA甲级化位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序PCR引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测。为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为焦磷酸测序PCR引物扩增产物的电泳结果图；
图2为焦磷酸测序结果图，其中蓝色柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比;A为癌组织，B为癌旁组织。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0015]1.异性位点分析
用Infinium HumanMethyIat1n27 BeadChip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组DNA中，LRSAMl基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为:(cg05840553)的甲基化水平明显低于癌旁组。该特异性位点所在的序列为(SEQ ID N0.1):
GGCATGAGACACAGCCTGCCACATTAACTGCTAGGTTTACATCTACAACACAGCTGGAAA[CG]CTCACTGGATCTTCACCCACACCCCGTTTAATCTCCCAACAACGCCATGCCCACTT CCTG
为检测该筛查结果的准确性，设计相关特异性引物，利用焦磷酸测序法对该特异性位点的特异性进行验证。
[0016]2.人基因组DNA提取
I)采集42位原发性肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，提取每个样本的基因组DNA，操作按照德国 QIAGEN QIAamp DNA mini kit (Cat.N0.51304)说明书进行。
[0017]2)对获取的基因组DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳分析。
[0018]3)重亚硫酸盐转化
使用德国QIAGEN公司转化试剂盒Epitect Bisulfite Kit (Cat.N0.59104)进行重亚硫酸盐转化，步骤按照该试剂盒说明书进行。
[0019]3.引物设计
以经重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，使用QIAGEN公司PyroMark AssayDesign2.0软件设计焦磷酸测序PCR引物及测序引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。
[0020]4.焦磷酸测序
I) PCR扩增
以重亚硫酸盐转化后的基因组DNA为模板，利用下列条件进行PCR反应，体系如下: 总体系:50μ I
1XBuffer (缓冲液)5 μ I
Mg2+ (镁离子)2 μ I
dNTP (三磷酸脱氧核苷酸) I μ I 引物I?μ?
引物21μ I
酶0.2μ1
水38.8 μ I
反应条件:94 °C 2min; 94 °C 30sec, 60 °C lmin, 68 °C Imin(50 个循环)；68 °C1min.反应完成后对PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，验证产物的特异性与准确性，见图1。
[0021]2)焦磷酸测序
在德国QIAGEN PyroMark Q96ID平台上，进行焦磷酸测序，具体步骤按仪器说明书进行。
[0022]3 ) DNA甲基化检测结果
甲基化结果显示:cg05840553位点癌旁组的甲基化水平明显高于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为30.73±11.45，癌组甲基化平均水平为5.21 ±5.21 (p〈0.05)。测序图见图2。
[0023]4)结论:研究结果发现原发性肝细胞癌中(cg05840553)位点的甲基化水平明显低于癌旁组。因此，本发明针对(cg05840553)位点设计的焦磷酸测序PCR引物和测序引物可用于原发性肝细胞癌中(cg05840553)位点的甲基化水平进行定量检测。
[0024]序列表
SEQUENCE LISTING
<110>杨小丽；何敏；刘坤；张成东；张悦宁 〈120〉肝癌相关的LRSAMl基因甲基化位点及应用 〈130〉 2014 〈160〉 4
<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211〉 122
〈212〉 DNA
〈213〉人
〈400〉 I
ggcatgagac acagcctgcc acattaactg ctaggtttac atctacaaca cagctggaaa 60
cgctcactgg atcttcaccc acaccccgtt taatctccca acaacgccat gcccacttcc 120
tg 122
〈210〉 2
〈211〉 29
〈212〉 DNA
〈213〉人
〈400〉 2
gggaagttag tagttgttta gtaggtatg29
〈210〉 3
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉人
〈400〉 3
ttaaaaacat taaacaacca acatcta27
〈210〉 4
〈211〉 17
〈212〉 DNA
〈213〉人
〈400〉 4
ttataatata gttggaa17
【权利要求】
1.肝癌相关的亮氨酸富集不育阿尔法模体I( leucine rich repeat and sterilealpha motif containing I, LRSAM1)基因甲基化位点,其特征在于:甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的DNA中，LRSAMl基因的一个位点cg05840553的甲基化水平明显低于癌旁组，差异具有显著性，该特异性位点所在的核酸序列为:GGCATGAGACACAGCCTGCCACATTAACTGCTAGGTTTACATCTACAACACAGCTGGAAA应CTCACTGGATCTTCACCCACACCCCGTTTAATCTCCCAACAACGCCATGCCCACTTCCTG，下划线处碱基为该甲基化位点的确切位置，该位点距LRSAMl基因转录起始位点1157个碱基。
2.肝癌相关的LRSAMl基因甲基化位点的应用，其特征在于:焦磷酸测序法定量检测人LRSAMl基因特异性甲基化位点cg05840553，特异性甲基化位点的引物，包括PCR引物和甲基化测序引物，其中，所述PCR上游引物序列为:5’ -GGGAAGTTAGTAGTTGTTTAGTAGGTATG-3，，下游引物序列为:b1tin-5’ -ACTTAAAAACATTAAACAACCAACATCTA-3’，甲基化测序引物序列为:5’ -ATATTTATAATATAGTTGGAA-3’ ；利用该引物可以准确检测人原发性肝细胞癌组织中特异性DNA位点的甲基化水平。
3.如权利要求2所述肝癌相关的LRSAMl基因甲基化位点的应用，其特征在于:应用焦磷酸测序对LRSAMl基因cg05840553位点甲基化程度检测中，原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织存在显著性差异；cg05840553在肝癌中甲基化程度显著降低；通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。
【文档编号】C12Q1/68GK104250664SQ201410262915
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】杨小丽, 何敏, 刘坤, 张成东, 张悦宁 申请人:杨小丽