二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的快速分子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法：以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，分别采用敏感特异性引物对进行PCR扩增，如果采用敏感引物对扩增得到了177bp的扩增片段，而同时采用抗性引物对未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合敏感个体；如果采用抗性引物对得到了177bp的扩增产物，而同时采用敏感引物未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合抗性个体；如果采用敏感引物对和抗性引物对都分别获得了177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为基因杂合型。本发明根据条带的有无直接判别二斑叶螨个体（种群）对联苯菊酯是否产生了抗药性，该方法简便、快速，可实现二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的高通量检测。
【专利说明】二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的快速分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域，涉及二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的快速分子检测方法。
【背景技术】
[0002]二斑叶螨Tetranychus urticae属于蜘蛛纲蝶螨亚纲真螨目叶螨科,俗称红蜘蛛，是世界性的重要农业害螨，为害包括果树、蔬菜和棉花、小麦等多种重要农作物。叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片的背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时造成叶片干枯脱落，极大地影响作物的产量和品质。
[0003]由于叶螨体型微小、发生世代多、繁殖速度快、发育历期短的特点，该螨极易产生抗药性。二斑叶螨于20世纪80年代传入我国时就对多种农药已经产生了抗性，加之国内防治上主要依赖化学农药，这使得二斑叶螨的抗药性发展更加迅速，为害也日趋严重。
[0004]联苯菊酯作为一种菊酯类的杀虫杀螨剂，具有触杀、胃毒作用，杀虫谱广，因此应用广泛。联苯菊酯在我国的使用历史较长，大量、单一和连续使用，使二斑叶螨等各种害均产生了抗药性；各地区的用药情况存在差异，导致各地二斑叶螨对联苯菊酯的抗性也不同，有些地区联苯菊酯的抗性水平达到高抗到极高抗水平，但联苯菊酯仍然在被农户采用。为了更好地指导农民科学合理用药，就需要明确二斑叶螨对联苯菊酯的抗药性。然而，传统的叶螨抗药性监测采用玻片浸溃法、叶片浸溃法或喷雾法，但试虫微小操作技术不易掌握，且需要测试虫量很大(至少700头)，至少24小时后才能观察测试结果，通过与相对敏感品系的对比，才可知其对药剂的抗药性水平，因此耗费时间很长。
[0005]研究已经证明，害虫对菊酯类杀虫剂产生抗药性之后，拟除虫菊酯类杀虫剂作用于昆虫神经系统的钠离子通道，延长钠离子通道开放时间，引起重复后放。昆虫对该类杀虫剂最常见的抗药性机制之一是神经靶标的敏感性下降，即击倒抗性(Knock downresistance，简称为kdr)。目前已经在多种昆虫中发现了与击倒抗性有关的钠离子通道基因发生点突变的报道(Soderlund and Knipple, 2003 ;王利华和吴益东，2004 ；Dong, 2007 ；John and Kathleen, 2013)。二斑叶螨抗联苯菊酯抗性种群中首先发现了 Kdr基因的第III结构域中的α螺旋S6跨膜片段中，出现了 F1538I的点突变，与菊酯类杀虫剂的抗药性相关(Tsagkarakou et al., 2009),随后在朱砂叶螨T.cinnabarinus甲氰菊酯抗性品系中验证了该点突变的存在及其与菊酯类杀虫剂抗药性之间的相关关系(Xu et al.，2013);然而，田间叶螨种群是否存在该点突变尚需要对该基因进行克隆及序列测定及比对才能进行，耗时费力且成本较高；开发简便易操作、成本低的快速检测技术对于及时明确二斑叶螨对菊酯类杀虫剂的抗药性非常重要。
【发明内容】
[0006]本发明针对上述点突变，在获得室内相对敏感品系和田间抗药性品系的基础上，设计二斑叶螨抗性和敏感种群中包含该点突变位点的特异性片段，采用特异性等位基因PCR 扩增技术(PCR amplificat1n of specific alleles, PASA,也称 allele-specific PCR,AS-PCR)分别从抗性和敏感种群中扩增出特异性条带，根据条带的有无直接判别二斑叶螨个体(种群)对联苯菊酯是否产生了抗药性，本发明方法简便、快速，可实现二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的高通量检测。
[0007]本发明提供的技术方案是:一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法:
[0008]以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，分别采用敏感特异性引物对和抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果采用敏感引物对扩增得到了 177bp的扩增片段，而同时采用抗性引物对未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合敏感个体(SS);如果采用抗性引物对得到了 177bp的扩增产物，而同时采用敏感引物未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合抗性个体(RR);如果采用敏感引物对和抗性引物对都分别获得了 177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为基因杂合型；
[0009]其中敏感特异性引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；其中抗性特异性引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2所示。
[0010]本发明还提供另一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法:
[0011]以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，采用抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果获得了 177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为抗性个体，其中所述引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。
[0012]本发明还提供一种可用于二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的分子标记:该位点在二斑叶螨kdr全序列的开 放阅读框中的4614位核苷酸，其中由T突变为A，导致二斑叶螨对联苯菊酯产生抗药性。
[0013]同时，本发明还提供一种用于检测二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的引物，所述引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0014]本发明提供的两对特异引物组合及其检测方法能够快速有效地鉴定出二斑叶螨种群是否发生了钠离子通道(kdr)基因的F1538I的点突变，通过对二斑叶螨体内kdr基因突变的检测，从而判断二斑叶螨对于联苯菊酯的抗性发展程度，该方法具有快速、有效、灵敏度高、能够实现对大批样品的高通量检测等优点，对于监测二斑叶螨田间种群对联苯菊酯的抗性基因频率及抗药性发展动态、及时调整二斑叶螨的防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:特异性引物扩增抗性和敏感二斑叶螨种群的Kdr基因片段，其中，Marker:Marker I ;3个R泳道代表田间抗性种群；3个S泳道代表室内相对敏感种群；CK代表清水为模板的阴性对照。
[0016]图2抗性和敏感二斑叶螨中Kdr基因片段的核苷酸序列比对，其中，Rl — R3是抗性种群不同克隆的kdr扩增片段序列，S1- S3是敏感种群不同克隆的kdr扩增片段序列。
[0017]图3 二斑叶螨抗性和敏感种群中的突变位点监测，其中，M =Marker I ;1_8:二斑叶螨室内敏感种群，扩增引物对为kdr-SF+kdr-Rv ;9_16:二斑叶螨抗性种群，扩增引物对为kdr-RF+kdr-Rvo【具体实施方式】
[0018]以下结合实施例对本发明作进一步描述与说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0019]1.试虫、药剂和试剂
[0020]二斑叶螨室内种群由南京农业大学植物保护学院洪晓月教授馈赠，自2009年在室内人工气候箱内采用海绵叶盘法，由“碧丰”品种的无虫菜豆苗叶片作为寄主进行继代饲养，期间未接触任何杀虫剂，作为室内的相对敏感种群。饲养条件为26土 1°C，光周期为L:D=16h:8h。田间抗性种群分别采集自北京通县、海南三亚的草莓和西瓜寄主上，室内饲养一代后进行测定。
[0021]杀螨剂为10%联苯菊酯乳油，美国富美实(FMC)公司产品。
[0022]所用引物由上海英竣生物工程公司合成，序列测序由北京擎科生物工程有限公司进行。PCR扩增中使用的聚合酶为2XTaq 10 MASTER Mix (0.1U TaqE/ μ I)购自北京奥赛博科技发展有限公司。叶螨的基因组DNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。DNA标记为Markerll，购自天根生 化科技(北京)有限公司
[0023]2.叶螨雌成螨的生物测定
[0024]叶螨的室内毒力测定参照联合国粮农组织推荐的标准方法一玻片浸溃法(Slide-dipmethod) (FA0,1980)进行。将双面胶带剪成2~3cm长，贴在载玻片的一端，用镊子揭去双面胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上，不要粘住螨足、螨须和口器，每片胶带粘3行，每行大约粘15~20头叶螨。在温度为26± I°C、光周期16h:8h(L:D)、相对湿度60%的昆虫生化培养箱中放置4h后，用Olympus双目解剖镜观察，严格剔除死亡或不太活泼以及体位不合适的叶螨个体。各药剂在预备试验的基础上稀释5~7个浓度，将带螨玻片的一端浸入药液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。铺一层湿润纱布在白色瓷缸内，浸过药液的玻片放置于大瓷盘内，在瓷缸上面再覆盖一层湿润纱布，再盖上玻璃板以达到保湿的效果，且防止纱布下滑落入玻片上。以带螨玻片浸溃清水作为对照，每个处理重复3~4次。24h后用双目解剖镜检查结果，分别记录存活和死亡的叶螨数量。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡，对照处理死亡率在10%以下为有效试验。试验数据采用Probit软件(Fenget al., Pest Management Science, 2010，66 (3): 313-318.)进行处理，计算药剂的斜率、SE值、LC50值及其95%置信限等，计算各抗性种群的抗性倍数，结果如下表1。
[0025]表1 二斑叶螨敏感和抗性种群对联苯菊酯的敏感度测定结果
【权利要求】
1.一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法，其特征在于: 以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，分别采用敏感特异性引物对和抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果采用敏感引物对扩增得到了 177bp的扩增片段，而同时采用抗性引物对未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合敏感个体；如果采用抗性引物对得到了 177bp的扩增产物，而同时采用敏感引物未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合抗性个体；如果采用敏感引物对和抗性引物对都分别获得了 177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为基因杂合型； 其中敏感特异性引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；其中抗性特异性引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2所示。
2.—种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法，其特征在于: 以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，采用抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果获得了177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为抗性个体，其中所述引物对正反向引物分别如SEQ IDNO:1 和 SEQ IDNO:2 所示。
3.一种可用于二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的分子标记，其特征在于:该位点 在二斑叶螨kdr全序列的开放阅读框中的4614位核苷酸，其中由T突变为A，导致二斑叶螨对联苯菊酯产生抗药性。
4.一种用于检测二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的引物，其特征在于:所述引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104032028SQ201410310778
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】王少丽, 王玲, 张友军, 吴青君, 谢文, 徐宝云 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所