一种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方法，包括以下步骤：(1)将酵母细胞溶液分为两份，对其中一份进行脉冲电场处理，得到测试样，另一份作为空白对照样；(2)对测试样和空白对照样分别进行梯度稀释，分别得到其合适稀释度的稀释液；(3)将合适稀释度的稀释液用酵母的富集培养基进行倾注平板，并在酵母的最适生长条件下培养；(4)培养结束后，给菌落数为30～300的平板拍照，并用图像分析软件分析，得出每个平板上的菌落总数和每个菌落的直径；(5)通过统计菌落直径分布，得出亚致死酵母细胞的数量比例。本发明操作程序简单快捷、经济适用，能够较好地检测亚致死酵母细胞的数量。
【专利说明】-种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及液体食品中微生物的检测方法，特别涉及一种基于图像分析的脉冲电 场作用下亚致死酵母的检测方法。
【背景技术】
[0002] 当前应用的各种杀菌手段，如脉冲电场（PEF)技术等，在用于食品物料杀菌时均 存在杀菌不彻底的现象，也就是说食品物料经PEF等杀菌技术处理后，物料中的微生物存 在着亚致死状态，即亚致死损伤。而微生物的亚致死损伤是一种可逆损伤，在适宜条件下可 进行自我修复，从而恢复其繁殖能力和功能性，进而对相应食品的卫生安全及货架期造成 严重威胁，形成一种安全隐患。因此，对经PEF处理后食品中亚致死状态细胞进行检测就显 得十分必要。只有了解亚致死状态细胞的存在情况，然后才能进一步强化杀菌条件来满足 杀菌效果，从而达到卫生要求，进而延长产品货架期。
[0003] 有研究表明，对于亚致死损伤的细胞，一般可以通过流式细胞仪结合荧光染色技 术来实现在线检测，但该方法技术在设备方面投资成本高，而且对操作人员的技术要求也 较高。另外，由于亚致死损伤细胞不能在选择性培养基上生长，所以通过选择性和非选择性 培养基培养法也能检测亚致死损伤细胞，但这种方法整个过程存在着一定的繁琐性。
[0004] 中国发明专利201180062381. 0公布了一种包括多孔载体的灭菌指示器和方法， 可以通过测量活性酶的活性而测试灭菌工序的有效性。中国发明专利201110356426. 7 公布了一种有效杀灭高压脉冲电场处理食品中亚致死微生物延长货架期的方法，主要 是通过降低高压脉冲电场损伤亚致死微生物修复的可能性来实现的。中国发明专利 201210327623. 0公布了一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，可以选择性富集禽蛋 中极低数量受亚致死损伤的沙门氏菌。但是上述专利涉及的方法均存在如下问题：虽涉及 微生物的亚致死损伤，但基本上都是强调如何提高杀菌的有效性，而没有说明如何检测亚 致死状态微生物。中国发明专利201310373444. 5公布了一种脉冲电场作用下酿酒酵母亚 致死细胞的定量检测方法，可以通过选择性培养法初步估算出亚致死损伤酵母细胞。虽然 该方法能检测出PEF处理后酵母细胞的亚致死大体数量，但整个操作过程有些繁琐，工作 量较大，且比较费时。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于图像分析 的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方法，操作程序简单快捷、经济适用，能够较好地检测 亚致死酵母细胞的数量。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0007] -种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方法，包括以下步骤：
[0008] (1)将酵母细胞溶液分为两份，对其中一份进行脉冲电场处理，得到测试样，另一 份作为空白对照样；
[0009] (2)对测试样和空白对照样分别进行梯度稀释，分别得到测试样的合适稀释度的 稀释液和空白对照样的合适稀释度的稀释液；
[0010] (3)将测试样的合适稀释度的稀释液和空白对照样的合适稀释度的稀释液用酵母 的富集培养基进行倾注平板，并在酵母的最适生长条件下培养；
[0011] (4)待培养结束后，用500万像素以上的数码相机给菌落数为30-300的平板拍照， 并用图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，得出每个平板上的菌落总数和每 个菌落的直径；
[0012] (5)统计载有空白对照样的平板上菌落直径小于1. 8mm的菌落数m，然后统计出载 有测试样的平板上菌落直径小于1. 8mm的菌落数n，则脉冲电场处理中产生的亚致死酵母 数为m-n ;设载有空白对照样的平板菌落总数为N，则脉冲电场处理中的死酵母的数量比例 为（m_n)/N。
[0013] 步骤（3)所述酵母的富集培养基为内含细菌抑制剂的麦芽汁营养琼脂培养基。
[0014] 步骤（3)所述酵母的最适生长条件为：
[0015] 培养温度28?30°C，培养时间30?40小时。
[0016] 步骤（4)所述用图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，具体过程 为：
[0017] 打开Image-Pro Plus分析软件，读入数码照片，选择Biological模式，选取Count Small Cells方式计算每张数码照片的菌落总数和每个菌落的直径，根据菌落直径大小的 区间值划分，最后绘制菌落直径分布直方图。
[0018] 所述的脉冲电场处理具体为：在场强5?30kV/cm，脉宽40 μ m，频率1000Hz，流速 为40?60mL/min条件下处理1次。
[0019] 本发明的技术原理如下：微生物细胞经脉冲电场处理后，会出现三种不同生理状 态，即死亡细胞、完整细胞和亚致死细胞。死亡细胞在任何培养条件下都是不能生长繁殖 的；正常细胞在基本培养基和完全培养基上都能正常生长；但亚致死细胞比较特殊，由于 细胞受到一定程度的损伤，所以不能在基本培养基上生长繁殖，而必须在完全培养基上才 能生长繁殖。不仅如此，即便是在完全培养基中培养，因为亚致死损伤细胞需要一个自我修 复的过程，故其迟滞期相对于完整细胞来说，是较长的。因此，相对于未处理微生物细胞，经 脉冲电场处理后的微生物细胞在完全培养基上培养一定时间后，菌落形态就会出现很多小 面积菌落。对于微生物来说，当采用富集培养基培养时，正常细胞和受损伤细胞都会大大缩 短其迟滞期而进入对数生长期，从而缩短培养时间。一般微生物计数，由于采用普通培养 基，培养时间常常需要48小时，而采用营养丰富的富集培养基时，培养时间则可以缩短至 36小时或更短。因此，通过统计分析PEF处理后酵母细胞在富集培养基上培养36小时生长 的菌落面积（直径），能快速地知道平板上菌落直径分布，从而快速得到亚致死酵母的初步 数量。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
[0021] (1)本发明能较快速地确认脉冲电场处理后的酵母溶液中是否存在亚致死酵母细 胞。
[0022] (2)本发明的方法简单，可操作性强，通过图像分析软件Image-Pro Plus分析含 菌落的平板的数码照片，得出菌落个数和每个菌落的直径。由于正常酵母细胞与亚致死酵 母细胞的迟滞期和代谢速率有所差异，所以通过比较脉冲电场处理与未经脉冲电场处理的 酵母培养的菌落的直径分布直方图就能很好地得出亚致死酵母的大体数量比例。
[0023] (3)本发明的方法设备投入少，成本低，所有操作过程中使用的都是些常见的仪器 和器皿，且相关试剂也很普通易见。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明的实施例1得到的载有空白对照样的平板上的菌落直径分布直方 图。
[0025] 图2为本发明的实施例1得到的载有测试样的平板的菌落直径分布直方图。
[0026] 图3为本发明的实施例2得到的载有空白对照样的平板上的菌落直径分布直方 图。
[0027] 图4为本发明的实施例2得到的载有测试样的平板的菌落直径分布直方图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不 限于此。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例的基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方法，包括以下步 骤：
[0031] (1)将酵母细胞溶液分为两份，对其中一份进行脉冲电场处理，得到测试样，另一 份作为空白对照样；
[0032] 本实施例的酵母细胞溶液的制备过程如下：准确称取0. 50g maurivin TM系列的 葡萄酒活性干酵母，加入到200mL糖水溶液（白砂糖与蒸馏水的固液比为2% )中，36°C保 温30min，期间不断搅拌均匀，让活性干酵母充分复水活化。酵母活化液在4000rpm离心 lOmin，离心室温度为2°C，弃上清，收集细胞沉淀。在无菌操作台上将收集的细胞沉淀重悬 于200mL含0. 024%氯化钠的无菌盐水中，即得细胞重悬液。
[0033] 本实施例所述脉冲电场处理，具体为：利用华南理工大学轻工与食品学院自行设 计研制的高压脉冲电场处理系统对重悬的酵母细胞液进行处理。处理前，先用75%乙醇溶 液对处理室和管路等进行清洗消毒，再用无菌水清洗去除残留的乙醇溶液。脉冲电场处理 参数条件设置为：频率1000Hz，脉宽40 μ s，场强5kV/cm，流速60mL/min，处理1次，处理完 后将处理液静置冷却至室温，得到酿酒酵母细胞电场处理液，即本实施例的测试样；
[0034] (2)对测试样和空白对照样分别进行10倍梯度稀释，分别得到测试样的合适稀释 度的稀释液和空白对照样的合适稀释度的稀释液；
[0035] (3)将测试样的合适稀释度的稀释液和空白对照样的合适稀释度的稀释液用酵母 的富集培养基进行倾注平板，并在酵母的最适生长条件下培养；
[0036] 本实施例的酵母的富集培养基为麦芽汁营养琼脂培养基，内含微量的氯霉素等细 菌抑制剂，适合亚致死损伤细胞快速恢复其活性，缩短其迟滞期；
[0037] 所述酵母的最适生长条件为：培养温度28°C，培养时间40小时。
[0038] (4)待培养结束后，用500万像素以上的数码相机给菌落数为30-300的平板拍照， 并用图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，绘制菌落直径分布直方图，得出 每个平板上的菌落总数和每个菌落的直径；
[0039] 本实施例所述用图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，具体过程 为：
[0040] 打开Image-Pro Plus分析软件，读入数码照片，选择Biological模式，选取Count Small Cells方式计算每张数码照片的菌落总数和每个菌落的直径，根据菌落直径大小的 区间值划分，最后绘制菌落直径分布直方图。本实施例中，载有空白对照样的平板上的菌落 总数为104,载有测试样的平板的菌落总数为96。
[0041] (5)统计载有空白对照样的平板上菌落直径小于1. 8mm的菌落数m，然后统计出载 有测试样的平板上菌落直径小于1. 8mm的菌落数n，则脉冲电场处理中产生的亚致死酵母 数为m-n ;设载有空白对照样的平板菌落总数为N，则脉冲电场处理中的死酵母的数量比例 为（m_n)/N。
[0042] 本实施例得到的载有空白对照样的平板上的菌落直径分布直方图见图1 ;载有测 试样的平板的菌落直径分布直方图见图2。由图1?2可知，经脉冲电场处理后，84. 38%左 右的菌落直径小于1. 8mm (即96*84. 38%= 81个），而未处理样品中有27. 88 %的菌落直径 小于1. 8mm(即104*27. 88% = 29个），故由于脉冲电场处理而产生的亚致死酵母菌落数为 52 (比例为52/104 = 50% )。也就是说直方分布图的结论是：经过该脉冲电场条件处理后 获得50%的亚致死酵母，这与采用流式细胞仪结合荧光染色技术得出的亚致死率53%非 常接近，所以该方法能快捷、较准确地检测出脉冲电场处理后的亚致死酵母数量。
[0043] 实施例2
[0044] 本实施例的基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方法，包括以下步 骤：
[0045] (1)将酵母细胞溶液分为两份，对其中一份进行脉冲电场处理，得到测试样，另一 份作为空白对照样；
[0046] 本实施例的酵母细胞溶液的制备过程如下：准确称取0. 50g maurivin TM系列的 葡萄酒活性干酵母，加入到200mL糖水溶液（白砂糖与蒸馏水的固液比为2% )中，36°C保 温30min，期间不断搅拌均匀，让活性干酵母充分复水活化。酵母活化液在4000rpm离心 10min，离心室温度为2°C，弃上清，收集细胞沉淀。在无菌操作台上将收集的细胞沉淀重悬 于200mL含0. 024%氯化钠的无菌盐水中，即得细胞重悬液。
[0047] 本实施例所述脉冲电场处理，具体为：利用华南理工大学轻工与食品学院自行设 计研制的高压脉冲电场处理系统对重悬的酵母细胞液进行处理。处理前，先用75%乙醇溶 液对处理室和管路等进行清洗消毒，再用无菌水清洗去除残留的乙醇溶液。脉冲电场处理 参数条件设置为：频率1000Hz，脉宽40 μ s，场强30kV/cm，流速40mL/min，处理1次，处理完 后将处理液静置冷却至室温，得到酿酒酵母细胞电场处理液，即本实施例的测试样；
[0048] ⑵对测试样和空白对照样分别进行10倍梯度稀释，分别得到测试样的合适稀释 度的稀释液和空白对照样的合适稀释度的稀释液；
[0049] (3)将测试样的合适稀释度的稀释液和空白对照样的合适稀释度的稀释液用酵母 的富集培养基进行倾注平板，并在酵母的最适生长条件下培养；
[0050] 本实施例的酵母的富集培养基为麦芽汁营养琼脂培养基，内含微量的氯霉素等细 菌抑制剂，适合亚致死损伤细胞快速恢复其活性，缩短其迟滞期；
[0051] 所述酵母的最适生长条件为：培养温度30°C，培养时间30小时。
[0052] (4)待培养结束后，用500万像素以上的数码相机给菌落数为30-300的平板拍照， 并用图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，绘制菌落直径分布直方图，得出 每个平板上的菌落总数和每个菌落的直径；
[0053] 本实施例所述用图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，具体过程 为：
[0054] 打开Image-Pro Plus分析软件，读入数码照片，选择Biological模式，选取Count Small Cells方式计算每张数码照片的菌落总数和每个菌落的直径，根据菌落直径大小的 区间值划分，最后绘制菌落直径分布直方图。本实施例中，载有空白对照样的平板上的菌落 总数为104,载有测试样的平板的菌落总数为49。
[0055] (5)统计载有空白对照样的平板上菌落直径小于1. 8mm的菌落数m，然后统计出载 有测试样的平板上菌落直径小于1. 8mm的菌落数n，则脉冲电场处理中产生的亚致死酵母 数为m-n ;设载有空白对照样的平板菌落总数为N，则脉冲电场处理中的死酵母的数量比例 为（m_n)/N。
[0056] 本实施例得到的载有空白对照样的平板上的菌落直径分布直方图见图3 ;载有测 试样的平板的菌落直径分布直方图见图4。由图3?4可知，经脉冲电场处理后，61. 22% 左右的菌落直径小于1.8mm(即49*61. 22%= 30个），而未处理样品中有27. 88%的菌落 直径小于1. 8mm(即104*27. 88% = 29个），故由于脉冲电场处理而产生的亚致死酵母菌落 数为1 (比例为1/104 = 0. 96% )。也就是说直方分布图的结论是：经过该脉冲电场条件 处理后获得〇. 96%的亚致死酵母，这与采用流式细胞仪结合荧光染色技术得出的亚致死率 1.70%非常接近，这也说明该检测方法能快捷、较准确地检测出PEF处理后的亚致死酵母 数量。
[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 将酵母细胞溶液分为两份，对其中一份进行脉冲电场处理，得到测试样，另一份作 为空白对照样； (2) 对测试样和空白对照样分别进行梯度稀释，分别得到测试样的合适稀释度的稀释 液和空白对照样的合适稀释度的稀释液； (3) 将测试样的合适稀释度的稀释液和空白对照样的合适稀释度的稀释液用酵母的富 集培养基进行倾注平板，并在酵母的最适生长条件下培养； (4) 待培养结束后，用500万像素以上的数码相机给菌落数为30-300的平板拍照，并用 图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，得出每个平板上的菌落总数和每个菌 落的直径； (5) 统计载有空白对照样的平板上菌落直径小于1.8mm的菌落数m，然后统计出载有 测试样的平板上菌落直径小于1. 8mm的菌落数n，则脉冲电场处理中产生的亚致死酵母数 为m-n ;设载有空白对照样的平板菌落总数为N，则脉冲电场处理中的死酵母的数量比例为 (m_n)/N〇
2. 根据权利要求1所述的一种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方 法，其特征在于，步骤（3)所述酵母的富集培养基为内含细菌抑制剂的麦芽汁营养琼脂培 养基。
3. 根据权利要求1所述的一种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方 法，其特征在于，步骤（3)所述酵母的最适生长条件为： 培养温度28?30°C，培养时间30?40小时。
4. 根据权利要求1所述的一种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测方 法，其特征在于，步骤（4)所述用图像分析软件Image-Pro Plus分析得到的数码照片，具体 过程为： 打开Image-Pro Plus分析软件，读入数码照片，选择Biological模式，选取Count Small Cells方式计算每张数码照片的菌落总数和每个菌落的直径，根据菌落直径大小的 区间值划分，最后绘制菌落直径分布直方图。
5. 根据权利要求1所述的一种基于图像分析的脉冲电场作用下亚致死酵母的检测 方法，其特征在于，所述的脉冲电场处理具体为：在场强5?30kV/cm，脉宽40 μ m，频率 1000Hz，流速为40?60mL/min条件下处理1次。
【文档编号】C12Q1/04GK104087650SQ201410301046
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】曾新安, 王满生, 孙大文, 韩忠, 刘志伟 申请人:华南理工大学