一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌及构建方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌及构建方法及用途，方法为：将E.coli?JM109的sdaA基因的启动子和核糖体结合位点序列置换为组成型启动子trc及RBS5；将设计的核糖体结合位点分别与基因pgk、serA、serB、serC连接成片段，与含启动子的转录调控序列Trc-162组成操纵子PSer，整合到基因组serC基因58bp位点；进而在编码丙酮酸脱氢酶复合体aceEF操纵子基因上游48bp插入转录调控序列Trc-162，构建工程菌株SD06。本发明所构建的菌遗传背景清晰，更有效获取乙酰辅酶A，在基本盐培养基中以葡萄糖为底物时聚三羟基丁酸酯的产量提高到野生菌的2.66倍。
【专利说明】一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌及构建方法及用 途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一株产聚3-羟基丁酸酯的重 组大肠杆菌及构建方法及用途。
【背景技术】
[0002] 聚羟基脂肪酸酯（PHA)是一类广泛存在于微生物细胞内的高分子生物聚酯，作为 碳源和能源的储备，具有完全的生物相容性及生物可降解性，具有部分替代石油化工产品 的潜力。而聚-3-羟基丁酸酯（PHB)是其中一种得到最普遍研究的一类短链单体聚合物， 在很多领域有着广泛的应用前景。PHB具有不溶于水，防潮，光学纯度高以及良好的氧渗透 性等优点。
[0003] 大多数天然的 PHB 生产菌（包括 Ralstonia eutropha, Pseudomonas putida，Aeromonas hydrophila等）中，PHB的合成由三个连续的酶促反应步骤组成，首先 由β -酮基硫解酶PhaA催化2个乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A，进而在NADPH依赖 型乙酰乙酰辅酶A还原酶PhaB的催化下还原为（R)-3-羟基丁酰辅酶A，最后由PHA合酶 PhaC催化其聚合成PHB。大肠杆菌作为工业生物技术研究最广泛的微生物，本身并不具备 PHB的合成途径。但当引入异源PHB合成途径后，重组大肠杆菌由于生长快速，可利用多种 廉价碳源和具有完全清晰的遗传操作体系，已作为一种良好的PHB生产菌被得到广泛的应 用。且大肠杆菌不具备PHA降解酶，聚酯的积累水平较高，易破壁，有利于产品的分离提纯。
[0004] 目前，利用基因工程方法对产PHB大肠杆菌的改造策略主要包括增加 PHB合成前 体乙酰辅酶A和辅因子NADPH在胞内的富集度以及优化PHB的合成途径。针对通过增加乙 酰辅酶A的胞内富集度来提高大肠杆菌PHB生产力的基因工程改造主要集中于改造糖酵解 途径及减少乙酰辅酶A衍生的副产物以及竞争途径的表达。
[0005] 大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较 深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及 合成生物学的合理设计来改进菌种。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株产聚-3-羟基丁酸酯的重组大肠 杆菌。
[0007] 本发明的第二个目的是提供的一株产聚-3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌构建方 法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供一株产聚-3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌的用途。
[0009] -株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
[0010] ⑴设计以SEQ ID NO. 1所示的代号为RBS5的核糖体结合位点，将Escherichia coli JM109的sdaA基因的启动子和核糖体结合位点序列置换为以SEQ ID NO. 33所示的组 成型启动子trc及RBS5,构建工程菌株SD01 ;
[0011] (2)设计以SEQ ID NO. 2所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO. 3所示的核 糖体结合位点RBS2、以SEQ ID N0. 4所示的核糖体结合位点RBS3和以SEQ ID N0. 5所示的 核糖体结合位点RBS4 ;
[0012] (3)将RBS1和SEQ ID N0. 36所示的基因 pgk编码序列连接成片段1、将RBS2和 SEQ ID N0. 37所示的基因 serA编码序列连接成片段2、将RBS3和SEQ ID N0. 38所示的基 因 serB编码序列连接成片段3、将RBS4和SEQ ID N0. 39所示的基因 serC编码序列连接成 片段4;
[0013] (4)将片段1、片段2、片段3和片段4通过重叠-延伸PCR融合为操纵子PSer，与 SEQ ID N0. 32所示的含启动子的转录调控序列Trc-162 -同整合到步骤（1)获得的工程菌 株SD01的基因组serC基因-58bp位点，得到工程菌株SD02 ;
[0014] (5)在菌株SD02的编码丙酮酸脱氢酶复合体aceEF操纵子基因上游48bp插入SEQ ID N0. 32所示序列，构建工程菌株SD06 ;
[0015] (6)将含有PHB合成途径基因的质粒pBHR68导入SD06,得到基因型为E. coli JM 109, Ptrc-RBS5-sdaA, Trc-162-RBSl-pgk-RBS2-serA-RBS3-serB-RBS4-serC, Trc-162-ace EF, pBHR68, amp'简称为含pBHR68E. coli SD06的产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。
[0016] 上述方法构建的一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。
[0017] 上述一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌在发酵生产聚3-羟基丁酸酯的用 途。
[0018] 本发明的优点：
[0019] 本发明所构建的产聚-3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌，菌株遗传背景清析，且整 条代谢途径均在基因组上进行构建，发酵过程中相关基因得以稳定表达，构建的丝氨酸脱 氨途径是与EMP途径并行的丙酮酸获得途径，构建并激活该途径后可更有效地获取丙酮 酸，在丙酮酸脱氢酶复合体作用下高效获取PHB的前体物乙酰辅酶A，基本盐培养基葡萄糖 为底物的摇瓶的发酵结果达到5g/L以上，提高到野生菌的2. 66倍。这为后续发酵罐连续 补料提高PHB的产量和产率奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为基因操作祀点。
[0021] 图2为丝氨酸合成通路中各个基因的构建。
[0022] 图3为丝氨酸合成操纵子PSer。
[0023] 图4为sdaA基因操作电泳验证图谱。
[0024] 图 5 为 pBluescript SK(_)图谱。
[0025] 图 6 为 pBHR68 图谱。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员 能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
[0027] 本发明所用到的原始菌株E. coli JM109来源为从TransRen公司购买（http:// www. transgen, com/) 〇
[0028] 本发明所用到的原始菌株Corynebacterium glutamicum ATCC13032来源为 American Type Culture Collection(ATCC)(http://www. atcc. org/)〇
[0029] 本发明所用到的原始菌株Ralstonia eutropha H16来源为American Type Culture Collection (ATCC)(http: //www. atcc. org/) 〇
[0030] 原始质粒 pTKRED 和 pTKS/CS 来源为 Addgene (Addgene，https://www. addgene. org/) 〇
[0031] 所用其他生化试剂从生工生物工程（上海）股份有限公司购买(http://www. sangon. com/)。
[0032] 图1为基因操作靶点，其中PDH表示丙酮酸脱氢酶复合体，其编码基因包括aceEF 和 lpd。
[0033] 实施例lsdaA基因上游+123bp到-636bp之间序列的置换
[0034] 具体操作如下：
[0035] 利用 sdaAp U_F(SEQ ID NO. 6)、sdaAp U_R(SEQ ID N0. 7)和 sdaAp L_F(SEQ ID NO. 10)、sdaAp L_R(SEQ ID NO. 11)两对引物，以E. coli JM109的基因组为模版，使用 KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为349bp和314bp的上下游同源臂sdaAp-U 和sdaAp-L。利用sdaApT_F(SEQIDN0·8)、Tl(SEQIDN0·26)和T2(SEQIDN0·27)、 sdaAp T_R(SEQ ID NO. 9)以质粒pTKS/CS为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分 别得到大小为875bp和1113bp的四环素上下游片段sdaAp-ΤΙ和sdaAp-T2。经切胶回收 后利用引物 sdaAp U_F(SEQ ID N0.6)、T1(SEQ ID N0.26)和 T2(SEQ ID N0.27)、sdaAp L_ R(SEQ ID NO. 11)，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上游同源 臂和四环素上游及四环素下游和下游同源臂的拼接产物sdaAp-UT，sdaAp-TL，大小分别为 1191bp和1397bp。以上两个片段经切胶回收后利用引物sdaAp U_F(SEQ ID NO. 6)、sdaAp L_R(SEQ ID NO. 11)，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到大小为 2010bp (图4)上下游同源臂、四环素及组成型启动子trc (SEQ ID N0. 33所示）和RBS5序 列（SEQ ID NO. 1 所示）的 PCR 片段 SdaAp-tet。
[0036] 将质粒pTKRED转入Ε· coli JM109菌株中并制作成电转感受态；将片段sdaAp-tet 转入电转感受态，用四环素筛选阳性克隆，并用菌落PCR验证。四环素抗性基因通过诱导 归巢核酸内切酶I-Scel的表达将其删掉，并用菌落PCR验证，片段大小为662bp (图4)，从 而得到代谢工程菌株SD01。
[0037] 实施例2
[0038] 设计以SEQ ID N0. 2所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID N0. 3所示的核糖体 结合位点RBS2、以SEQ ID N0. 4所示的核糖体结合位点RBS3和以SEQ ID N0. 5所示的核糖 体结合位点RBS4。
[0039] 实施例3
[0040] 利用扩增引物 pgk-F(SEQ ID NO. 16)/pgk-R(SEQ ID N0. 17)以大肠杆菌 JM109 基 因组为模板，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶，将人工设计的核糖体结合位点RBS1及糖 酵解途径上pgk基因编码序列（SEQ ID N0. 36所示，NCBI ID:947414)扩增出来，得到片段 1 (见图2)。（其中引物pgk-F(SEQ ID N0. 16)中含有RBS1序列）
[0041] 利用扩增引物 serA-F(SEQ ID NO. 18)/serA-R(SEQ ID NO. 19)以谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 基因组为模板，使用 KOD-plus 高保真 DNA 聚合 酶，将人工设计的核糖体结合位点RBS2及丝氨酸合成代谢通路上serA基因编码序列（SEQ IDN0.37所示，NCBIID :3345035)扩增出来，得到片段2(见图2)。（其中引物serA-F(SEQ ID NO. 18)中含有RBS2序列）
[0042] 利用扩增引物 serB-F(SEQ ID NO. 20)/serB-R(SEQ ID NO. 21)以大肠杆菌 JM109 基因组为模板，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶，将人工设计的核糖体结合位点RBS3及丝 氨酸合成代谢通路上serB基因编码序列（SEQ ID N0. 38所示，NCBI ID:948913)扩增出来， 得到片段3(见图2)。（其中引物serB-F(SEQ ID N0. 20)中含有RBS3序列）
[0043] 利用扩增引物 serC-F(SEQ ID NO. 22)/serC-R(SEQ ID Ν0· 23)以大肠杆菌 JM109 基因组为模板，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶，将人工设计的核糖体结合位点RBS4及丝 氨酸合成代谢通路上serC基因编码序列（SEQ ID N0. 39所示，NCBI ID:945527)扩增出来， 得到片段4(见图2)。（其中引物serC-F(SEQ ID N0. 22)中含有RBS4序列）
[0044] 实施例4
[0045] 利用扩增引物 pgk-F(SEQ ID NO. 16)/serC-R(SEQ ID N0. 23)，以实施例 3 获得的 片段1、片段2、片段3和片段4为模板，通过重叠-延伸聚合酶链式反应将这4个基因以RB Sl-pgk-RBS2-serA A197-RBS3-serB-RBS4-serC的顺序拼接起来并命名该操纵子为PSer (见 图3)。
[0046] 实施例5 :基因组serC上游58bp位点插入PSer操纵子
[0047] 利用 ser U_F(SEQ ID N0. 14)、ser U_R(SEQ ID N0. 15)为引物，以 E. coli JM109 基因组为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增得到大小为574bp的上游同源臂 ser-U，操纵子 PSer 作为下游同源臂。利用 ser T_F(SEQ ID NO. 34)、T1(SEQ ID N0. 26)和 T2 (SEQ ID NO. 27)、ser T_R (SEQ ID NO. 35)以质粒 pTKS/CS 为模版，使用 KOD-plus 高保真 DNA聚合酶扩增分别得到大小为895bp和1159bp的四环素上下游片段ser-Tl和ser-T2。 经切胶回收后利用引物serU_F(SEQIDN0·14)、Tl(SEQIDN0·26)和T2(SEQIDN0·27)、 serC_R (SEQ ID NO. 23)，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上 游同源臂和四环素上游及四环素下游和下游同源臂的拼接产物ser-UT，ser-TL，大小分别 为1430bp和5569bp。经切胶回收后利用引物ser U_F、serC_R，同样使用KOD-plus高保真 DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到大小为6421bp上下游同源臂、四环素、Trc-162 (SEQ ID NO. 32)转录调控序列及PSer操纵子的PCR片段ser-tet。
[0048] 将质粒pTKRED转入E. coli SD01菌株中并制作成电转感受态；将片段ser-tet转 入本步骤获得的电转感受态，用四环素筛选阳性克隆，并用菌落PCR验证，得到带四环素的 菌株E. coli SD02tet。四环素抗性基因通过诱导归巢核酸内切酶I-Scel的表达将其删掉， 并用菌落PCR验证，从而得到E. coli SD02菌株。
[0049] 实施例6 :将Trc-162转录调控序列插入到丙酮酸脱氢酶复合体编码基因 aceEF 基因上游48bp位点上
[0050] 利用 PaceEF U_F(SEQ ID NO. 28)、PaceEF U_R(SEQ ID N0. 29)和 PaceEF L_F(SEQ ID NO. 30)、PaceEF L_R(SEQ ID NO. 31)两对引物，以 E. coli JM109 的基因组为模版，使用 KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为415bp和272bp的上下游同源臂PaceEF-U 和 PaceEF-L。利用 Tet F(SEQ ID N0.12)、Tet R(SEQ ID 勵.13)为引物以菌株匕(：〇11 SD02tet基因组为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增得到大小为1551bp的四环素 片段tet。上下游同源臂和tet片段经切胶回收后利用引物PaceEF U_F(SEQ ID NO. 28)、 PaceEF L_R(SEQ ID NO. 31)，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得 到大小为2167bp上下游同源臂、四环素 PCR片段及转录调控序列Trc-162的PaceEF-tet。
[0051] 将质粒pTKRED转入E. coli SD02菌株中并制作成电转感受态；将上述步骤获得的 片段PaceEF-tet转入本步骤获得的电转感受态，用四环素筛选阳性克隆，并用菌落PCR验 证。四环素抗性基因通过诱导归巢核酸内切酶I-Scel的表达将其删掉，并用菌落PCR验 证，从而得到代谢工程菌株SD06菌株。
[0052] 实施例7 :导入PHB合成途径进行PHB分批摇瓶发酵
[0053] 利用引物 PHB-F(SEQ ID NO. 24)、PHB-R(SEQ ID N0. 25)，以真养产碱杆菌 (Ralstonia eutropha H16)的基因组为模板，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增得 到含PHB合成操纵子phaCAB操纵子的5271bp的片段，在Smal/EcoRI位点克隆到质粒 pBluescript SK(-)(见图5,购自Addgene)质粒经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到质 粒PBHR68 (见图6)，并将该质粒分别转入到上述构建的SD06大肠杆菌和野生株JM109中， 分别得到命名为SD06s和JM109s的产PHB的重组大肠杆菌。
[0054] 接种方式为：首先将菌株SD06s和对照菌株JM109s分别在LB固体平板上活化菌 株，在37°C过夜培养后，挑单菌落接种装有5mL LB培养基的试管，培养12小时，接种1 %到 50mL含10g/L葡萄糖、lg/L酵母抽提物的MS培养基作为种子瓶，培养12小时，接种到100mL 含20g/L葡萄糖（或木糖）、lg/L酵母抽提物的MS培养基，初始接种0D为0. 04。
[0055] 发酵条件为：将菌株SD06s和对照菌株JM109s分别在含有lg/L酵母抽提物的MS 培养基中（500mL锥形瓶装液量100mL，摇床转速220rpm)37°C培养48h。培养基中添加20g/ L葡萄糖时，SD06s菌能够积累4. 63g/L PHB，占细胞干重的69. 12%，对照菌株JM109s检 测到2. 08g/L PHB，占细胞干重的53. 96%。将菌株SD06s和对照菌株JM109s分别在含有 lg/L酵母抽提物以及20g/L葡萄糖的MS培养基中（500mL锥形瓶装液量100mL，摇床转速 220rpm) 37°C培养48h。培养基中添加20g/L木糖时，SD06s菌能够积累3. 90g/L PHB，占细 胞干重的69. 11 %，对照菌株JM109s检测到1. 79g/L PHB，占细胞干重的47. 5 %。
[0056] LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L的NaCl，调节pH至 7. 0,0· IMpa 压力下灭菌 20min。
[0057] LB固体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L的NaCl，调节pH至 7.0，加入质量分数2%的琼脂，0.说? &压力下灭菌2〇1^11。
[0058] MS 培养基配方：2. 0g/L(NH4)2S04,0. 4g/L MgS04 · 7Η20,9· 65g/L Na2HP04 · 12H20， 1.5g/L KH2P04,0 . 05g/L Fe (III) -NH4-citrate，0.02g/L CaCl2，以及 lmL/L微量元素溶液
[0059] 微量元素溶液配方：lOOmg/L ZnS04 · 7H20, 30mg/L MnCl2 · 4H20, 300mg/L H3B03， 200mg/L CoCl2.6H20,6.4mg/L CuS04,20mg/L NiCl2.6H20,30mg/L NaMo04*2H20 以及 0·5mol/LHCl。
[0060] MS培养基配置方法：先配置母液，称取10g(NH4)2S0jP 2g MgS04，加水定容至 200mL，储存于蓝盖瓶中，121°C高压蒸汽灭菌，成为组分I ;称取38. 27g似2即04和15g ΚΗ2Ρ04，加水定容至200mL，储存于蓝盖瓶中，121 °C高压蒸汽灭菌，成为组分II ;称取5g柠檬 酸铁铵和2g CaCl2 · 2H20,量取41. 7mL浓盐酸（12mol/L)加水定容至lOOOmL，储存于蓝盖 瓶中，成为组分ΠΙ ;取100mL组分III，90mL蒸馏水，121°C高压蒸汽灭菌后，加入10mL微 量元素溶液，并用NaOH调节PH至4. 5-5. 5。接种时，每100mL MS培养基包括2mL组分I、 2mL组分II、2mL组分IV、4mL500g/L葡萄糖水溶液、90mL灭菌蒸馏水（溶解有终浓度lg/L 的酵母抽提物）。
[0061] 细胞酯化及聚3-羟基丁酸酯气相色谱检测方法：取40-60mg冰干后的细胞于酯化 管中，向此酯化管中加入2ml酯化液（量取485ml无水甲醇，15Π 11981%浓硫酸，称取0. 5g苯 甲酸）和2ml氯仿，加橡胶塞和螺口帽密封，100摄氏度烘箱处理4小时。待酯化完毕，酯化 液冷却至室温，加 lml去离子水，混匀静置1小时，吸取下层澄清氯仿相进行气相检测。
[0062] 气相色谱升温程序：采用HP-5的气相毛细管柱，80°C保持2min ;30°C每分钟的升 温速度升温至140°C ;再以40°C每分钟的升温速度至250°C。
[0063] 从摇瓶发酵结果可以看出，本发明所构建的生产PHB的大肠杆菌菌株能够达到较 高的PHB积累量，具有很好的应用前景，且所得菌株可用于其它以乙酰辅酶A为前体物的产 品的生产。
【权利要求】
1. 一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤： (1) 设计以SEQ ID NO. 1所示的代号为RBS5的核糖体结合位点，将Escherichia coli JM109的sdaA基因的启动子和核糖体结合位点序列置换为以SEQ ID NO. 33所示的组成型 启动子trc及RBS5,构建工程菌株SD01 ; (2) 设计以SEQ ID NO. 2所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO. 3所示的核糖体 结合位点RBS2、以SEQ ID NO. 4所示的核糖体结合位点RBS3和以SEQ ID NO. 5所示的核糖 体结合位点RBS4 ; (3) 将RBS1和SEQ ID NO. 36所示的基因 pgk编码序列连接成片段1、将RBS2和SEQ ID NO. 37所示的基因 serA编码序列连接成片段2、将RBS3和SEQ ID NO. 38所示的基因 serB编码序列连接成片段3、将RBS4和SEQ ID NO. 39所示的基因 serC编码序列连接成片 段4; (4) 将片段1、片段2、片段3和片段4通过重叠-延伸PCR融合为操纵子PSer，与SEQ ID NO. 32所示的含启动子的转录调控序列Trc-162 -同整合到步骤（1)获得的工程菌株 SD01的基因组serC基因-58bp位点，得到工程菌株SD02 ; (5) 在菌株SD02的编码丙酮酸脱氢酶复合体aceEF操纵子基因上游48bp插入SEQ ID NO. 32所示序列，构建工程菌株SD06 ; (6) 将含有PHB合成途径基因的质粒pBHR68导入SD06,得到基因型为E. coli JM109， Ptrc-RBS5-sdaA, Trc-162-RBSl-pgk-RBS2-serA-RBS3-serB-RBS4-serC, Trc-162-aceEF, p BHR68, amp1，简称为含pBHR68E. coli SD06的产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。
2. 权利要求1的方法构建的一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。
3. 权利要求2的一株产聚3 -羟基丁酸酯的重组大肠杆菌在发酵生产聚3 -羟基丁酸 酯的用途。
【文档编号】C12N1/21GK104195158SQ201410310295
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】陈涛, 林振泉, 张妍, 刘巧洁, 王智文, 赵学明 申请人:天津大学