绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步pcr分子鉴定方法
【专利摘要】绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法，涉及一种鲍的DNA分子标记检测。(1)采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取绿鲍、皱纹盘鲍及其杂交子一代基因组DNA；(2)以所提取的基因组DNA为模板进行多重PCR和常规PCR的平行扩增；(3)PCR扩增反应程序为：多重PCR反应程序和常规PCR反应程序；(4)对两个PCR反应扩增产物分别进行凝胶电泳；(5)将电泳图谱与标准图谱进行比对；(6)对电泳结果图谱进行分析。利用绿鲍和皱纹盘鲍线粒体基因和核基因的种间特异性位点，检测时间短、结果直观，检测成本低、检测技术易于操作，可准确、简单、快捷的对杂交种的真伪进行检测，具有应用和推广价值。
【专利说明】绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鲍的DNA分子标记检测，尤其是涉及绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002]鲍是海洋贝类的一种，被誉为海产八珍之首，素有“软黄金”之称，具有极高的营养价值和经济价值。我国是世界第一养鲍大国，据2012年渔业管理部门统计，我国鲍的养殖产量达9万余吨，占全球鲍产量的80%以上，年产值超100亿元，鲍养殖产业现已成为我国海水养殖产业的支柱之一。
[0003]皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)主要分布在辽东半岛和山东半岛一带,近年来，南移养殖成功，已成为我国南方主要的养殖鲍种。但由于皱纹盘鲍的耐高温能力较差，夏季高温期死亡率高,给养殖生产带来巨大损失。本 申请人:2009年从美国弓丨进一批绿鲍(Haliotis f μ I gen),该鲍种具有个体大、耐高温、繁殖量大、肉质鲜美等特点。根据绿鲍与皱纹盘鲍在耐高温等形状上的互补性，通过绿鲍与皱纹盘鲍进行杂交，培育出生长快、耐高温、抗逆性强的品种，对于我国改善鲍养殖品种结构和推动整个鲍养殖业的产业链发展具有重要意义。 [0004]目前，国内外对鲍及种间杂交的鉴定方法主要有4种:(I)外形特征鉴别:通过鲍的外形特征进行鉴定，如壳色、颜色、呼吸孔高度、螺顶高低水平、腹足颜色等进行判断。该方法的优点是比较直观可大量操作。其缺点是要求个体规格较大，在种苗阶段难于进行。
(2)同工酶鉴定:主要是通过聚丙烯酰胺凝胶或淀粉凝胶电泳技术，进一步分析作为基因产物的蛋白质和同工酶来鉴定鲍种及不同鲍之间的杂交种。该技术操作要求严格，程序复杂，识别不直观，而且同工酶表达与组织及发育时期有关，可利用的酶种类较少，重复性不够好。(3)RFLP鉴定:对样品纯度要求较高，样品用量大，技术步骤繁琐、成本较高，应用受到了一定的限制。(4)SSR微卫星鉴定:检测位点数量多，多态性高，但结果不够直观，结果具有共显性，并且不能鉴定出杂交种的母本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供能简单、快速鉴定绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法。
[0006]本发明的具体步骤如下:
[0007](I)采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取绿鲍、皱纹盘鲍及其杂交子一代基因组DNA ；
[0008](2)以所提取的基因组DNA为模板进行多重PCR和常规PCR的平行扩增；
[0009]多重PCR扩增采用两对特异性引物:
[0010]引物1:afal42
[0011]F:CCGTTGAACATGCTCACAGTA[0012]R: TAATGGGCACATTCCGTAAAT
[0013]引物2:DF_1
[0014]F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
[0015]R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
[0016]常规PCR扩增中采用的特异性引物:
[0017]引物:DF-2
[0018]F:TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
[0019]R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT ；
[0020]在步骤⑵中，所述扩增的反应体积可为25μ1，其中各组分用量可为:Buffer (IOmM) 2.5 μ I，dNTP (2.5mM) 0.5 μ I，Mg2+ (25mM) 1.5 μ I，rTaq (5U/ μ I) 0.2 μ I，弓 I物0.2mM，基因组DNA20-100ng，用双蒸水补齐到25 μ I ;所述引物I与引物2的体积比可为I: 10
[0021](3) PCR扩增反应程序为:
[0022]多重PCR反应程序:
[0023]94°C3min— {94°C30s— [65°C —55°C每个循环降低0.5°C] — 72°C20s} X20 — {94°C 30s — 55°C 30s — 72°C 15s} — 72°C IOmin — 4°C^ ；
[0024]常规PCR反应程序:
[0025]94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 30°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C ⑴；
[0026](4)对两个PCR反应扩增产物分别进行凝胶电泳；
[0027]在步骤(4)中，所述凝胶电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，质量体积百分比浓度可为
1.2%, 100V电压，电泳时间可为20~40min ；
[0028](5)将电泳图谱与标准图谱进行比对。
[0029](6)对电泳结果图谱进行分析，其中:
[0030]多重PCR中，由引物I扩增出的目的条带为大小在250bp左右皱纹盘鲍特异性的条带(条带1-1)，由引物2扩增出的目的条带为大小在500~750bp之间的绿鲍特异性条带(条带1-2);常规PCR中，扩增出的产物是条带为大小在250bp左右的特异性条带(条带 2-1)。
[0031]将电泳结果于可见灯箱下观察拍照。
[0032]电泳图谱进行比对后，只具有条带1-1的DNA样品，即为皱纹盘鲍样品；只具有条带1-2的DNA样品，即为绿鲍样品。同时具有条带1-1及条带1-2的样品，即同时具有亲本皱纹盘鲍和亲本绿鲍的特异性条带，说明该个体系二者的杂交种；具有条带2-1的DNA样品，即含有绿鲍线粒体基因特异性片段的DNA样品，能判断是绿鲍样品或以绿鲍为母本的杂交子代。不具有任何条带的DNA样品，即不含有绿鲍线粒体基因特异性片段的DNA样品，能判断是皱纹盘鲍样品或以皱纹盘鲍为母本的杂交子代。
[0033]同时，具有条带1-1，条带1-2，条带2-1的DNA样品，说明是以绿鲍为母本，皱纹盘鲍为父本的杂交后代，只具有条带1-1及条带1-2的DNA样品，说明是以皱纹盘鲍为母本，绿鲍为父本的杂交后代。
[0034]本发明在引种成功的基础上，对绿鲍与皱纹盘鲍进行杂交育种，获得了绿鲍与皱纹盘鲍的杂交子代。经验证，杂交种在长势、存活率及抗逆性上具有较高的杂种优势。然而，由于杂交种的外形与其父母本绿鲍和皱纹盘鲍过于相似，无法通过外形进行有效的鉴别。为准确判断杂交种的真伪、保护鲍养殖人员的利益、提供鲍养殖产业的积极性，本发明提供了一种准确、快捷的杂交种鉴定方法。
[0035]本发明采用多重PCR和常规PCR相结合的二步PCR法，利用绿鲍和皱纹盘鲍线粒体基因和核基因的种间特异性位点，具有检测时间短、结果直观，检测成本低、检测技术易于操作等优点，可准确、简单、快捷的对杂交种的真伪进行检测，具有应用和推广价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为电泳图谱对比图。
[0037]图2为电泳图谱对比图。
[0038]在图1和2中，M是DNA marker (DL2000) ; I~4是皱纹盘鲍，5~8是绿鲍，9~12是绿鲍与皱纹盘鲍反交子一代(皱纹盘鲍早X绿鲍? ), 13~16是绿鲍与皱纹盘鲍正交子一代(绿鲍早X皱纹盘鲍? );从上至下，条带大小分别为2000bp，750bp，250bp。
【具体实施方式】
[0039]实施例1
[0040]参见图1，利用绿鲍早X皱纹盘鲍?进行杂交，获得杂交苗种，采用采用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP324)提取样品的基因组DNA。以DNA模板平行进行常规PCR和多重PCR扩增反应，反应最适体积为25 μ 1，其中各组分终浓度分别为:BufferlOmM, dNTP0.2mM, Mg2+1.5mM, TaqlU，引物对 0.2mM(如引物多对，0.2mM 为标准量)，基因组DNA50ng，用双蒸水补齐到25 μ I ;
[0041]引物1:afal42
[0042]F:CCGTTGAACATGCTCACAGTA
[0043]R: TAATGGGCACATTCCGTAAAT
[0044]引物2:DF_1
[0045]F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
[0046]R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
[0047]注:其中引物I与引物2的体积比为1:1
[0048]常规PCR扩增中采用的特异性引物:
[0049]引物:DF-2
[0050]F:TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
[0051]R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT
[0052](3) PCR扩增反应程序为:
[0053]多重PCR反应程序:
[0054]94°C3min— {94°C30s— [65°C —55°C每个循环降低0.5°C] — 72°C20s} X20 — {94°C 30s — 55°C 30s — 72°C 20s} — 72°C IOmin — 4°C^?。
[0055]常规PCR反应程序:
[0056]94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 72°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C ⑴。
[0057]PCR反应结束后，取4.5 μ I PCR扩增产物在质量体积百分比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，IOOV电压，电泳20~40min。电泳结束后在可见灯箱下进行观察，同时对电泳图谱进行对比分析。
[0058]电泳图谱进行比对后，只具有条带1-1的DNA样品，说明该个体为皱纹盘鲍的DNA样品；只具有条带1-2的DNA样品，说明该个体为绿鲍的DNA样品。同时具有条带1_1及条带1-2的样品，即同时具有亲本皱纹盘鲍和亲本绿鲍的特异性条带，说明该个体系杂交种，缺少其中任意一条即为假杂种；具有条带1-1，条带1-2，条带2-1的DNA样品，说明是以绿鲍为母本，皱纹盘鲍为父本的杂交后代。三条特征带缺一，均不能证明该杂交种为绿鲍为母本皱纹盘鲍为父本的杂种个体。
[0059]实施例2
[0060]参见图1与2，与实施例1相似，所不同之处在于利用皱纹盘鲍早X绿鲍?进行杂交，获得杂交苗种。将PCR扩增产物电泳结果图谱进行比对，只具有条带1-1的DNA样品，说明该个体为皱纹盘鲍的DNA样品；只具有条带1-2的DNA样品，说明该个体为绿鲍的DNA样品。同时具有条带1-1及条带1-2的样品，即同时具有亲本皱纹盘鲍和亲本绿鲍的特异性条带，说明该个体系杂交种，缺少其中任意一条即为假杂种；具有条带1-1，条带1-2，不具有条带2-1的DNA样品，说明是以皱纹盘鲍为母本，绿鲍为父本的杂交后代。两条带条带缺一或多一，均不能证明该杂交种为皱纹盘鲍为母本绿鲍为父本的杂种个体。
[0061]本发明利用线粒体基因特异性片段和核基因特异性片段共同对二种鲍的杂交种及其亲本进行分子鉴定，具有遗传稳定、操作简便、鉴定快速、结果直观、经济实用等优点。采用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取绿鲍、皱纹盘鲍及其正反杂交种的基因组DNA，进行多重PCR和常规PCR扩增反应，采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行观察，比对亲本与正、反杂交子代特异性条带的差异，进而鉴别出绿鲍、皱纹盘鲍及其正反杂交种。
【权利要求】
1.绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法，其特征在于其具体步骤如下: (1)采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取绿鲍、皱纹盘鲍及其杂交子一代基因组DNA ； (2)以所提取的基因组DNA为模板进行多重PCR和常规PCR的平行扩增； 多重PCR扩增采用两对特异性引物:
引物 I:afal42
F: CCGTTGAACATGCTCACAGTA
R:TAATGGGCACATTCCGTAAAT
引物2 =DF-1
F:ATCTCAATTAGTGCGACATCAC
R:CCAGAGCAAACTGATCGACTG
常规PCR扩增中采用的特异性引物: 引物:DF-2
F: TTCTCTGTTAATTTGTGTGG
R:CCGGTCTGAACTCAGATCACGT ； (3)PCR扩增反应程序为: 多重PCR反应程序: 94°C3min— {94°C30s— [65°C —55?每个循环降低0.5°C ] ^ 72°C 20s} X20^ {94°C30s — 55°C 30s — 72°C 15s} — 72°C IOmin — 4°C^ ； 常规PCR反应程序:
94°C 3min — {94°C 30s — 54°C 30s — 30°C 30s} X 30 — 72°C IOmin — 4°C^ ； (4)对两个PCR反应扩增产物分别进行凝胶电泳； (5)将电泳图谱与标准图谱进行比对； (6)对电泳结果图谱进行分析，其中: 多重PCR中，由引物I扩增出的目的条带为大小在250bp左右皱纹盘鲍特异性的条带，记为条带1-1，由引物2扩增出的目的条带为大小在500~750bp之间的绿鲍特异性条带，记为条带1-2 ;常规PCR中，扩增出的产物是条带为大小在250bp左右的特异性条带，记为条带2-1 ； 将电泳结果于可见灯箱下观察拍照； 电泳图谱进行比对后，只具有条带1-1的DNA样品，即为皱纹盘鲍样品；只具有条带1-2的DNA样品，即为绿鲍样品；同时具有条带1-1及条带1-2的样品，即同时具有亲本皱纹盘鲍和亲本绿鲍的特异性条带，说明该个体系二者的杂交种；具有条带2-1的DNA样品，即含有绿鲍 线粒体基因特异性片段的DNA样品，能判断是绿鲍样品或以绿鲍为母本的杂交子代；不具有任何条带的DNA样品，即不含有绿鲍线粒体基因特异性片段的DNA样品，能判断是皱纹盘鲍样品或以皱纹盘鲍为母本的杂交子代； 同时，具有条带1-1，条带1-2，条带2-1的DNA样品，说明是以绿鲍为母本，皱纹盘鲍为父本的杂交后代，只具有条带1-1及条带1-2的DNA样品，说明是以皱纹盘鲍为母本，绿鲍为父本的杂交后代。
2.如权利要求1所述绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法，其特征在于在步骤(2)中，所述扩增的反应体积可为25μ 1，其中各组分用量可为:Buffer2.5μ 1，dNTP0.5 μ 1，Mg2+1.5μ 1，rTaq0.2 μ 1，引物 0.2mM，基因组 DNA20_100ng，用双蒸水补齐到25 μ I。
3.如权利要求1所述绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法，其特征在于在步骤(2)中，所述引物I与引物2的体积比为1:1。
4.如权利要求1所述绿鲍与皱纹盘鲍杂交种的二步PCR分子鉴定方法，其特征在于在步骤⑷中，所述凝胶电泳采用 琼脂糖凝胶电泳，质量体积百分比浓度为1.2%, IOOV电压，电泳时间为20~40min。
【文档编号】C12Q1/68GK104004855SQ201410279120
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】游伟伟, 郭勍, 柯才焕, 任鹏, 骆轩, 黄妙琴 申请人:厦门大学